Introduction
Zellmigration ist hoch koordinierter und entscheidend für viele physiologische Prozesse, wie beispielsweise der Gewebeentwicklung, Reparatur und Regeneration sowie pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Arteriosklerose 1. Ein Verständnis der Zellmigration ist besonders relevant für Emerging Therapien eingesetzt, um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu behandeln pathologischen Zuständen, einschließlich Zelltransplantation Technologien und künstliche Gewebe Pfropfen 2. Angesichts der gegenwärtigen Interesse an der Rolle von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) bei der Vermittlung der Reparatur von Gewebe 3, Quantifizierung der Migrationsfähigkeit dieser Zellen unter Verwendung eines Assays, die streng quantifizierbare, anpassungsfähig und kosteneffektiv ist von Interesse ist. Wichtig ist, dass ein solcher Test, relativ geringfügige Änderungen in der zellulären Migrationsfähigkeit nach Beschädigung ausreichend empfindlich sein. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Grund auf Assays, trans-und Migrationsassays (Boyden chBernsteine), micropillar Arrays und Zellsperrzone Assays besitzen eine Reihe von Einschränkungen in der Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und Kosten-Nutzen-1,4,5. Die hier beschriebene optimierte Kratz Test zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbar und bildbasierten Analysemöglichkeiten, Wirtschaftlichkeit und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen.
Scratch-Assays sind in mehreren Kapazitäten verwendet worden, um die Zellmigration und Proliferation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen 5 zu beurteilen. Der Test beinhaltet Aussäen der bezeichneten Zellen, wächst sie in oder in der Nähe Zusammenfluss abgeschlossen ist, und ein Verkratzen der resultierenden Monoschicht mit einer sterilen Nadel oder Pipettenspitze 6. Analyse wird am häufigsten durch Vergleichen der Breite des Kratzers über mehrere Zeitpunkte an zufällig ausgewählten Stellen 7-9 durchgeführt. Trotz seiner prominenten Gebrauch wird der Kratztest durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Quantifizierung verwechselt. VariabilitätGeneration des Scratch nicht verändert nur die Mikroumgebung der Zellen, sondern kann auch die Zellmigration zu verhindern, indem die Plattenoberfläche und die zugrunde liegenden extrazellulären Matrix 5 zu beschädigen. Assays werden häufig mehr als 7 bis 12 h durchgeführt, jedoch für die Zelllinien Anzeige langsamer Migration und längere Testzeiten wird die Proliferation eine verwirrende Variable 7,10. Schließlich kann seneszenten Zellen durch den Ritzvorgang erzeugten Faktoren, die mit der extrazellulären Signalisierung benötigt, um die Lücke in der Monoschicht 1 schließen stören zugeben. Optimierung des Kratztest erfordert die Schaffung eines konsistenten Lücke, die nicht mit Oberflächeneigenschaften nicht beeinträchtigt, die Minimierung Assay Zeitlänge und verhindert unerwünschten Zelltod während der Manipulation. Der Anschlag basierenden Assay ist eine Optimierung der Zellausschlusszone Assay. Dieses Assay wendet einen Anschlag in der Mitte der Vertiefung, die das Zellwachstum schließt platziert, aber erlaubt den Zellen, um den zentralen Sperrzone plattiert werden.Um die Migration zu bewerten, wird der Anschlag entfernt und der sich ergebende Sperrzone stellt eine Oberfläche zur Migration auftritt. Allerdings ist dieser Test schwierig gestalten oder anzupassen 10 und für einige Anwendungen kann diese Technik auch zu kostspielig.
Im Gegensatz zu Kratzassays und deren Derivaten, trans-well Migrationsassays (oder Boyden-Kammer-Assays) beurteilt Migration durch Quantifizieren der Anzahl von Zellen, die von einer Kammer zu bewegen, durch eine mikroporöse Filtermembran, in eine Kammer, die chemotaktische Mittel 8,11, 12. Diese Technik hat einen Nutzen für adhärente Zellen, wie MSCs begrenzt, da nach der Migration durch die poröse Membran, Zellen haften an der Membranseite auf die chemotaktische Mittel ausgesetzt wird, und kann schwer genau zu quantifizieren. Während der Test ist in der Lage, einige dreidimensionale Migrationsmuster zu untersuchen, die eingeschränkten Zelltypen, für die sie in der Lage, genau zu quantifizieren Zellmigrationsgrenzwert seine Nützlichkeit ist 10. Eine weitere Alternative zur Kratzassays verwendet einen Mikrosäulenarray, das zelluläre Motilität durch einen dreidimensionalen Raum misst unter Verwendung der Fähigkeit der Zellen, sich zu verformen und die Migration in das Array als Surrogat. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomeren über einen präzisen Form gehärtet und mit Ozon behandelt und Fibronektin erzeugt ein homogenes und nicht-abbaubare Mikroumgebung. Mikrosäulenabstand kann bei Bedarf auch um die Fähigkeit der Zellen, um das Array 4 geben abzuschätzen variiert werden. Die Form wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung von Siliziumwafern geschaffen, um eine negative Version des hohen Aspektverhältnisses Array 13 zu schaffen. Während der Assay wird durch seine Anpassbarkeit verstärkt, um die Fähigkeit dreidimensionalen Migration, und die Analyse durch die direkte Visualisierung von wandernden Zellen zu modellieren, die Schwierigkeit bei der Schaffung von Mikrosäulenanordnungen wirtschaftlich behindert ihre weitverbreitete Verwendung.
Die in diesem Protokoll beschriebenen optimierte Kratz Assay stellt ein effizientes, cost günstiges Verfahren zum Erzeugen konsistenter Kratzer, die durch frei verfügbaren Software analysiert werden können. Statt einfacher Breite Messungen über die Kratz vor und nach der Zellmigration hergestellt, ermöglicht die Software dem Anwender insgesamt kratz Bereiche vor und nach der Migration zu ermitteln. Dieser Fortschritt schränkt das Problem zu versuchen, festzustellen, wo die Kratz die Breitenmessungen sollten getroffen werden, und ob die Breite des Kratz einheitlich entlang ihrer Gesamtlänge. Außerdem ist eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen, die Zellkonfluenz und der Art und dem Grad der Beschädigung an den Zellen zugefügt, um eine weitere Optimierung der Assay erörtert.
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Protocol
Hinweis: Für diese Studie Lungen mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) vom distalen Lungengewebe isoliert wurden entweder auf der Grundlage ihrer Expression von Zelloberflächenmarker (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 hoch, EpCAM neg) 14,15, mit Explantation out-Wachstum 16, oder unter Verwendung von enzymatischen Abbau 17. Haft LR-MSCs wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und kein Glutamin, 15% FBS, 1x Antibiotikum / Antimykotikum, und 2 mM Glutamin (nachstehend vollständige Medien) und bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. LR-MSCs wurden 3-4 mal passagiert, um eine Population von Zellen mit relativ homogenen Wachstumseigenschaften für den Migrationstest sicherzustellen.
1. Vorbereiten einer konfluenten Monolayer
- Um MSCs von Standard-100 mm Kulturschalen zu lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 37 ° C vorgewärmten PBS, saugen Sie den PBS und fügen Sie 4 ml Trypsin (0,25%). Inkubieren 3-5 min in einem 37 ° C Inkubator. Saugen Sie das cells in eine konische Röhre fügen gleichen Volumen von komplettem Medium und Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren gelassen.
Hinweis: Längere Inkubation in Trypsin kann die Zelloberflächenrezeptoren verändern und möglicherweise beeinflussen Migration. - Saugen Sie Medien und resuspendieren Zellen in frischem Vollmedium. Zählen von Zellen, ohne toten Zellen mit Trypanblau-Ausschluss und Platte 500.000 mesenchymalen Stromazellen in 4 ml komplettem Medium auf einer 60 mm Zellkulturschale.
Anmerkung: Abhängig von der Quelle der Zellen, können die Tests erforderlich sein, um die optimale Anzahl der benötigten Zellen zu bestimmen. - Inkubieren Zellen bis Platten sind 90% konfluent für eine optimale Zellhaftung und Proliferation, in der Regel 48 bis 72 Stunden für MSCs.
Hinweis: 100% Zusammenfluss ist nicht zu empfehlen, da viele verankerungsabhängigen Zellen Erfahrung Kontakthemmung, die ihre Migrationsfähigkeit verändern können. Platten mit weniger als 80% Konfluenz in unbrauchbare Fotos führen, da der Bildanalyse-Software wird Spalt interpretierens zwischen den Zellen als Teil des Umfangs des Kratzers (siehe Figur 1D). - Nachdem die Zellen 90% Konfluenz erreicht, schädigen die Zellen gegebenenfalls für die Anwendung. Um Zellschäden nach Einwirkung von löslichen Zigarettenrauch Extrakt (CSE) zu bewerten, zu erzeugen, 100% CSE durch Ziehen der Rauch von 1 University of Kentucky Forschungs Zigarette (3R4F) über 25 ml Komplettmedium in einer Saugflasche mehr als 2 min 18.
- Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in 4 ml 1-4% CSE in komplettem Medium verdünnt. Nach der Inkubation, waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml warmem sterilem PBS, bevor Sie mit 4 ml frisches Vollmedium.
Hinweis: schädlichen Zellen mit hohen Konzentrationen von Zigarettenrauch-Extrakt (> 5%) kann Fluss wesentlich zu verringern.
2. Erstellen der Scratch
- In einer sterilen Umgebung, nehmen Sie den Deckel von der 60-mm-Platte von beschädigten MSCs und legte eine gerade Kante (zum Beispiel eine sterilisierte Kunststofflineal) across der obere Rand der Platte. , Ohne dass die Medien, eine sterile 200 ul Pipettenspitze von der sterilen Lineal geführt, um 03.59 Uhr parallel Kratzer über die Platte ca. 5 mm voneinander entfernten und 50 mm Länge zu machen.
Hinweis: Eine gerade Kante der Betrag der Dreh Anpassungen an der Platte benötigt wird, wenn es auf dem Mikroskoptisch minimiert. Es ist zwingend notwendig, dass die Kratzer vollständig vertikal (oder horizontal) auf dem Bildschirm angezeigt. Erzeugen mehrerer Kratzer auf einer 60 mm Platte nicht die Mikroumgebung in einer Weise, die die Zellmigration (Daten nicht dargestellt) beeinflusst zu verändern, kann jedoch eine Überlegung für andere Zelltypen sein. Die Verwendung kleinerer Vertiefungen wird nicht empfohlen, da die Variabilität der wachsenden Zellen dicht an der Kante des Bohrlochs wird ausgeprägter und kann einheitlich Erzeugung von Kratzern zu beeinflussen. - Saugen Sie die Medien und vorsichtig waschen die Platten mit 2 ml vorgewärmten komplette Medien um Zellen aus dem Zentrum von dem Kratzer anhaftet und zu Zelle zu entfernens, die durch das Kratzen gelockert wurden. Ersetzen durch 4 ml frisches Vollmedium.
- Mit einem sterilen Permanentmarker kennzeichnen jeden Kratzer 1-4 auf der Unterseite der Platte an der Stelle, die nicht mit der Abbildung der Kratzer stören.
Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Bilder von dem gleichen Grund auf, verglichen vor und nach der Migration, da kann eine Variation in der Kratzbreite sein.
3. Unter Erste Bilder des Scratch
Anmerkung: Falls die Scratch Test beruht auf mehreren Platten durchgeführt, ist es empfehlenswert, dass die ersten Bilder aller Kratzer auf einer einzigen Platte ergriffen werden, bevor Kratzer auf der nächsten Platte hergestellt.
- Verwenden eines invertierten Phasenkontrastmikroskops mit einer Kamera, die Bilder für die Analyse benötigt generieren.
- Positionieren Sie die Kulturplatte auf dem Mikroskop, und verwenden Sie die Low-Power-Objektiv (10x) zu lokalisieren kratz # 1. Wenn sich Kondensation auf dem Deckel des Kulturplatte behindert eine klare image der Zellen, mit einem beheizten Bühnen auf 37 ° C.
- Keeping the scratch vollständig horizontalen und in der Mitte des Sichtfeldes, erhalten so viele Bilder wie nötig, um 90% der Länge der Kratzer zu umfassen. Erhalten von Bildern von verschiedenen Abschnitten der Kratzer mit keiner Überlappung zwischen den Bildern.
Anmerkung: Die Lichtbrechung an den Rändern des Kulturschale überbelichtet die Bilder, so dass sie nicht analysiert werden. Daher keine Bilder nehmen Sie aus dem ersten und letzten 5% der Länge der Kratzer ist. - Bilder von jedem Kratzer Speichern in einem separaten Ordner.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 für Kratzer 2, 3, und 4.
- Return-Platten in den Inkubator unmittelbar nach der anfänglichen Bildgebung. Lassen Zellen wandern für 4-7 Std.
Hinweis: 7 h ist optimal, wenn die Beurteilung MSCs mit CSE beschädigt. Inkubation von Zellen, die für mehr als 7 Stunden wird nicht empfohlen, weil die Zellproliferation als verwirrende Variable für die Zellmigration handeln (siehe Optional Anmerkung 8.2 unten).
- Laden Sie ImageJ und die Wundheilung Werkzeug-Plugin installieren (siehe die Tabelle der Materialien / Ausrüstung).
- Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ, klicken Sie dann auf "Process" und "Konturen finden", um die Zellen rund um den Grund auf für die Wundheilung Tool, um die Kratzfläche (2B) berechnen zu markieren. Klicken Sie dann auf "Bild", "Anpassen", "Color Threshold" und im Dropdown-Menü mit "Threshold Color" den Wert ändern "B & W".
- Im Menü "Farbschwelle", stellen die beiden Helligkeitsschwelle bewegen, bis die optimale Kontrast zwischen dem Kratzer und Zellfront erreicht wird. Um sich für die größte Reichweite bei dem Versuch, Kontrast im Bild zu erstellen, bewegen Sie den unteren Schieberegler ganz nach rechts (komplett schwarzes Bild), und stellen Sie dann den oberen Schieberegler, um maximalen Kontrast erzeugen kann.
- Langsam stellen Sie den oberen brightness Schieberegler von links nach rechts, bis das Bild sauber zeigt die Kontur des Kratz (2C). Sobald die Kanten der Kratz identifiziert worden sind, klicken Sie auf "Weitere Optionen" in der ImageJ-Toolbar, wählen "MRI_Wound_Healing_Tool" im Dropdown-Menü, und drücken Sie die Taste "M" (das wird in der ImageJ Symbolleiste angezeigt werden), um den Entwurfsbereich markieren und gibt die berechnete Fläche in einem Ergebnisse Pop-Out-Fenster (2D).
- Kopieren Sie alle Nummern aus dem Ergebnisfenster (2E) in einer Excel-Tabelle. Achten Sie darauf, Daten einzelner Kratzer zu trennen.
5. Unter Schlussbilder des Scratch
- Nachdem die Zellen migriert (4-7 h), wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4. Bild die Platten in der gleichen Reihenfolge, wie sie zerkratzt wurden, so dass die Zellen auf jeder Platte haben gleich viel Zeit für die Migration hatte.
Anmerkung: Die Zellen können zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von ihrer Sensivität sowohl Temperatur und pH-Änderungen. Alternativ können Live Cell Imaging verwendet, um die Zellen zu folgen in Echtzeit, wie sie zu migrieren.
6. Analysieren von Final Scratch Bilder
- Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,5 für Final Scratch Bilder.
7. Berechnung des Scratch Bereich zur Migrations Quantifizieren
- Berechnen Sie den Mittelwert vor der Migration Bereich durch Mittelung der Anfangsbereich Werte der jeweiligen Kratzer.
- Berechnen die Gesamtmenge der Migration durch Subtrahieren der endgültigen Migrationsbereich für jedes Bild, die in Schritt 6 berechnet aus dem Durchschnitt vor der Migration Bereich (Schritt 7.1). Erstellen Sie eine Liste von Werten für jeden Kratzer, die die Veränderung der Migration.
- Bündeln die Daten aus mehreren Kratzer innerhalb des gleichen Testgruppe (dh alle Platten und alle Kratzer auf Zellen auf 0% CSE ausgesetzt ist). Verwenden Sie eine Varianzanalyse-Test, um die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu analysieren.
- Wenn die Zellen langsam migrierenund eine längere Inkubationszeit nach dem Kratzen (größer als 10-12 Stunden), führen eine BrDU oder EdU Inkorporationstest 19 zu bestimmen, ob Zellen zuvor irgendeine Proliferation während des Zeitraums, in dem der Migrationstest auftritt. Wählen Sie einen Migrationstest Zeit zu erheblichen Zellproliferation zu vermeiden.
8. Optional
- Zu beurteilen, ob eine signifikante Zellalterung infolge des Kratzverfahren auftritt, führen Sie einen Seneszenz-assoziierte & beta; -Galactosidase-Assay auf einer Testplatte zu vorbestimmten Zeiten nach dem Kratzen 19.
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Representative Results
Die Scratch-Assays hier präsentierten Objekte wurden durchgeführt unter Verwendung von Mäuselunge Wohnsitz mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) und isoliert, wie in den Protokollnotizen verwiesen. Die LR-MSCs wurden in einer Dichte von 500.000 Zellen in einer 60 mm-Gewebekulturschale ausgesät und bis 90% Konfluenz in 48 h gezüchtet. Um Schäden zu generieren, wurde 4% CSE (oben beschrieben) mit den Zellen 24 h nach der ersten Aussaat Periode, aber vor dem Kratzer Assay inkubiert. Für jeden Test wurde die Kratz mit einer 200 ul Pipettenspitze erzeugt. Erste Bilder aufgenommen wurden, nachdem die Kratz erzeugt worden war, und lose Zellen und Trümmer weg mit komplettem Medium gewaschen worden. Wie in 1A und B gezeigt ist, ist angemessen Fluss wichtig, um sicherzustellen, dass die Bildverarbeitungssoftware kann korrekt die Grenzen der Kratz identifizieren. Wie in 1C gezeigt, sind die Zellen nicht ausreichend konfluent (entweder wegen unzureichender Einsaatdichten unzureichende incubation Zeiten oder übermäßigen Schaden), die Kratzer mit heterogenen Grenzen, die nicht leicht durch die Bildverarbeitungssoftware (1D) auszeichnen führen kann, Fig. 2 zeigt die Bildaufnahme und Analyse. 2A zeigt das Originalbild vor der Analyse. 2B zeigt das Ergebnis der "Konturen finden" Werkzeug unter dem Menü "Prozess" (Schritt 4.2) und 2C zeigt das Bild nach Einstellung der "Color Threshold" Schieberegler (Schritt 4.3). 2D zeigt die endgültige analysierten Bild nach dem Ausführen des MRI_Wound_Healing_Tool Plugin (Schritt 4.4). 2E zeigt die Ergebnisse Popup-Fenster, Hervorhebung (rotes Feld) die Zahlen, die erzeugt werden. Vertreter vor und nach der Migration Bilder werden in Figur 3 gezeigt, mit entsprechenden Kratzbereichsgrenzen, wie durch die Bildverarbeitungssoftware definiert sind, Fig. 4 graphically zeigt die veränderte Migrationsfähigkeit in LR-MSCs nach Schädigung mit 4% CSE gesehen. In 4A und B, die durchschnittlichen berechneten kratz Bereichen (in Pixel) für jede der 4 Kratzer auf einem Teller mit LR-MSCs bei 95% Konfluenz entweder vor oder nach der Migration, mit der Exposition gegenüber entweder 0% CSE bzw. 4% CSE verglichen. 4C vergleicht die berechnete durchschnittliche Veränderung der Entwurfsbereich (nach der Migration Bereich von vor der Migration Bereich abgezogen) in LR-MSCs entweder 0% oder 4% CSE ausgesetzt, was zeigt, weniger Migrations (niedrigere durchschnittliche Veränderung der Entwurfsbereich ) nach der Einwirkung von 4% CSE.
Abbildung 1: Korrigieren Konfluenz ist kritisch für die Erzeugung der robuste reproduzierbare Kratztest. (A) Murine LR-MSCs bei 95% Konfluenz für scr entsprechendenatching. (B) Eine erfolgreiche kratz bei 95% Konfluenz. (C) LR-MSCs bei 70% Konfluenz auch für eine erfolgreiche kratz gering. (D) Bildaufnahme bei 70% Konfluenz können falsche Grenzen zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder demonstrieren Bildaufnahme und Analyse (A) Originalbild.. (B) Bild nach Anwendung des "Konturen finden" Werkzeug unter dem Menü "Prozess" (Schritt 4.2). (C) Bild nach Einstellung der "Color Threshold" Schieberegler (Schritt 4.3). (D) Bild nach dem Ausführen des MRI_Wound_Healing_Tool Plugin (Schritt 4.4). (E) Rrgebnisse Pop-up-Fenster-Highlighting (rotes Feld) die Zahlen, die für jeden Bereich erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von Grund auf neu-Test vergleichen zerkratzt LR-MSCs vor und nach der Migration (A) Repräsentative Originalbild vor der Migration.. (B) Outline of berechnet Kratzfläche vor der Migration. (C) Repräsentative Originalbild nach der Migration. (D) Outline of berechnet kratzBereich nach der Migration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Grund auf neu-Test vergleichen Quantifizierung der Kratzfläche vor und nach der LR-MSC-Migration und die Exposition gegenüber 0% oder 4% CSE. (A) Graphische Darstellung der mittleren berechneten Entwurfsbereich (in Pixel) für jede der 4 Kratzer auf einem Teller mit LR-MSCs bei 95% Konfluenz entweder vor oder nach der Migration, mit der Exposition gegenüber 0% CSE, mit so präsentierten Daten Mittelwert und Standardabweichung. (B) Grafische Darstellung der durchschnittlichen berechneten Entwurfsbereich (in Pixel) für jede der 4 Kratzer auf einem Teller mit LR-MSCs bei 95% Konfluenz entweder vor oder nach der Migration, mit der Exposition gegenüber 4% CSE, mit so präsentierten Daten Mittelwert und Standardabweichung. (C) Vergleich der berechneten durchschnittlichen Veränderung der Entwurfsbereich (post-Pre-Migration) in LR-MSCs ausgesetzt, entweder 0% oder 4% CSE und zeigt weniger Migration (niedrigere durchschnittliche Veränderung in scratch Bereich) nach Exposition gegenüber 4% CSE, mit wie Mittelwert und Standardabweichung vorgelegten Daten * P = 2,99 x 10 -8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitativ stabile, standardisierte Verfahren durchzuführen und zu analysieren Kratztests. Einfache kratz Tests werden routinemäßig in vielen verschiedenen Bereichen der Studie verwendet werden, um Zellmigration zu untersuchen. Jedoch traditionell die Scratch-Test hat ein standardisiertes Set-up und Quantifizierung Protokoll, das auf Fragen im Zusammenhang mit der Reproduzierbarkeit 7,10 geführt hat gefehlt. Viele der Änderungen und Optimierungen zur Verbesserung der Kratztest haben diese Fragen, einschließlich der einzelnen Live-Cell-Imaging, standardisierte Anschlag basierte Assays, und dreidimensionale Mikro-Säulen-Assays 4,8,10 reduziert. Allerdings können diese Assays schwer zu gestalten oder anzupassen, 10 zu sein und für einige Anwendungen können diese Techniken auch unerschwinglich teuer sein.
Eine standardisierte Kratztestprotokoll zu erzeugen, gibt es einige kritische Schritte in dem Protokoll hier vorgestellten, die spezifische Informationen über die Zellen invol erforderlichved und Optimierung des Assays auf Basis der relevanten Zelleigenschaften. Insbesondere ist es wichtig, die Anzahl der Zellen benötigt wird und die Zeit in Kultur notwendig sind, um eine gleichförmige Monoschicht bei 90-100% Konfluenz für den Test (Schritt 1.3 und Schritt 1.4) erreichen zu optimieren. Mit zu wenigen Zellen (weniger als 90% konfluent), werden die Zellen, die nicht eine ausreichende Monoschicht bilden. Dies wird nicht nur Einfluss auf die zelluläre Mikroumgebung, sondern es wird auch die Fähigkeit der Bildverarbeitungssoftware, um die Kanten der Kratz korrekt identifizieren beeinflussen. Im Gegensatz dazu kann zu viele Zellen in der Monoschicht (100% konfluent waren, oder gestapelte Zellen) und in Kontakthemmung führen und damit die Migrationseigenschaften der Zellen zu ändern. Einige Varianten der Kratztestprotokoll empfehlen Zellwachstum zu 100% Konfluenz und dieses Potenzial Begrenzung für bestimmte berührungsempfindliche Zellen, wie MSCs 8 nicht berücksichtigen. Die gleichen Bedenken sollte der Grad der Schädigung, die infli aufgebracht werdenauf die Zellen cted (Schritt 1.5). Das hier beschriebene Protokoll ist so ausgelegt, um Veränderungen in der Zellmigration nach Schädigung durch Einwirkung von löslichen Zigarettenrauch auf die Migrationsfähigkeit MSCs zu beurteilen, aber dieses Assays konnte bei der Beurteilung der Wirkung von vielen verschiedenen Arten von Schäden auf die Zellmigration gleichermaßen nützlich sein. Es ist wichtig, dass die betroffenen Schäden ausreicht, um einen statistischen Unterschied zwischen den Versuchs- und Kontrollgruppen bereitzustellen. Jedoch kann zu viel Schaden auch bei reduziertem Zellkonfluenz, was wiederum die Fähigkeit der Bildverarbeitungssoftware, um die Kanten der Kratz korrekt identifizieren beeinflussen führen.
Beide Zellalterung und Zellproliferation können Störfaktoren, die fälschlicherweise die Ergebnisse der Kratztest verändern kann. Insbesondere soll die Erzeugung der Kratzer sorgfältig darauf geachtet, übermäßige Beschädigung der umgebenden Zellen, die in der Seneszenz führen können, vermieden werden. Kratzen mit einem Kunststoffpipettenspitze eher als ein hypodermic Nadel oder Skalpell vermeidet überschüssige Beschädigung während auch die Integrität der Kulturplattenoberfläche in der Wanderungszone und der extrazellulären Matrix (Schritt 2.1). Zusätzlich muss die Länge der Zeit, über die die Zellmigration auftreten darf sorgfältig als signifikante Zellproliferation als Störfaktoren Variable (Schritt 3,7) zu vermeiden. Für die Analyse der LR-MSC-Migration ist 7 h optimal bei der Beurteilung der Zellen mit CSE beschädigt. Inkubieren der Zellen für mehr als 12 Stunden ist im allgemeinen nicht zu empfehlen, dies kann jedoch nicht für alle Zelltypen anwendbar, insbesondere solche mit sehr niedriger Verdopplungsraten. Sowohl der Zellalterung und Zellproliferation, die eine Kombination der Seneszenz-assoziierte & beta; -Galactosidase und BrDU oder EdU Einarbeitung kann auf die Zellen am Ende des Tests 19 ausgeführt werden beurteilen. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Protokoll ist zugänglich für Labore mit begrenzten technischen Kapazitäten, nur eine gute Qualität umgekehrten Phasenkontrastmikroskop und der Kamera erfordern. dasReagenzien sind preiswert, und die Imaging-Software ist Open Source. Jedoch, um optimale Ergebnisse aus diesem Assay einschließlich guter Reproduzierbarkeit und der Fähigkeit, strenge statistische Analysen durch gewährleisten, sollte eine sorgfältige Optimierung für jede neue Zelltyp oder experimenteller Schädigung Szenario, das versucht wird, berücksichtigt werden.
Optimierungen in diesem Protokoll-Adresse präsentiert einige der in früheren Arbeiten durchgeführt, um Kratzer Tests standardisieren vorliegenden Einschränkungen. In der Erwägung, kratzAssayProtokolle traditionell nehmen kratzBreitenMessungen aus einer Momentaufnahme des Kratz 8,9, das hier vorgestellte Protokoll verwendet Flächenmessungen von Bildern entlang der gesamten Länge der Kratz getroffen werden, um statistische Stringenz zu erhöhen und in der Breite in Betracht Unstimmigkeiten nehmen der ursprüngliche Grund auf neu. Basierend auf wiederholtes Testen (Daten nicht gezeigt), kann nicht davon ausgegangen kratz Breite über seine gesamte Länge vollkommen konsistent sein werden. Nach der Migration, die Kanten the kratz heterogener geworden, so dass es immer schwieriger, genau zu berechnen, einen Kratzer Breite und weiteren erfordern Flächenberechnungen. Dieses Protokoll verwendet MRI_Wound_Healing_Tool, eine spezialisierte Computer-Programm, um die Subjektivität senken und die Konsistenz bei der Analyse Entwurfsbereich. Zwar ist es nicht bekannt, ob einfache Breite Berechnungen konnten spezifisch genug, um zwischen den feinen Unterschiede in der Migration aufgrund von vor CSE oder anderen schädlichen unterscheiden Ergebnisse ist, zeigt dieses Protokoll diese Empfindlichkeit. Optimierungen in diesem Protokoll vorgestellt erneuern die gemeinsamen Scratch-Test, um diese Beschränkungen in einer wirtschaftlich durchführbare Weise anzugehen, um die Optionen, die individuell anzubieten und zusätzliche Techniken, um die Empfindlichkeit zu demonstrieren und zu validieren Ergebnisse zu liefern.
Die in diesem Protokoll beschrieben optimierte quantitative Kratztest noch unter Berücksichtigung einer Zellpopulation beschränkt ist, sondern als Einzelzellen. Diese Technik assumoder es, daß die Zellpopulation relativ homogen, und dass dies in relativ homogenen Migrationseigenschaften führen. Je nach Anwendung kann es wichtiger sein, die Migration von einzelnen Zellen statt 8 berücksichtigen. Darüber hinaus ist das hier beschriebene Kratztestprotokoll hängt von einer Population von Zellen, die sich nicht schnell genug, um die Analyse der Migration über einen 4-7 Stunden-Zeitraum verwechseln proliferieren. Zelllinien, die in dieser kurzen Zeitspanne ausgiebig proliferieren kann wäre nicht geeignet für die Analyse unter Verwendung dieser Technik zu sein. Trotz dieser Einschränkungen hat diese quantitative Kratztestprotokoll das Potenzial für den Einsatz in vielen verschiedenen Anwendungen. Zum Beispiel könnte eine Zellschädigung basierten Assay optimiert und dann verwendet, um die Fähigkeit von bestimmten Behandlungen, Zellschäden zu begrenzen beurteilen. Alternativ kann dieser Test mit Krebszelllinien verwendet werden, um mögliche Behandlungen zu beurteilen sein, Migrationsfähigkeit und damit metastatischen Potential zu begrenzen, of diese Zellen. Diese optimierte Kratztest wird auch noch von möglichen Störungen des Zellmikroumgebung, die bei der Erzeugung des Kratz unvermeidbar sind begrenzt. Jedoch kann durch eine geeignete Wahl von Zellkonfluenz Ebene erhöhte Apoptose und die Erzeugung von Folien aus Zellen, die teilweise auf dem Rand der Kratzer getrennt sind, können vermieden werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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