Introduction
Cellemigration meget koordineret og afgørende for mange fysiologiske processer, såsom vævsudvikling, reparation og regenerering, samt patologiske processer, såsom cancer metastase og arteriosklerose 1. En forståelse af celle migration er særligt relevant for nye behandlingsformer, der anvendes til at reparere beskadigede væv og behandle patologiske tilstande, herunder celle transplantation teknologi og kunstig væv podning 2. I betragtning af den nuværende interesse i rollen som mesenkymale stromaceller (MSC'er) til at mediere vævsreparation 3, kvantificering af vandrende kapacitet i disse celler ved anvendelse af et assay, der er strengt kvantificerbar, tilpasningsdygtige og omkostningseffektiv er af interesse. Det er vigtigt, skal et sådant assay være tilstrækkelig følsom til at påvise relativt små ændringer i cellulære vandrende kapacitet efter skader. Nuværende metoder til kvantificering celle migration, herunder scratch assays, trans-brønds migration assays (Boyden chAmbers), micropillar arrays og celle udelukkelse zone analyser i besiddelse af en række begrænsninger i reproducerbarhed, customizability, kvantificering, og omkostningseffektivitet 1,4,5. Den optimerede scratch-analysen er beskrevet her demonstrerer robuste resultater, kvantificerbare og image-baserede analyse kapaciteter, omkostningseffektivitet og tilpasningsevne til andre applikationer.
Scratch assays er blevet anvendt i flere kapacitet til at vurdere cellemigration og proliferation under forskellige forsøgsbetingelser 5. Assayet indebærer podning de udpegede celler, dyrke dem til fuldstændig eller næsten konfluens, og skrabe den resulterende monolag med en steril nål eller pipettespids 6. Analyse er mest almindeligt udføres ved at sammenligne bredden af bunden over flere tidspunkter på tilfældigt udvalgte steder 7-9. På trods af sin fremtrædende brug, er bunden analysen forvirrede af problemer med reproducerbarhed og kvantificering. Variabilitet igeneration af bunden ikke kun ændrer mikromiljø af cellerne, men kan også hæmme cellemigration ved at beskadige pladens overflade og den underliggende ekstracellulære matrix 5. Analyser ofte gennemført over 7 til 12 timer, men for cellelinjer viser langsommere migration og længere assay gange, spredning bliver en confounding variabel 7,10. Endelig kan senescentceller genereret af skrabe proces frigive faktorer, der forstyrrer den ekstracellulære signalering kræves for at lukke hullet i monolag 1. Optimering af bunden analysen kræver oprettelsen af en sammenhængende hul, ikke interfererer med overfladeegenskaber, minimere assay tidslængde, og forhindre uønsket celledød under manipulation. Proppen baseret assay er en optimering af en celle udelukkelse zone assay. Dette assay anvender en prop placeret i midten af borehullet, der udelukker cellevækst, men tillader celler at være belagt rundt om den centrale udelukkelse zone.For at vurdere migration, proppen fjernes, og den resulterende udelukkelse zone tilvejebringer en overflade for migration at forekomme. Det er imidlertid vanskeligt at tilpasse eller tilpasse 10 dette assay, og for nogle anvendelser kan denne teknik også omkostningskrævende.
I modsætning til scratch assays og deres derivater, trans-brønd migration analyser (eller Boyden kammer analyser) vurdere migrationen ved at kvantificere antallet af celler, der bevæger sig fra det ene kammer, gennem en mikroporøs filter membran, ind i et kammer, der indeholder kemotaktiske agenter 8,11, 12. Denne teknik har begrænset anvendelighed til adhærente celler som MSC'er fordi det efter migration gennem den porøse membran, adhærerer til membranen side udsat for de kemotaktiske midler og kan være svært præcist at kvantificere. Mens assayet er i stand til at undersøge nogle tredimensionale migrationsmønstre, de begrænsede celletyper, for hvilke det er i stand til præcist at kvantificere cellemigration begrænser dets anvendelighed 10. Et andet alternativ til bunden assays anvender et mikro-søjle array, som måler cellulær motilitet gennem et tredimensionalt rum ved hjælp af cellernes evne til at deformeres og migrere ind i array som et surrogat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerer hærdet i en præcis form og behandlet med ozon og fibronectin frembringer en homogen og ikke-nedbrydelige mikromiljø. Afstand mikro-søjle kan også varieres efter behov for at måle cellernes evne til at komme ind i arrayet 4. Formen er skabt gennem dyb reaktiv ion ætsning af siliciumskiver til at skabe en negativ version af high-aspekt forholdet gruppe 13. Mens analysen styrkes af dets customizability, evne til at modellere tredimensionelle migration og analyse gennem direkte visualisering af migrerende celler, svært ved at skabe mikro-søjle arrays økonomisk hindrer dens udbredte anvendelse.
Den optimerede scratch-analysen er beskrevet i denne protokol giver en effektiv, cost-effektive fremgangsmåde til fremstilling af konsistente ridser, der kan analyseres ved frit tilgængeligt software. I stedet for simple bredde målinger foretaget på tværs af bunden før og efter celle migration, software gør det muligt for brugeren at bestemme det samlede scratch områder før og efter migrering. Denne avancement begrænser spørgsmålet om at forsøge at fastslå, hvor bunden af breddemålinger skal tages, og om bredden af bunden er ensartet langs dens længde. Desuden er omhyggelig optimering af celleantal, cellekonfluens og typen og graden af skade påført på cellerne diskuteret med henblik på yderligere at optimere analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Til denne undersøgelse, lunge mesenkymale stromaceller (LR-MSC'er) fra den distale lungevæv blev isoleret enten baseret på deres ekspression af celleoverflademarkører (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 høj, EpCAM neg) 14,15, ved hjælp af eksplantat out-vækst 16, eller ved hjælp af enzymatisk fordøjelse 17. Adhærerende LR-MSC'er dyrkedes i DMEM med høj glucose og ingen glutamin, 15% FBS, 1x antibiotisk / antimykotisk og 2 mM glutamin (herefter fuldstændige medier) og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO2. LR-MSC'er blev passeret 3-4 gange for at sikre en population af celler med relativt homogene vækstkarakteristika for migration assay.
1. Forberedelse af en konfluent monolag
- At frigøre MSC'er fra standard 100 mm dyrkningsskåle, vask celler med 10 ml 37 ° C forvarmet PBS, aspirere PBS, og der tilsættes 4 ml trypsin (0,25%). Inkuber 3-5 minutter i et 37 ° C inkubator. Aspirer calen i et konisk rør, tilsæt lige så stort volumen komplet medium og centrifugeres ved 300 g i 5 min for at pelletere ned cellerne.
Bemærk: Længere inkubering i trypsin kan ændre celleoverfladereceptorer og potentielt påvirke migration. - Aspirer medier og resuspender cellerne i frisk fuldstændigt medium. Tæl celler, bortset fra døde celler ved hjælp af trypanblåt-udelukkelse og pladen 500.000 mesenchymal stromaceller i 4 ml komplette medier på en 60 mm cellekultur skål.
Bemærk: Afhængigt af kilden af cellerne, kan test være nødvendigt at bestemme det optimale antal celler, der er nødvendige. - Cellerne inkuberes, indtil pladerne er 90% sammenflydende for optimal cellebinding og proliferation, sædvanligvis 48-72 timer for MSC'er.
Bemærk: 100% sammenløb anbefales ikke, da mange forankringsafhængige celler erfaring kontakt hæmning, som kan ændre deres vandrende kapacitet. Plader med mindre end 80% konfluens vil resultere i ubrugelige billeder fordi billedet analyse software vil fortolke huls mellem celler som en del af omkredsen af bunden (se figur 1D). - Efter at cellerne har nået 90% konfluens, beskadige cellerne som passende for anvendelsen. For at vurdere celleskader efter udsættelse for opløselig cigaretrøg ekstrakt (CSE), generere 100% CSE ved at trække røgen fra 1. University of Kentucky forskning cigaret (3R4F) gennem 25 ml komplet medier i en Büchner kolbe over 2 min 18.
- Inkubér cellerne i 24 timer i 4 ml 1-4% CSE fortyndet i komplette medier. Efter inkubation vaskes cellerne to gange med 4 ml varmt sterilt PBS, før udskiftning med 4 ml friske komplette medier.
Bemærk: Skadelige celler med høje koncentrationer af cigaretrøg ekstrakt (> 5%) kan nedsættes væsentligt konfluens.
2. Oprettelse af Scratch
- I et sterilt miljø, fjerne låget fra 60 mm plade af beskadigede MSC, og lægge en lige kant (for eksempel en steriliseret plast lineal) acRoss topkanten af pladen. Uden at fjerne mediet, skal du bruge en steril 200 gl pipettespids styret af den sterile straight-kant for at gøre en til fire parallelle ridser på tværs af pladen ca. 5 mm fra hinanden og 50 mm lange.
Bemærk: En lige kant minimerer mængden af roterende justeringer til pladen, når det er på mikroskop scenen. Det er bydende nødvendigt, at de ridser synes helt lodret (eller vandret) på skærmen. Dannelse af mange ridser på en 60 mm plade ændrer ikke mikromiljøet på en måde, der påvirker cellemigration (data ikke vist), men kan være en overvejelse for andre celletyper. Brugen af mindre brønde ikke anbefales, da variationen af celler vokser tæt på kanten af brønden bliver mere udtalt og kan påvirke en ensartet generation af ridser. - Aspirere medierne og forsigtigt vaske pladerne med 2 ml forvarmet komplette medier for at forhindre celler i at klæbe til midten af bunden, og til at fjerne cellers, der er blevet løsnet af ridser. Udskift med 4 ml frisk komplet medium.
- Anvendelse af en steril permanent markør, mærke hver bunden fra 1-4 på undersiden af pladen ved placering, der ikke vil forstyrre billeddannelse af ridser.
Bemærk: Det er vigtigt, at billeder fra samme scratch sammenlignes før og efter migrering, da der kan være variation i bunden bredde.
3. Under indledende Billeder af Scratch
Bemærk: Hvis bunden assayet udføres på flere plader, anbefales det, at de første billeder af alle ridser på en enkelt plade er taget før ridser foretages på den næste plade.
- Brug en omvendt fasekontrastmikroskop med et kamera til at generere billederne er nødvendige for analyse.
- Placer dyrkningspladerne på mikroskopet, og bruge lav effekt mål (10X) for at finde scratch # 1. Hvis kondens på låget af kulturen pladen hindrer en klar image af cellerne, skal du bruge en opvarmet fase sæt til 37 ° C.
- Holde bunden helt vandret og i midten af synsfeltet, opnå så mange billeder som nødvendigt til at omfatte 90% af bunden længde. Opnå billeder af forskellige dele af bunden med ingen overlapning mellem billeder.
Bemærk: brydning af lys ved kanterne af dyrkningsskålen overeksponerede billederne, hvilket gør det umuligt at analysere. Derfor skal du ikke tage billeder fra de første og sidste 5% af bunden længde. - Gem billeder fra hver ridse i en separat mappe.
- Gentag trin 3,2-3,4 for ridser 2, 3 og 4.
- Retur plader til inkubatoren umiddelbart efter den første billeddannelse. Lad celler migrere til 4-7 timer.
Bemærk: 7 timer er optimal, når de vurderer MSC'er beskadiget med CSE. Inkubere celler i mere end 7 timer anbefales ikke, da celleproliferation kan fungere som en confounding variabel for celle migration (se Valgfrit note 8.2 nedenfor).
- Hent ImageJ og installer den Sårheling Tool plugin (se tabellen Materialer / udstyr).
- Åbn billedfilen i ImageJ og klik på "processen" og "Find Edges" for at fremhæve de celler, der omgiver bunden for Sårheling Tool til at beregne ridse området (figur 2B). Næste, klik på "Image", "Adjust", "Color Threshold", og i rullemenuen mærket "Threshold Color" ændre værdien til "B & W".
- Inden for "Color Threshold" menuen, justeres både lysstyrke tærskel skydere indtil optimal kontrast mellem bunden og celle foran er opnået. At give mulighed for den største sortiment, når de forsøger at skabe kontrast i billedet, flyt den nederste skyderen helt til højre (helt sort billede), og derefter justere den øverste skyder til at generere maksimal kontrast.
- Langsomt justere øverste brightness skyderen fra venstre mod højre, indtil billedet rent viser konturen af bunden (figur 2C). Når kanterne af bunden er blevet identificeret, skal du klikke på "Flere Tools" i ImageJ værktøjslinjen, skal du vælge "MRI_Wound_Healing_Tool" fra rullemenuen, og tryk på knappen "m" (der vil blive vist i ImageJ værktøjslinjen) for at fremhæve scratch område og output den beregnede område i en resultater pop-out vinduet (figur 2D).
- Kopier og indsæt alle numre fra resultater vinduet (Figur 2E) i et Excel-regneark. Sørg for at adskille data fra de enkelte ridser.
5. Tager Endelige Billeder af Scratch
- Efter at cellerne har migreret (4-7 timer), skal du gentage trin 3,2-3,4. Billede pladerne i samme rækkefølge, de blev ridset, så celler på hver plade har haft lige tid til at migrere.
Bemærk: Cellerne kan afbildes på forskellige tidspunkter, afhængig af deres sensitivitet for både temperatur og pH-ændringer. Alternativt kan levende celler anvendes til at følge cellerne i realtid, når de trækker.
6. Analyse Afsluttende Skrab billeder
- Gentag trin 4,2-4,5 for endelige scratch billeder.
7. Beregning af Scratch-området at kvantificere Migration
- Beregn den gennemsnitlige pre-migration området ved midling begyndelsesområdet værdier af de respektive ridser.
- Beregn den samlede migration ved at trække den sidste indvandring område for hvert billede, beregnet i trin 6, fra gennemsnittet præ-migration område (trin 7.1). Generere en liste over værdier for hver bunden repræsenterer ændringen i migration.
- Samler data fra flere ridser i samme testgruppen (dvs. alle plader og alle ridser på celler udsat for 0% CSE). Brug en variansanalyse test til at analysere forskellene mellem eksperimentelle grupper.
- Hvis cellerne er langsomme til at migrereog kræver en længere inkubationstid efter ridser (større end 10-12 timer), udføre en BrDU eller edu inkorporering assay 19 at fastslå, om cellerne undergår nogen proliferation i den periode, hvor migrationen assay forekommer. Vælg en migration assay tid for at undgå betydelig celleproliferation.
8. Valgfrit
- For at vurdere om betydelig celleældning er opstået som følge af ridser procedure udføre en alderdom-associeret beta-galactosidase assay på en testplade ved forudbestemte tidspunkter efter skrabe 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De scratch analyser præsenteres her blev udført ved hjælp af murine lunge hjemmehørende mesenkymale stromale celler (LR-MSC'er), og isoleret som refereret i protokollen noter. LR-MSC'er blev podet ved en densitet på 500.000 celler i en 60 mm vævskulturskål og dyrket til 90% konfluens i 48 timer. For at generere skader, blev 4% CSE (beskrevet ovenfor) inkuberes med cellerne i 24 timer efter den første podning udløb, men inden bunden assay. For hvert assay blev bunden fremkommet ved en 200 pi pipettespids. Indledende billeder blev taget, efter at bunden var blevet genereret, og eventuelle løse celler og rester var blevet skyllet væk med komplet medier. Som vist i figur 1A og B, passende konfluens er vigtigt at sikre, at billedbehandlingssoftware korrekt kan identificere grænserne for bunden. Som vist i figur 1C, er cellerne ikke tilstrækkeligt sammenflydende (enten på grund af utilstrækkelige seeding tætheder, utilstrækkelig incubation gange, eller overdreven skade), hvilket kan resultere i ridser med heterogene grænser, der ikke let adskilles ved billedbehandlingssoftware (figur 1D). Figur 2 viser indsamling og analyse billedet. Figur 2A afbilder det oprindelige billede inden analyse. Figur 2B viser resultatet af "Find kanter" værktøj under "Process" menuen (trin 4.2) og figur 2C viser billedet efter justering af "Color Threshold" skyderen (trin 4.3). Figur 2D viser den endelige analyseret billedet efter at have kørt MRI_Wound_Healing_Tool plugin (trin 4.4). Figur 2E viser resultater pop-out-vinduet, fremhæver (rød boks) de tal, der genereres. Repræsentative før og efter migrering billeder er vist i figur 3, med tilsvarende scratch områdegrænser som defineret af imaging software. Figur 4 graphically illustrerer den ændrede vandrende kapacitet set i LR-MSC'er efter skade med 4% CSE. I figur 4A og B, den gennemsnitlige beregnede scratch områder (i pixel) for hver af 4 ridser lavet på tværs af en plade af LR-MSC'er ved 95% sammenløb enten før eller efter migrering, med eksponering til enten 0% CSE eller 4% CSE sammenlignes. figur 4C sammenligner den beregnede gennemsnitlige ændring i scratch-området (post-migration område trækkes fra præ-migration område) i LR-MSC udsat for enten 0% eller 4% CSE, demonstrerer mindre migration (lavere gennemsnitlig ændring i scratch område ) efter udsættelse for 4% CSE.
Figur 1: Korrekt konfluens er kritisk for dannelsen af den robuste reproducerbar bunden assay. (A) Murine LR-MSC'er ved 95% konfluens, egnet til scrSE. (B) En vellykket bunden ved 95% konfluens. (C) LR-MSC'er på 70% konfluens, for lav for en vellykket bunden. (D) billede erhvervelse ved 70% sammenløb kan producere falske grænser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder demonstrerer indsamling og analyse billede (A) Originalt billede.. (B) billede efter anvendelse af "Find Edges" værktøj under "Process" menuen (trin 4.2). (C) Billede efter justering af "Color Threshold" skyderen (trin 4.3). (D) Billede efter at have kørt MRI_Wound_Healing_Tool plugin (trin 4.4). (E) RESULTATER pop-up vindue fremhævning (rød boks) de tal, der er genereret for hvert område. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder fra bunden assay sammenligne ridset LR-MSC'er før og efter migrering (A) Repræsentant originale billede pre-migration.. (B) Oversigt over beregnede scratch område pre-migration. (C) Repræsentant originale billede post-migration. (D) Oversigt over beregnede scratch område post-migration. Klik her for at se en større version af dette tal.
<img alt = "Figur 4" src = "/ files / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
Figur 4: Repræsentative resultater fra bunden assay sammenligner kvantificering af scratch område før og efter LR-MSC migration, og udsættelse for enten 0% eller 4% CSE. (A) Grafisk fremstilling af gennemsnitlige beregnede scratch område (i pixel) for hver af 4 ridser lavet på tværs af en plade af LR-MSC'er ved 95% sammenløb enten før eller efter migrering, med udsættelse for 0% CSE, med data præsenteret som middelværdi og standardafvigelse. (B) Grafisk fremstilling af gennemsnitlige beregnede scratch område (i pixel) for hver af 4 ridser lavet på tværs af en plade af LR-MSC'er ved 95% sammenløb enten før eller efter migrering, med udsættelse for 4% CSE, med data præsenteret som middelværdi og standardafvigelse. (C) Sammenligning af beregnede gennemsnitlige ændring i scratch-området (post-pre migration) i LR-MSC'er udsat for enten 0% eller 4% CSE, demonstrerer mindre migration (lavere gennemsnitlig ændring i scratch område) efter udsættelse for 4% CSE, med data præsenteret som gennemsnit og standardafvigelse, * P = 2,99 x 10 -8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokol giver et kvantitativt robust, standardiseret metode til at udføre og analysere scratch analyser. Simple scratch analyser rutinemæssigt anvendes i mange forskellige områder af undersøgelsen for at undersøge cellulære migration. Men traditionelt scratch-analysen har manglet en standardiseret opsætning og kvantificering protokol, hvilket har ført til problemer med reproducerbarhed 7,10. Mange af de ændringer og optimeringer for at forbedre scratch-analysen har reduceret disse spørgsmål, herunder individuel live-cell imaging, standardiserede prop assays, og tredimensionelle mikro-søjle analyser 4,8,10. Imidlertid kan disse assays være vanskeligt at tilpasse eller tilpasse 10 og til visse anvendelser, kan disse teknikker også omkostningskrævende.
At producere en standardiseret ridse assayprotokol, er der flere kritiske trin i protokollen præsenteret her, der kræver specifikke oplysninger om celler involaba, og optimering af analysen bygger på de relevante cellulære karakteristika. Især er det vigtigt at optimere antallet af celler, der er nødvendige, og den tid i kultur nødvendig for at opnå en ensartet monolag ved 90-100% konfluens til assayet (Trin 1.3 og Step 1.4). Med for få celler (mindre end 90% sammenflydende), vil cellerne ikke danner en tilstrækkelig monolag. Ikke blot vil dette påvirke cellulære mikromiljø, men det vil også påvirke evnen af billedbehandlingssoftware til korrekt at identificere kanterne af bunden. I modsætning hertil kan for mange celler i monolaget (100% sammenflydende, eller stablede celler) meget vel resultere i kontakt inhibering, og dermed ændre den migrerende cellernes egenskaber. Nogle variationer af scratch assayprotokollen anbefale cellevækst til 100% sammenløb og ikke anser denne potentielle begrænsning for visse kontakt følsomme celler såsom MSC 8. De samme bekymringer bør anvendes til graden af skader, der er infliCTED på cellerne (Trin 1.5). Den her beskrevne protokol er designet til at vurdere ændringer i cellemigration efter skade ved eksponering for opløselig cigaretrøg på migrerende kapacitet MSC'erne, men denne analyse kunne være lige så nyttig i vurderingen af effekten af mange forskellige typer af skader på celle migration. Det er vigtigt, at de ramte tab er tilstrækkelig til at tilvejebringe en statistisk forskel mellem de eksperimentelle og kontrolgrupper. Dog kan for meget skade også resultere i reduceret cellekonfluens, som igen kan påvirke evnen af billedbehandlingssoftware til korrekt at identificere kanterne af bunden.
Både cellulære aldring og cellulær proliferation kan være forstyrrende faktorer, der fejlagtigt kan påvirke resultatet af bunden assay. Især bør den generation af bunden overvejes nøje for at undgå for stor skade på de omkringliggende celler, der kan resultere i ældning. At skrabe med en plastik pipettespids snarere end en hypodermic nål eller skalpel undgår overskydende skader samtidig bevare integriteten af kulturen pladeoverfladen i migration zone og den ekstracellulære matrix (trin 2.1). Desuden skal længden af den periode, hvor cellemigration tillades at forekomme overvejes nøje for at undgå betydelig celleproliferation som confounding variable (trin 3.7). Til analyse af LR-MSC migration, 7 timer er optimal, når de vurderer celler beskadiget med CSE. Inkubere celler i mere end 12 timer anbefales generelt ikke, men dette kan ikke gælde for alle celletyper, især dem med meget lave fordobling satser. For at vurdere både cellulære aldring og celleproliferation, en kombination af alderdom-associerede beta-galactosidase og BrDU eller edu inkorporering kan udføres på cellerne ved afslutningen af assayet 19. Vigtigt er det, protokollen beskrevet her er tilgængeligt for laboratorier med begrænset teknisk kapacitet, der kun kræver en god kvalitet omvendt fasekontrastmikroskop og kamera. Dereagenser er billig, og den billeddannende software er open source. Men for at sikre optimale resultater fra denne analyse, herunder god reproducerbarhed og evnen til at udføre stringent statistisk analyse, omhyggelig optimering bør overvejes for hver ny celletype eller eksperimentel beskadigelse scenario, forsøges.
Optimeringer præsenteres i denne protokol adresse nogle af de begrænsninger, der findes i tidligere arbejde gjort for at standardisere scratch analyser. Ud fra følgende betragtninger scratch assayprotokoller traditionelt tager ridse breddemålinger fra et øjebliksbillede af scratch 8,9, protokollen præsenteres her bruger området målinger fra billeder taget langs hele længden af bunden for at øge den statistiske strenghed og at tage hensyn til uoverensstemmelser i bredden af den oprindelige bunden. Baseret på gentagne test (data ikke vist), scratch bredde ikke kan antages at være i fuld overensstemmelse hele sin længde. Efter migration, kanterne af the ridse blevet mere heterogen, hvilket gør det mere og mere vanskeligt præcist at beregne en ridse bredde, og videre nødvendiggøre områdets beregninger. Denne protokol bruger MRI_Wound_Healing_Tool, en specialiseret computerprogram, for at reducere subjektivitet og øge sammenhængen, når man analyserer scratch område. Mens det er uvist, om simple bredde beregninger kunne give resultater specifikke nok til at skelne mellem små forskelle i migration på grund af forudgående CSE eller anden skadelig, denne protokol viser denne følsomhed. Optimeringer præsenteres i denne protokol forny den fælles scratch-analysen for at løse disse begrænsninger på en økonomisk gennemførlig måde, at tilbyde muligheder for tilpasning, og til at give yderligere teknikker til at demonstrere følsomhed og validere resultater.
Den optimerede kvantitative ridse assay er beskrevet i denne protokol er stadig begrænset ved at overveje en celle befolkning, i stedet for enkelte celler. Denne teknik assumes, at cellen befolkning er forholdsvis homogen, og at dette vil resultere i relativt homogene migration egenskaber. Afhængigt af programmet, kan det være mere relevant at overveje migrationen af de enkelte celler i stedet 8. Desuden scratch assayprotokollen beskrevet her er afhængig af en population af celler, der ikke prolifererer hurtigt nok til at forvirre analyse af migration over en 4-7 timers periode. Cellelinier, der kan formere udførligt under denne korte periode ville ikke være egnet til analyse ved hjælp af denne teknik. På trods af disse begrænsninger, denne kvantitative ridse assay-protokol har potentiale til brug i mange forskellige applikationer. For eksempel kan en cellebeskadigelse-baseret assay optimeres og derefter anvendt til at vurdere evnen af særlige behandlinger for at begrænse celleskader. Alternativt kan dette assay anvendes med cancercellelinier til vurdering af potentielle behandlinger til at begrænse vandrende kapacitet, og dermed metastatisk potentiale, of disse celler. Denne optimerede ridse analysen også stadig begrænset af eventuelle forstyrrelser til cellen mikromiljø, som er uundgåelige i at generere bunden. Imidlertid kan ved omhyggeligt at vælge cellekonfluens niveau, øget apoptose og dannelse af plader af celler, der er delvist adskilt på kanten af bunden undgås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
