Introduction
La migrazione cellulare è altamente coordinato e vitale in molti processi fisiologici quali lo sviluppo dei tessuti, la riparazione e la rigenerazione, nonché processi patologici quali metastasi del cancro e l'arteriosclerosi 1. Una comprensione della migrazione delle cellule è particolarmente rilevante per terapie emergenti utilizzati per riparare i tessuti danneggiati e il trattamento di condizioni patologiche, comprese le tecnologie di trapianto di cellule e tessuti artificiali di innesto 2. Dato l'attuale interesse per il ruolo delle cellule stromali mesenchimali (MSC) nella mediazione riparazione dei tessuti 3, quantificare la capacità migratoria di queste cellule utilizzando un metodo che è rigorosamente quantificabile, adattabile, e conveniente è di interesse. È importante sottolineare che un tale test deve essere sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti relativamente sottili cellulare capacità migratoria dopo un danno. Gli attuali metodi per quantificare la migrazione delle cellule, tra cui saggi e vinci, trans pozzetti test di migrazione (Boyden chambre), array micropillar, e saggi zona di esclusione cellulare in possesso di una serie di limitazioni nella riproducibilità, personalizzazione, la quantificazione, e costo-efficacia 1,4,5. Il test zero ottimizzata qui descritto dimostra esiti robuste capacità di analisi quantificabili e basati su immagini, costo-efficacia, e l'adattabilità ad altre applicazioni.
Scratch saggi sono stati utilizzati in molteplici capacità di valutare la migrazione cellulare e la proliferazione in diverse condizioni sperimentali 5. Il test prevede la semina le cellule designate, crescendo loro di completare o nei pressi di confluenza, e graffiare il monostrato risultante con un ago sterile o pipetta punta 6. Analisi è più comunemente effettuata confrontando la larghezza del graffio su più punti di tempo in luoghi selezionati casualmente 7-9. Nonostante il suo uso prominente, il dosaggio zero è confuso da problemi con la riproducibilità e la quantificazione. Variabilità ingenerazione del graffio non solo modificando il microambiente delle cellule, ma può anche impedire la migrazione delle cellule danneggiando la superficie sottostante piastra e extracellulare matrice 5. I saggi sono spesso condotti per 7-12 ore, ma per linee cellulari che mostrano una migrazione più lenta e tempi di analisi più lunghi, la proliferazione diventa una variabile confondente 7,10. Infine, le cellule senescenti generati dal processo di graffiare può rilasciare fattori che interferiscono con la segnalazione extracellulare necessaria per colmare il divario in monostrato 1. Ottimizzazione dosaggio zero richiede la creazione di un vuoto costante che non interferisce con le proprietà superficiali, minimizzando dosaggio lunghezza di tempo, e prevenire la morte delle cellule indesiderate durante la manipolazione. Il saggio basato tappo è una ottimizzazione di un saggio zona di esclusione cellule. Questo saggio utilizza un tappo posto al centro del pozzo che esclude la crescita cellulare, ma permette alle cellule di essere placcato intorno alla zona di esclusione centrale.Per valutare la migrazione, il tappo viene rimosso, e la zona di esclusione risultante fornisce una superficie per la migrazione a verificarsi. Tuttavia, questo test è difficile da personalizzare o adattare 10 e per alcune applicazioni, questa tecnica può anche essere costo proibitivo.
In contrasto con saggi graffiatura e loro derivati, saggi di migrazione trans-well (o camera di Boyden saggi) valutano la migrazione quantificando il numero di celle che si muovono da una camera, attraverso una membrana microporosa filtro, in una camera contenente agenti chemiotattici 8,11, 12. Questa tecnica ha limitato l'utilità di cellule aderenti come MSC perché dopo la migrazione attraverso la membrana porosa, le cellule aderiscono al lato della membrana esposta agli agenti chemiotattici, e può essere difficile da quantificare con precisione. Mentre il test è in grado di esaminare alcuni modelli di migrazione tridimensionali, i tipi di cellule ristrette per il quale è in grado di quantificare accuratamente limite migrazione cellulare sua utilità 10. Un'altra alternativa per saggi scratch utilizza una matrice di micro-pilastro, che misura la motilità cellulare attraverso uno spazio tridimensionale utilizzando la capacità delle cellule di deformarsi e migrare nella matrice come un surrogato. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeri curati su uno stampo preciso e trattati con ozono e fibronectina produce un microambiente omogeneo e non degradabile. Spaziatura Micro-pilastro può anche essere variata come necessario per misurare la capacità delle cellule di entrare nella matrice 4. Lo stampo viene creato attraverso profonda ioni reattivi di wafer di silicio per creare una versione negativa di alta con formato matrice 13. Mentre l'analisi è rafforzata dalla sua personalizzazione, capacità di modellare la migrazione tridimensionale, e l'analisi attraverso la visualizzazione diretta delle cellule migranti, difficoltà nella creazione di array di micro-pilastro ostacola economicamente la sua diffusione.
Il dosaggio zero ottimizzata descritto in questo protocollo offre un efficiente, cosMetodo t-efficace per produrre graffi coerenti che possono essere analizzati utilizzando il software liberamente disponibile. Invece di semplici misure di larghezza effettuate attraverso il graffio prima e dopo la migrazione delle cellule, il software permette all'utente di determinare le aree totali scratch prima e dopo la migrazione. Tale avanzamento limita il problema di cercare di determinare dove il graffio opportuno prendere le misure di larghezza, e se la larghezza del graffio è uniforme lungo la sua lunghezza. Inoltre, attenta ottimizzazione di numero di cellule, cellule confluenza e il tipo e grado di danno inflitto sulle cellule è discusso per ottimizzare ulteriormente il dosaggio.
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Protocol
Nota: Per questo studio, le cellule stromali mesenchimali del polmone (LR-MSC) dal tessuto polmonare distale sono stati isolati sia in base alla loro espressione di marcatori di superficie cellulare (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 alto, EpCAM neg) 14,15, utilizzando espianto fuori crescita del 16, o tramite digestione enzimatica 17. Aderente LR-MSC sono state coltivate in DMEM con elevato glucosio e non glutammina, 15% FBS, glutammina antibiotici / antimicotici, e 2 mM 1x (ormai completo media) e incubato a 37 ° C, 5% CO 2. LR-MSC sono stati diversi passaggi 3-4 volte per garantire una popolazione di cellule con caratteristiche di crescita relativamente omogenei per il saggio di migrazione.
1. Preparare un Confluent monostrato
- Per staccare MSC da 100 mm di piatti standard della cultura, lavare le cellule con 10 ml di 37 ° C PBS preriscaldata, aspirare il PBS e aggiungere 4 ml di tripsina (0,25%). Incubare 3-5 minuti a 37 ° C incubatore. Aspirare il cells in una provetta conica, aggiungere uguale volume di mezzi completi e centrifugare a 300 g per 5 min a pellet le cellule.
Nota: più lunga incubazione in tripsina può alterare i recettori di superficie delle cellule e potenzialmente influenzare la migrazione. - Aspirare i media e risospendere le cellule in mezzi freschi completo. Contare le cellule, escluse le cellule morte con trypan blue e piastra cellule stromali mesenchimali 500.000 in 4 ml di completo media su un piatto di coltura cellulare 60 mm.
Nota: A seconda della fonte delle cellule, possono essere necessari per determinare il numero ottimale di cellule necessarie. - Incubare le cellule fino a quando le piastre sono il 90% confluenti per il fissaggio cellulare ottimale e la proliferazione, di solito 48-72 ore per MSC.
Nota: 100% confluenza non è consigliabile, dato che molti di ancoraggio-dipendente contatto celle esperienza inibizione, che possono alterare la capacità migratoria. Piastre con meno del 80% di confluenza provocheranno foto inutilizzabili perché il software di analisi di immagine interpreterà gaps tra le cellule come parte del perimetro del graffio (vedi Figura 1D). - Dopo che le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza, danneggiare le cellule come appropriato per l'applicazione. Per valutare il danno cellulare dopo l'esposizione al fumo di sigaretta estratto solubile (CSE), generare il 100% CSE disegnando il fumo dal 1 Università del Kentucky sigaretta ricerche (3R4F) attraverso 25 ml di completo media in un pallone Büchner oltre 2 min 18.
- Incubare le cellule per 24 ore in 4 ml 1-4% CSE diluito in completo dei media. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 4 ml di PBS sterile calda, prima della sostituzione con 4 ml mezzi freschi completo.
Nota: le cellule distruttive ad alta concentrazione di estratto di fumo di sigaretta (> 5%) può ridurre in modo sostanziale confluenza.
2. Creazione Scratch
- In un ambiente sterile, togliere il coperchio dalla piastra 60 millimetri di MSC danneggiati, e laici un regolo (per esempio, un righello di plastica sterilizzata) across il bordo superiore della piastra. Senza rimuovere il supporto, utilizzare una sterile 200 microlitri pipetta punta guidata dal straight-edge sterili per fare uno a quattro graffi paralleli in tutto il piatto circa 5 mm di distanza e 50 mm di lunghezza.
Nota: Un regolo minimizza la quantità di rotazione necessari adeguamenti alla piastra quando è sul palco microscopio. È indispensabile che i graffi appaiono completamente verticale (o orizzontale) sullo schermo. Generazione multipli graffi su una piastra 60 mm non altera il microambiente in modo che colpisce la migrazione cellulare (dati non mostrati), ma può essere una considerazione per altri tipi di cellule. L'uso dei pozzi più piccoli non è raccomandato in quanto la variabilità delle cellule cresce vicino al bordo del pozzo diventa più pronunciato e può interessare generazione uniforme dei graffi. - Aspirare media e lavare delicatamente le piastre con 2 ml di mezzi completi pre-riscaldato per impedire cellule di aderire al centro del graffio, e per rimuovere cellules che sono stati allentato dal graffio. Sostituire con 4 ml di mezzi freschi completo.
- Utilizzando un pennarello indelebile sterile, etichettare ogni graffio da 1-4 sul lato inferiore della piastra in posizione che non interferiscono con le immagini dei graffi.
Nota: E 'importante che le immagini della stessa zero vengono confrontati prima e dopo la migrazione, poiché non vi può essere la variazione a larghezza zero.
3. Prendendo iniziali Immagini Scratch
Nota: Se il test scratch viene eseguita su piastre multiple, si raccomanda che siano prese immagini iniziali di tutti i graffi su un singolo piatto prima graffi sono effettuati sulla piastra successiva.
- Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito con una macchina per generare le immagini necessarie per l'analisi.
- Posizionare la piastra di coltura sul microscopio, e utilizzare l'obiettivo di bassa potenza (10X) per individuare zero # 1. Se la formazione di condensa sul coperchio della piastra di coltura sta impedendo una chiara image delle cellule, utilizzare un palcoscenico riscaldata a 37 ° C.
- Mantenendo il graffio completamente orizzontale e nel centro del campo di vista, ottenere più immagini come necessario comprenda 90% della lunghezza della graffiatura. Ottenere immagini di porzioni distinte della zero con alcuna sovrapposizione tra le immagini.
Nota: La rifrazione della luce ai bordi del piatto cultura sovraespone le immagini, rendendole impossibile analizzare. Pertanto, non prendere le immagini dal primo e l'ultimo 5% della lunghezza della zero. - Salvare le immagini da ogni zero in una cartella separata.
- Ripetere i passaggi 3,2-3,4 per graffi 2, 3, e 4.
- Piastre per l'incubatore restituire immediatamente dopo l'imaging iniziale. Lasciate che le cellule migrano per 4-7 ore.
Nota: 7 ore è ottimale quando si valuta MSC danneggiate con CSE. Incubando le cellule per più di 7 ore non è raccomandato perché la proliferazione cellulare può fungere da variabili di confondimento per la migrazione cellulare (vedi nota Opzionale 8.2 sotto).
- Scaricare ImageJ e installare il plugin di Wound Healing Tool (fare riferimento alla tabella dei materiali / attrezzature).
- Aprire il file di immagine in ImageJ, quindi fare clic su "Processo" e "Trova bordi" per evidenziare le cellule circostanti il graffio per la guarigione della ferita strumento per calcolare l'area zero (Figura 2B). Quindi, fai clic su "Immagine", "Regola", "Soglia colori" e nel menu a discesa con l'etichetta "Soglia colori" modificare il valore di "B & W".
- All'interno del menu "Soglia colori", regolare entrambi i cursori soglia di luminosità fino a raggiungere ottimale contrasto tra il graffio e la cella di fronte. Per consentire la massima gamma nel tentativo di creare contrasto nell'immagine, spostare completamente il cursore inferiore a destra (immagine completamente nera), e quindi regolare il cursore superiore per generare il massimo contrasto.
- Lentamente regolare la BRI superioreghtness cursore da sinistra verso destra fino a quando l'immagine viene visualizzata in modo pulito il contorno del graffio (Figura 2C). Una volta che sono stati identificati i bordi del graffio, fare clic su "Altre Strumenti" nella barra degli strumenti ImageJ, selezionare "MRI_Wound_Healing_Tool" dal menu a discesa, e premere il tasto "m" (che apparirà nella barra degli strumenti ImageJ) per evidenziare l'area scratch e l'uscita dell'area calcolata in un risultato finestra a comparsa (figura 2D).
- Copia e incolla tutti i numeri dalla finestra dei risultati (Figura 2E) in un foglio di calcolo Excel. Assicurati di separare i dati dai singoli graffi.
5. Prendendo finali Immagini Scratch
- Dopo che le cellule sono migrate (4-7 ore), ripetere i passaggi 3,2-3,4. Immagine le piastre nello stesso ordine in cui sono stati graffiato in modo che le cellule su ogni piatto hanno avuto uguale tempo di migrare.
Nota: Le celle possono essere esposte in più punti di tempo, a seconda della loro sensitività a cambiamenti di temperatura e di pH. In alternativa, l'imaging cellulare dal vivo può essere usato per seguire le cellule in tempo reale durante la loro migrazione.
6. Analisi finali Scratch Immagini
- Ripetere i passaggi 4,2-4,5 per le immagini e vinci finali.
7. calcolo dell'area Scratch per quantificare la migrazione
- Calcolare l'area di pre-migrazione media dalla media dei valori dell'area iniziali dei rispettivi graffi.
- Calcolare la quantità totale di migrazione sottraendo l'area di migrazione finale per ogni immagine, calcolata al punto 6, dalla zona di pre-migrazione media (passo 7,1). Generare un elenco di valori per ciascun zero rappresenta la variazione nella migrazione.
- Pool i dati da più graffi all'interno dello stesso gruppo di prova (vale a dire tutti i piatti e tutti i graffi sulle cellule esposte a 0% CSE). Utilizzare una analisi della varianza di test per analizzare le differenze tra i gruppi sperimentali.
- Se le cellule sono lenti a migraree richiedono un tempo di incubazione più lungo dopo graffi (maggiore di 10-12 ore), eseguono un BrDU o EdU incorporazione dosaggio 19 per determinare se le cellule stanno subendo qualsiasi proliferazione durante il periodo in cui il test di migrazione è in corso. Scegli un tempo saggio di migrazione per evitare significativa proliferazione cellulare.
8. Facoltativo
- Per valutare se significativo senescenza cellulare si verifica come risultato della procedura di graffi, eseguire una senescenza associata Beta-galattosidasi test su una piastra di prova in un momento predeterminato dopo graffi 19.
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Representative Results
I saggi e vinci qui presentati sono stati eseguiti utilizzando cellule mesenchimali stromali residenti polmone murini (LR-MSC) e isolate come riferito nelle note di protocollo. La LR-MSC sono state seminate ad una densità di 500.000 cellule in un piatto di coltura di tessuti 60 mm, e cresciuto a 90% di confluenza in 48 ore. Per generare danni, 4% CSE (descritto sopra) è stato incubato con le cellule per 24 ore dopo il periodo di semina iniziale, ma prima del dosaggio zero. Per ogni test, il graffio è stata generata utilizzando una punta di pipetta 200 l. Sono state scattate le immagini iniziali dopo il graffio era stata generata, e le cellule sciolti e detriti erano stati spazzati via con i media completi. Come mostrato in figura 1A e B, adeguato confluenza è importante garantire che il software di imaging può identificare correttamente i confini della graffiatura. Come mostrato nella Figura 1C, le cellule non sono sufficientemente confluenti (sia a causa della densità di semina inadeguate, inc inadeguatatempi ubation o danni eccessivi), che può portare a graffi con contorni eterogenei che non sono facilmente distinguono per il software di imaging (Figura 1D). La Figura 2 mostra l'acquisizione delle immagini e l'analisi. figura 2A illustra l'immagine originale prima dell'analisi. Figura 2b mostra il risultato della funzione "Trova bordi" sotto il menu "Azione" (Passo 4.2) e Figura 2C mostra l'immagine seguente regolazione della barra di scorrimento "Color Threshold" (punto 4.3). Figura 2D raffigura l'immagine finale analizzata dopo l'esecuzione della MRI_Wound_Healing_Tool plug (Passo 4.4). Figura 2E illustra la finestra dei risultati pop-out, evidenziando (scatola rossa) i numeri che vengono generati. Immagini pre rappresentante e post-migrazione sono mostrati nella Figura 3, con corrispondenti limiti dell'area scratch come definito dal software di imaging. Figura 4 gillustra raphically la capacità migratoria alterato visto in LR-MSC dopo i danni con il 4% CSE. In Figura 4A e B, le superfici medie calcolato scratch (in pixel) per ciascuno dei 4 graffi fatte attraverso un piatto di LR-MSC al 95% di confluenza o migrazione pre o post, con esposizione su 0% o 4% CSE CSE vengono confrontati. La figura 4C confronta la variazione calcolata media nella zona zero (spazio post-migrazione sottratto zona di pre-migrazione) in LR-MSC esposti a uno 0% o 4% CSE, dimostrando meno migrazione (variazione media inferiore nella zona da grattare ) dopo l'esposizione al 4% CSE.
Figura 1: confluenza corretta è cruciale per la generazione della robusta dosaggio zero riproducibile. (A) murino LR-MSC al 95% di confluenza, appropriato per scrisione. (B) Un graffio di successo al 95% di confluenza. (C) LR-MSC a 70% di confluenza, troppo basso per un graffio di successo. (D) Acquisizione Immagine al 70% di confluenza in grado di produrre falsi confini. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative che dimostrano l'acquisizione delle immagini e le analisi (A) Immagine originale.. (B) L'immagine a seguito dell'applicazione della funzione "Trova bordi" sotto il menu "Azione" (punto 4.2). (C) L'immagine seguente regolazione della barra di scorrimento "Color Threshold" (punto 4.3). (D) L'immagine dopo aver eseguito il plugin MRI_Wound_Healing_Tool (punto 4.4). (E) Risultati finestra pop-up evidenziazione (scatola rossa) i numeri che vengono generati per ogni area. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative da zero test confrontando graffiati LR-MSC prima e dopo la migrazione (A) Rappresentante immagine originale pre-migrazione.. (B) Schema di calcolo zona da grattare pre-migrazione. (C) Rappresentante immagine originale dopo la migrazione. (D) Schema di zona da grattare calcolato dopo la migrazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4: Risultati rappresentativi da zero test confrontando quantificazione della zona da grattare, prima e dopo la migrazione LR-MSC, e l'esposizione a uno 0% o 4% CSE. (A) Rappresentazione grafica di superficie media calcolata zero (in pixel) per ognuno dei 4 graffi realizzati attraverso un piatto di LR-MSC al 95% di confluenza o migrazione pre o post, con l'esposizione a 0% CSE, con i dati presentati come media e deviazione standard. (B) Rappresentazione grafica di superficie media calcolata zero (in pixel) per ognuno dei 4 graffi realizzati attraverso un piatto di LR-MSC al 95% di confluenza o migrazione pre o post, con l'esposizione al 4% CSE, con i dati presentati come media e deviazione standard. (C) Confronto di variazione medio calcolato nella zona zero (migrazione post-pre) in LR-MSC esposto a uno 0% o 4% CSE, dimostrando meno migrazione (variazione media più bassa in scrzona atch) dopo l'esposizione al 4% CSE, con i dati presentati come media e deviazione standard, * P = 2.99 x 10 -8. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo quantitativo robusto, standardizzato per eseguire ed analizzare saggi di scratch. Saggi scratch semplici sono abitualmente utilizzati in diversi settori di studio per esaminare la migrazione cellulare. Tuttavia, tradizionalmente il dosaggio zero è mancato un set-up e la quantificazione protocollo standardizzato, che ha portato a problemi con riproducibilità 7,10. Molte delle modifiche e ottimizzazioni per migliorare il dosaggio zero hanno ridotto questi problemi, tra individuale live-cell imaging, saggi basati tappo standardizzati, e tridimensionali saggi micro-pilastro 4,8,10. Tuttavia, questi test possono essere difficili da personalizzare o adattare 10 e per alcune applicazioni, queste tecniche possono anche essere costo proibitivo.
Per produrre un protocollo standardizzato test zero, ci sono diversi passaggi critici nel protocollo presentato qui che richiedono informazioni specifiche sulla cellule INVOLved, e ottimizzazione del saggio basato sulle caratteristiche cellulari relative. In particolare, è importante per ottimizzare il numero di cellule necessarie e il tempo di coltura necessario per ottenere un monostrato uniforme al 90-100% di confluenza per il saggio (Passo 1.3 e Step 1.4). Con troppo poche cellule (meno del 90% confluenti), le cellule non formeranno un monostrato sufficiente. Non solo questo influenzare il microambiente cellulare, ma sarà anche influenzare la capacità del software di imaging per identificare correttamente i bordi della graffiatura. Al contrario, troppe cellule in monostrato (100% confluenti, o celle impilate) potrebbero causare inibizione da contatto, e quindi cambiare le caratteristiche migratorie delle cellule. Alcune varianti del protocollo di dosaggio zero raccomandano la crescita cellulare al 100% di confluenza e non considerano questo potenziale limitazione di alcune cellule di contatto sensibili come la MSC 8. Le stesse preoccupazioni dovrebbero essere applicati al grado di danno che è infliCTED sulle cellule (punto 1.5). Il protocollo qui descritto è stato progettato per valutare i cambiamenti nella migrazione delle cellule dopo un danno da esposizione al fumo di sigaretta solubile sulle MSC capacità migratorie, ma questo test potrebbe essere altrettanto utile per valutare l'effetto di diversi tipi di danno sulla migrazione delle cellule. È importante che il danno afflitto è sufficiente a fornire una distinzione statistica tra i gruppi trattati e di controllo. Tuttavia, troppo danno può anche provocare confluenza delle cellule ridotta, che ancora una volta possono influenzare la capacità del software di imaging per identificare correttamente i bordi della zero.
Sia senescenza cellulare e la proliferazione cellulare possono essere fattori di confondimento che possono falsamente alterare i risultati del test zero. In particolare, la generazione del graffio deve essere attentamente per evitare danni eccessivo cellule circostanti che potrebbero provocare senescenza. Graffiare con un puntale di plastica piuttosto che un hypodermic ago o bisturi evita danni eccesso pur preservando l'integrità della superficie piastra di coltura nella zona di migrazione e la matrice extracellulare (Passo 2.1). Inoltre, la lunghezza del tempo in cui la migrazione delle cellule quali può avvenire deve essere considerato con attenzione per evitare significativa proliferazione cellulare come variabile confondente (Passo 3.7). Per l'analisi della migrazione LR-MSC, 7 ore è ottimale nel valutare le cellule danneggiate con CSE. Incubando le cellule per più di 12 ore è generalmente sconsigliata, tuttavia questo potrebbe non essere applicabile a tutti i tipi di cellule, in particolare quelli con tassi di raddoppio molto bassi. Per valutare sia senescenza cellulare e la proliferazione cellulare, una combinazione di senescenza associata beta-galattosidasi e BrDU o EdU incorporazione può essere eseguita su cellule al termine del test 19. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto è accessibile ai laboratori con limitate capacità tecniche, che richiedono solo una buona qualità microscopio invertito a contrasto di fase e la fotocamera. Ilreagenti sono poco costosi, e il software di imaging è open source. Tuttavia, al fine di garantire risultati ottimali di questa analisi, compresi buona riproducibilità e la capacità di effettuare analisi statistiche rigorosa, un'attenta ottimizzazione dovrebbe essere considerata per ogni nuovo tipo di cella o danni scenario sperimentale che viene tentata.
Ottimizzazioni presentati in questo indirizzo di protocollo alcune delle limitazioni presenti nel precedente lavoro svolto per standardizzare i test e vinci. Mentre i protocolli di test e vinci prendono tradizionalmente misure di larghezza e vinci da uno snapshot del 8,9 graffio, il protocollo qui presentata utilizza misurazioni dell'area di immagini scattate su tutta la lunghezza del graffio di aumentare rigore statistico e di prendere in considerazione le incongruenze nella larghezza di il graffio iniziale. Sulla base dei test ripetuto (dati non mostrati), larghezza zero può non essere considerata perfettamente costante per tutta la sua lunghezza. Dopo la migrazione, i bordi °e zero diventare più eterogenei, rendendo sempre più difficile calcolare accuratamente una larghezza zero, e in seguito necessitano calcoli delle aree. Questo protocollo utilizza MRI_Wound_Healing_Tool, un programma per computer specializzato, al fine di ridurre la soggettività e migliorare la coerenza nell'analisi zona da grattare. Mentre non si sa se i calcoli della larghezza semplici potrebbero portare a risultati abbastanza specifici per distinguere tra sottili differenze di migrazione a causa di prima CSE o altro dannosi, questo protocollo dimostra questa sensibilità. Ottimizzazioni presentati in questo protocollo riorganizzare il dosaggio zero comune per affrontare queste limitazioni in modo economicamente fattibile, di offrire opzioni per la personalizzazione, e per fornire ulteriori tecniche per dimostrare la sensibilità e convalidare i risultati.
Il dosaggio scratch quantitativa ottimizzato descritto in questo protocollo è ancora limitata considerando una popolazione di cellule, piuttosto che singole celle. Questa tecnica assumes che la popolazione cellulare è relativamente omogenea, e che questo si tradurrà in caratteristiche di migrazione relativamente omogenee. A seconda dell'applicazione, può essere più importante considerare la migrazione di cellule singole invece 8. Inoltre, il protocollo di dosaggio scratch qui descritta dipende da una popolazione di cellule che non proliferare abbastanza rapidamente per confondere analisi di migrazione in un periodo 4-7 hr. Le linee cellulari che possono proliferare estensivamente durante questo breve periodo di tempo non sarebbe adatto per l'analisi utilizzando questa tecnica. Nonostante queste limitazioni, questo protocollo di dosaggio zero quantitativa ha il potenziale per l'utilizzo in diverse applicazioni. Per esempio, un saggio basato danno cellulare può essere ottimizzato e quindi utilizzata per valutare la capacità di particolari trattamenti di limitare il danno cellulare. In alternativa, questo test potrebbe essere utilizzato con linee cellulari di cancro di valutare i potenziali trattamenti per limitare la capacità migratoria, e di conseguenza il potenziale metastatico, of queste cellule. Questo test zero ottimizzata è inoltre ancora limitata da eventuali disturbi al microambiente delle cellule che sono inevitabili nel generare il graffio. Tuttavia, selezionando accuratamente il livello confluenza delle cellule, un aumento dell'apoptosi e la generazione di fogli di cellule che sono parzialmente separate sul bordo del graffio può essere evitato.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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