Introduction
Cell migration är mycket samordnat och avgörande för många fysiologiska processer såsom vävnadsutveckling, reparation och förnyelse, samt patologiska processer såsom cancer metastaser och åderförkalkning 1. En förståelse av cellmigration är särskilt relevant för nya behandlingsmetoder som används för att reparera skadade vävnader och behandla patologiska tillstånd, inklusive celltransplantationsteknik och artificiell vävnad ympning 2. Med tanke på den aktuella i rollen av mesenkymala stromaceller (MSC) vid medievävnadsreparation 3, kvantifiera migrations kapaciteten hos dessa celler med användning av en analys som är strikt kvantifierbara, anpassningsbar och kostnadseffektiv är av intresse. Viktigt, måste en sådan analys är tillräckligt känsligt för att detektera relativt små förändringar i cellulär migrations kapacitet efter skador. Nuvarande metoder för att kvantifiera cellmigration, inklusive skrap analyser, trans brunnar migrationsanalyser (Boyden chbärnsten), mikropinne arrayer, och cellzonen analyser har en rad begränsningar i reproducerbarhet, anpassningsbarhet, kvantifiering och kostnadseffektivitet 1,4,5. Den optimerade scratch analys som beskrivs här visar robusta resultat, mätbara och bildbaserade analysfunktioner, kostnadseffektivitet och anpassningsförmåga till andra program.
Skrap analyser har använts i multipla förmågan att bedöma cellmigration och -proliferation under olika experimentella förhållanden 5. Analysen innebär sådd de utsedda cellerna, odla dem att komplettera eller nära sammanflödet, och repa resulterande monoskiktet med en steril nål eller pipettspets 6. Analys oftast utförs genom att jämföra bredden av repan över multipla tidpunkter på slumpvis valda ställen 7-9. Trots sin framträdande användning är scratch analysen förvirrad av problem med reproducerbarhet och kvantifiering. Variabilitet igenerering av repan inte bara förändrar mikromiljön av cellerna, men kan också hämma cellmigration genom att skada plattans yta och den underliggande extracellulär-matris 5. Analyser ofta genomförs över 7 till 12 timmar, men för cellinjer visar långsammare migration och längre analystider blir proliferation en confounding variabel 7,10. Slutligen, kan åldrande celler som genereras av skrapa processen frigöra faktorer som stör den extracellulära signaler som krävs för att överbrygga klyftan i monolagret 1. Optimera scratch analys kräver skapandet av en konsekvent lucka som inte interfererar med ytegenskaper, vilket minimerar analystid längd, och förhindra oönskad celldöd under manipulation. Proppen baserad analys är en optimering av en cellzonen analys. Denna analys utnyttjar en propp placerad i mitten av brunnen som utesluter celltillväxt, men tillåter celler som skall pläteras runt den centrala zonen.För att bedöma migrering, är proppen avlägsnas, och den resulterande zonen tillhandahåller en yta för migrering inträffa. Emellertid är denna analys svåra att anpassa eller anpassa 10 och för vissa tillämpningar, kan denna teknik också vara kostnadseffektivt oöverkomliga.
Till skillnad från scratch analyser och deras derivat, trans-brunn migrationsanalyser (eller Boyden kammaranalyser) bedöma migration genom att kvantifiera antalet celler som rör sig från en kammare, genom en mikrofiltermembran, i en kammare som innehåller kemotaktiska medel 8,11, 12. Denna teknik har begränsad användbarhet för vidhäftande celler såsom MSC: er eftersom följande migration genom det porösa membranet, celler vidhäftar till membransidan exponeras för de kemotaktiska medel och kan vara svårt att exakt kvantifiera. Medan analysen kan undersöka några tredimensionella migrationsmönster, de begränsade celltyper som det är möjligt att exakt kvantifiera begränsa cellmigration dess användbarhet 10. Ett annat alternativ till skrap analyser använder en mikro-pelare matris, som mäter cellulär motilitet genom en tre-dimensionell rymd med hjälp av förmågan hos celler att deformeras och migrera in i matrisen som ett surrogat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerer härdade över en exakt form och behandlades med ozon och fibronektin ger en homogen och icke-nedbrytbart mikromiljö. Mikro pelare avstånd kan också varieras efter behov för att mäta förmågan hos cellerna att gå in i arrayen 4. Formen skapas genom djup reaktiv jonetsning av kiselskivor för att skapa en negativ version av den höga bildkvot matrisen 13. Svårt att skapa mikro pelaren arrayer, medan analysen förstärks genom sin anpassningsförmåga, förmåga att modellera tredimensionella migration och analyser genom direkt visualisering av migrerande celler, förhindrar ekonomiskt dess utbredda användning.
Den optimerade scratch analys som beskrivs i detta protokoll ger en effektiv, cost-effektiv metod för att framställa konsekventa repor som kan analyseras med hjälp av fritt tillgänglig programvara. I stället för enkla bredd mätningar som gjorts över repan före och efter cellmigration, programvaran gör det möjligt för användaren att bestämma den totala skrapområden före och efter migreringen. Denna utveckling begränsar frågan om att försöka avgöra var scratch mätningarna bredd bör vidtas, och om bredden på scratch är likformig utmed dess längd. Dessutom är noggrann optimering av cellantal, cellsammanflödet och typ samt graden av skadorna på cellerna diskuteras i syfte att ytterligare optimera analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: För denna studie, lung mesenkymala stromaceller (LR-MSC) från distala lungvävnad isolerades antingen baserat på deras uttryck av cellytemarkörer (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 hög, EpCAM neg) 14,15, med hjälp av explantatet out-tillväxt 16, eller med hjälp av enzymatisk nedbrytning 17. Vidhäftande LR-MSC: er odlades i DMEM med hög glukoshalt och ingen glutamin, 15% FBS, 1 x antibiotika / antimykotika, och 2 mM glutamin (hädanefter fullständigt medium) och inkuberades vid 37 ° C, 5% CO2. LR-MSC passerades 3-4 gånger för att säkerställa en population av celler med relativt homogena tillväxtegenskaper för analysen migration.
1. Förbereda en sammanhängande monoskikt
- För att ta bort MSCs från standard 100 mm odlingsskålar, tvätta cellerna med 10 ml av 37 ° C förvärmda PBS, aspirera PBS och tillsätt 4 ml trypsin (0,25%). Inkubera 3-5 min i en 37 ° C inkubator. Aspirera calnar till en konisk tub, tillsätt lika volym komplett medium och centrifugera vid 300 g under 5 min för att pelletera ned cellerna.
Obs: Längre inkubation i trypsin kan ändra cellytereceptorer och potentiellt påverka migration. - Aspirera media och återsuspendera cellerna i färska komplett media. Räkna celler, med undantag för döda celler med användning av trypanblått uteslutning och plattan 500 tusen mesenkymala stromaceller i 4 ml komplett medium på en 60 mm cellodlingsskål.
Obs! Beroende på källan av cellerna, kan tester vara nödvändigt att bestämma det optimala antalet celler som behövs. - Inkubera cellerna tills plattorna är 90% sammanflytande för optimal cellbindning och spridning, vanligen 48-72 timmar för MSC.
Obs: 100% konfluens rekommenderas inte, eftersom många förankringsberoende celler erfarenhet kontakthämning, som kan förändra deras migrations kapacitet. Plattor med mindre än 80% konfluens kommer att resultera i oanvändbara bilder eftersom bildanalysmjukvara tolkar gapetar mellan celler som en del av omkretsen av början (se figur 1D). - Efter att cellerna har nått 90% sammanflödet, skada cellerna som är lämpligt för applikationen. För att bedöma cellskador efter exponering för lösligt cigarettrök extrakt (CSE), generera 100% CSE genom att dra röken från en University of Kentucky forsknings cigarett (3R4F) genom 25 ml av komplett medium i en Biichner kolven under 2 min 18.
- Inkubera cellerna i 24 timmar i 4 ml 1-4% CSE utspätt i fullständigt medium. Efter inkubering tvättas cellerna två gånger med 4 ml varm steril PBS, innan man sätter i 4 ml färskt fullständigt medium.
Obs: Förstöra celler med höga koncentrationer av cigarettrök extrakt (> 5%) kan kraftigt minska konfluens.
2. Skapa Scratch
- I en steril miljö, ta bort locket från 60 mm plåt av skadade MSC, och lägga en rak kant (till exempel en steriliserad plastlinjal) across den övre kanten av plattan. Utan att ta bort media, använd en steril 200 l pipettspetsen styrs av den sterila rak kant för att göra en till fyra parallella repor över plattan ungefär 5 mm från varandra och 50 mm långa.
Obs: En rak kant minimerar mängden rotations anpassningar som krävs på plattan när den är på mikroskop scenen. Det är absolut nödvändigt att repor visas helt vertikalt (eller horisontell) på skärmen. Generera flera repor på en 60 mm platta förändrar inte mikromiljön på ett sätt som påverkar cellmigration (data ej visade), men kan vara en ersättning för andra celltyper. Användningen av mindre brunnar rekommenderas inte eftersom variationen av celler växer nära kanten av brunnen blir mer uttalad och kan påverka en enhetlig generation repor. - Aspirera media och tvätta försiktigt plattorna med 2 ml förvärmda komplett medium för att förhindra celler från att vidhäfta till centrum av repan, och för att avlägsna cells som har lossnat från repor. Ersätt med 4 ml färskt komplett medium.
- Med hjälp av en steril märkpenna, märka varje repa 1-4 på undersidan av plattan på plats som inte kommer att störa avbildning repor.
Obs: Det är viktigt att bilder från samma scratch jämförs före och efter migreringen, eftersom det kan finnas variationer i scratch bredd.
3. Med Inledande Bilder från Scratch
Obs: Om scratch analysen utförs på flera plattor, rekommenderas att initiala bilder av alla repor på en enda platta vidtas innan repor görs på nästa platta.
- Använd ett inverterat faskontrastmikroskop med en kamera för att generera bilderna som krävs för analys.
- Placera odlingsplattan på mikroskopet, och använd den låga målet effekt (10X) för att lokalisera scratch # 1. Om kondens på locket på odlingsplattan hindrar en tydlig image av cellerna, använd en uppvärmd scenografi till 37 ° C.
- Att hålla scratch helt horisontellt och i centrum av synfältet, få så många bilder som behövs för att omfatta 90% av repan längd. Få bilder av olika delar av repan med någon överlappning mellan bilderna.
Obs: ljusbrytning vid kanterna av odlingsskålen eller överexponerade bilder, vilket gör dem omöjliga att analysera. Därför ska du inte ta bilder från den första och sista 5% av repan längd. - Spara bilder från varje repa i en separat mapp.
- Upprepa steg 3,2-3,4 för repor 2, 3 och 4.
- Återgå tallrikar till inkubatorn omedelbart efter första avbildning. Låt celler migrera till 4-7 timmar.
Obs: 7 tim är optimal vid bedömningen MSC skadats med CSE. Inkubation celler under mer än 7 timmar rekommenderas inte eftersom celltillväxt kan fungera som en confounding variabel för cellmigration (se tillval not 8.2 nedan).
- Hämta ImageJ och installera sårläknings Tool plugin (se tabell Material / Equipment).
- Öppna bildfilen i ImageJ, klicka sedan på "Process" och "Hitta konturer" för att markera de celler som omger scratch för sårläknings verktyg för att beräkna scratch området (Figur 2B). Nästa, klicka på "Bild", "Justera", "Färg gräns" och i rullgardinsmenyn märkt "Threshold Color" ändra värdet till "B & W."
- I menyn "Color Threshold", justera både ljusstyrka tröskel reglagen tills optimal kontrast mellan noll och cell front uppnås. För att möjliggöra det största utbudet när man försöker skapa kontrast i bilden, flytta den nedre reglaget helt åt höger (helt svart bild), och sedan justera den övre reglaget för att generera maximal kontrast.
- Sakta justera toppen brightness reglaget från vänster till höger tills bilden visar rent konturen av repan (figur 2C). När kanterna av repan har identifierats, klickar du på "Fler Tools" i ImageJ verktygsfältet väljer "MRI_Wound_Healing_Tool" från rullgardinsmenyn, och tryck på knappen "m" (som visas i ImageJ verktygsfältet) för att markera scratch området och mata ut beräknade området i ett resultat pop-ut fönstret (figur 2D).
- Kopiera och klistra in alla siffror från resultatfönstret (Figur 2E) i ett Excel-ark. Se till att separera data från enskilda repor.
5. Med Slutliga Bilder från Scratch
- Efter att cellerna har migrerat (4-7 timmar), upprepa steg 3,2-3,4. Bild plattorna i samma ordning som de skrapat så att celler på varje platta har haft samma tid att migrera.
Obs: Cellerna kan avbildas vid multipla tidpunkter, beroende på deras sensitivitet till både temperatur och pH-förändringar. Alternativt kan levande cell imaging som används för att följa de celler i realtid när de flyttar.
6. Analysera Slutliga Scratch Bilder
- Upprepa steg 4,2-4,5 för slutlig skrapbilder.
7. Beräkning av Scratch området att kvantifiera Migration
- Beräkna medelvärdet för-migrerings område genom medelvärdesbildning av initialvärden för de respektive repor i området.
- Beräkna den totala mängden migration genom att subtrahera den slutliga migrationsområdet för varje bild, beräknad i steg 6, från den genomsnittliga pre-migrationsområdet (steg 7,1). Skapa en lista med värden för varje skrapa representerar förändringen i migrationsfrågor.
- Pool data från flera repor inom samma testgruppen (dvs alla tallrikar och alla repor på celler exponerade för 0% CSE). Använd en variansanalys-test för att analysera skillnaderna mellan experimentgrupperna.
- Om cellerna är långsamma att migreraoch kräver en längre inkubationstid efter repor (större än 10 till 12 timmar), utför en BrDU eller edu inkorporeringsanalys 19 för att bestämma huruvida celler genomgår någon spridning under den period vilken analysen migrationen sker. Välj en migrering analystiden för att undvika signifikant celltillväxt.
8. Valfritt
- För att bedöma om betydande cellåldrande sker som en följd av repor förfarandet, utför en åldrande associerad Beta-galaktosidas analys på en testplatta vid förutbestämda tidpunkter efter repor 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skrap analyserna presenteras här utfördes med användning av murina lung bosatta mesenkymala stromaceller (LR-MSC) och isolerades som refereras i protokollanteckningar. LR-MSC: er såddes vid en densitet av 500.000 celler i en 60 mm vävnadsodlingsskål, och fick växa till 90% sammanflytning i 48 timmar. För att generera skada, var 4% CSE (beskriven ovan) inkuberades med cellerna under 24 h efter den initiala ympningen perioden men innan scratch analysen. För varje analys, var repan genereras med användning av en 200 | j, l pipettspets. De första bilderna togs efter repan hade genererats, och alla lösa celler och skräp hade tvättats bort med komplett medium. Som visas i Figur 1A och B är lämpligt sammanflödet viktigt att se till att bildbehandlingsprogram korrekt kan identifiera gränserna för repan. Såsom visas i Figur 1C, celler inte är tillräckligt sammanflytande (antingen på grund av otillräckliga sådd densiteter, otillräcklig incubation tider, eller svåra skador), vilket kan resultera i repor med heterogena gränser som inte är lätt att skiljas av bildprogram (Figur 1D). Figur 2 visar bildtagning och analys. Figur 2A visar den ursprungliga bilden före analys. Figur 2b visar resultatet av "Hitta konturer" verktyg under menyn "Process" (steg 4,2) och figur 2C visar bilden efter justering av "Färg Threshold" skjutreglaget (steg 4.3). Figur 2D visar den slutliga analyserade bilden efter att ha kört MRI_Wound_Healing_Tool plugin (steg 4,4). Figur 2E visar pop-ut fönstret resultat, markera (röd ruta) De siffror som genereras. Representativa före och efter migrationsbilder visas i figur 3, med motsvarande skrapgränserna såsom definieras av bildprogram. Figur 4 graphically illustrerar den förändrade migrations kapacitet ses i LR-MSC efter skada med 4% CSE. I figur 4A och B, den genomsnittliga beräknade skrap områden (i pixlar) för var och en av 4 repor görs över en platta med LR-MSC vid 95% sammanflödet antingen före eller efter migreringen, med exponering mot antingen 0% CSE eller 4% CSE jämförs. Figur 4C jämför den beräknade genomsnittliga förändringen i scratch området (post-migrationsområdet subtraheras från pre-migrationsområdet) i LR-MSC exponerade för antingen 0% eller 4% CSE, visar mindre migration (lägre genomsnittlig förändring i scratch område ) efter exponering för 4% ASM.
Figur 1: Korrekt sammanflödet är avgörande för generering av den robusta reproducerbar scratch analys. (A) Murin LR-MSC vid 95% sammanflödet, lämplig för scrSE PÅ. (B) En framgångsrik repa vid 95% sammanflödet. (C) LR-MSC vid 70% sammanflödet, för låg för en lyckad början. (D) Bild förvärv på 70% sammanflödet kan ge falska gränser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bilderna visar bilden insamling och analys (A) Ursprunglig bild.. (B) Bild efter applicering av "Hitta konturer" verktyg under menyn "Process" (steg 4,2). (C) Bild efter justering av "Färg Threshold" skjutreglaget (steg 4,3). (D) Bild efter att ha kört MRI_Wound_Healing_Tool plugin (steg 4,4). (E) Resultat pop-up fönster markering (röd ruta) De siffror som genereras för varje område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bilderna från scratch analys jämföra kliade LR-MSC före och efter migration (A) representant originalbilden pre-migration.. (B) Sammanfattning av beräknad scratch område pre-migration. (C) representant originalbilden efter migration. (D) Sammanfattning av beräknad scratch område efter migration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
<img alt = "Bild 4" src = "/ filer / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
Figur 4: Representativa resultat från scratch analys jämföra kvantifiering av scratch området före och efter LR-MSC migration, och exponering för antingen 0% eller 4% CSE. (A) Grafisk representation av genomsnittliga beräknade scratch område (i pixlar) för var och en av 4 repor görs över en platta med LR-MSC vid 95% sammanflödet antingen före eller efter migreringen, med exponering mot 0% CSE, med data som presenteras som medelvärde och standardavvikelse. (B) Grafisk representation av genomsnittliga beräknade scratch område (i pixlar) för var och en av 4 repor görs över en platta med LR-MSC vid 95% sammanflödet antingen före eller efter migreringen, med exponering mot 4% CSE, med data som presenteras som medelvärde och standardavvikelse. (C) Jämförelse av beräknade genomsnittliga förändringen i scratch området (post-pre migration) i LR-MSC utsätts för antingen 0% eller 4% CSE, visar mindre migration (lägre genomsnittlig förändring i scratch område) efter exponering för 4% CSE, med data som presenteras som medelvärde och standardavvikelse, * P = 2,99 x 10 -8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en kvantitativt robust, standardiserad metod för att genomföra och analysera skrap analyser. Enkla skrap analyser används rutinmässigt inom många olika områden i studien att undersöka cellulära migration. Men traditionellt scratch analysen har saknat en standardiserad uppsättning upp och kvantifiering protokoll, vilket har lett till problem med reproducerbarhet 7,10. Många av de ändringar och optimeringar för att förbättra scratch analysen har minskat dessa frågor, däribland enskilda levande cell imaging, standardiserade stoppbaserade analyser, och tredimensionella mikro pelaren analyser 4,8,10. Emellertid kan dessa analyser vara svåra att anpassa eller anpassa 10 och för vissa tillämpningar, kan dessa tekniker också vara kostnadseffektivt oöverkomliga.
För att producera en standardiserad repa analysprotokoll, det finns flera viktiga steg i protokollet presenteras här som kräver specifik information om celler involved, och optimering av analys baserad på de relevanta cellulära egenskaper. I synnerhet är det viktigt att optimera antalet celler som behövs och den tid i odling krävs för att uppnå en enhetlig monoskikt vid 90-100% konfluens för analysen (steg 1,3 och Step 1,4). Med alltför få celler (mindre än 90% konfluenta), kommer cellerna inte bilda tillräcklig monoskikt. Detta kommer inte bara att påverka den cellulära mikromiljön, men det kommer också att påverka förmågan hos bildbehandlingsprogram för att korrekt identifiera kanterna på repan. Däremot kan för många celler i monolagret (100% konfluenta, eller staplade celler) väl leda till kontaktinhibition, och därför förändras flytt egenskaper hos cellerna. Vissa varianter av scratch analysprotokollet rekommenderar celltillväxten till 100% konfluens och anser inte denna potential begränsning för vissa kontaktkänsliga celler såsom MSC 8. Samma bekymmer bör tillämpas på graden av skada som är inflicted på cellerna (steg 1,5). Protokollet som beskrivs här är utformad för att bedöma förändringar i cellmigration efter skada genom exponering för lösligt cigarettrök på flyttkapacitets MSC, men denna analys kan vara lika användbar vid bedömningen av effekten av många olika typer av skador på cellmigration. Det är viktigt att den drabbade skadan är tillräcklig för att ge en statistisk skillnad mellan försöks- och kontrollgrupperna. Emellertid kan för mycket skada också leda till minskad cellsammanflödet, som återigen kan påverka förmågan av bildbehandlingsprogram för att korrekt identifiera kanterna på repan.
Både cellulärt åldrande och celltillväxt kan vara störande faktorer som falskeligen kan förändra resultaten av scratch analysen. Framför allt bör generering av scratch övervägas noga för att undvika svåra skador på omgivande celler som kan leda till åldrande. Repning med en plast pipettspets snarare än en hypodermic nål eller skalpell undviker överskott skador samtidigt bevara integriteten av odlingsplattans yta i migrationszonen och den extracellulära matrisen (steg 2,1). Dessutom måste den tid under vilken cell migration får ske övervägas noga för att undvika signifikant celltillväxt som confounding variabel (steg 3,7). För analys av LR-MSC migration, är 7 h optimal vid bedömningen celler som skadats med CSE. Inkubation celler under mer än 12 timmar i allmänhet rekommenderas inte, men det kanske inte gäller alla celltyper, särskilt de med mycket låga fördubbling priser. För att bedöma både cellulärt åldrande och cellproliferation, en kombination av senescens-associerade beta-galaktosidas och BrDU eller edu inkorporering kan utföras på cellerna vid slutet av analysen 19. Viktigt är tillgängliga för laborationer med begränsad teknisk kapacitet, som endast kräver en god kvalitet inverterat faskontrastmikroskop och kamera det protokoll som beskrivs här. Dereagens är billiga, och bildbehandlingsprogram är öppen källkod. Men för att garantera optimala resultat från denna analys, bland annat god reproducerbarhet och förmågan att utföra noggrann statistisk analys, noggrann optimering bör övervägas för varje ny celltyp eller experimentell skada scenario som görs.
Optimeringar som presenteras i denna IP-adress några av de begränsningar som finns i tidigare arbete att standardisera skrap analyser. Medan scratch analysprotokoll traditionellt ta skrapmätningar bredd från en ögonblicksbild av scratch 8,9, protokollet presenteras här använder mätningar i området från bilder tagna längs hela längden av grunden för att öka statistisk noggrannhet och att ta hänsyn till inkonsekvenser i bredd den initiala början. Baserat på upprepade tester (data visas ej), inte kan antas scratch bredd skall vara helt förenligt hela sin längd. Efter migration, kanter the scratch blivit mer heterogen, vilket gör det allt svårare att exakt beräkna en skråma bredd, och ytterligare kräva areaberäkningar. Detta protokoll använder MRI_Wound_Healing_Tool, en specialiserad datorprogram, för att minska subjektiviteten och öka samstämmigheten vid analys scratch området. Även om det är okänt om enkla bredd beräkningar kan ge resultat specifika nog att skilja mellan subtila skillnader i migration till följd av tidigare CSE eller annan skada, visar detta protokoll denna känslighet. Optimeringar som presenteras i detta protokoll förnya den gemensamma scratch analys för att ta itu med dessa begränsningar på ett ekonomiskt försvarbart sätt, att erbjuda möjligheter till anpassning och att tillhandahålla ytterligare tekniker för att visa känslighet och validera resultat.
Den optimerade kvantitativa scratch analys som beskrivs i detta protokoll är fortfarande begränsad genom att betrakta en cellpopulation, snarare än enskilda celler. Denna teknik assumes att cellpopulationen är relativt homogen, och att detta kommer att resultera i relativt homogena egenskaper migrations. Beroende på applikationen kan det vara mer relevant att beakta migration av enskilda celler i stället 8. Dessutom är repa analysprotokoll som beskrivs här beror på en population av celler som inte kommer att föröka snabbt nog för att förväxla analys av migrering under en 4-7 h period. Cellinjer som kan proliferera i stor utsträckning under denna korta tidsperiod skulle inte vara lämpliga för att analysera med denna teknik. Trots dessa begränsningar, har denna kvantitativa scratch analysprotokoll potentialen för användning i många olika applikationer. Till exempel kan en cellskada baserad analys optimeras och sedan för att bedöma förmågan hos särskilda behandlingar för att begränsa cellskada. Alternativt kan denna analys användas med cancercellinjer för att bedöma potentiella behandlingar för att begränsa migrationskapacitet, och därför metastatisk potential, of dessa celler. Detta optimerade scratch Analysen är också fortfarande begränsad av eventuella störningar i cellmikro som är oundvikliga i att generera scratch. Men genom att noggrant välja cellsammanflödet nivå, ökad apoptos och generering av ark av celler som delvis har separerade i utkanten av repan kan undvikas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
