Introduction
La migration cellulaire est hautement coordonnée et essentielle pour de nombreux processus physiologiques tels que le développement des tissus, la réparation et la régénération, ainsi que des processus pathologiques tels que les métastases du cancer et une artériosclérose. Une bonne compréhension de la migration cellulaire est particulièrement pertinent pour les nouvelles thérapies utilisées pour réparer les tissus endommagés et traiter des conditions pathologiques, y compris les technologies de transplantation de cellules et de tissus artificiels greffage 2. Compte tenu de l'intérêt actuel pour le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans la médiation de la réparation des tissus 3, la quantification de la capacité de migration de ces cellules en utilisant un dosage qui est rigoureusement quantifiables, adaptable et rentable est d'intérêt. Surtout, un tel essai doit être suffisamment sensible pour détecter des changements relativement subtiles dans la capacité migratoire cellulaire après les dommages. Les méthodes actuelles pour quantifier la migration des cellules, y compris des essais à gratter, des essais de migration trans-puits (Boyden chambres), tableaux micropilier et l'exclusion de la zone cellulaire tests possèdent une gamme de limitations dans la reproductibilité, de personnalisation, de quantification et coût-efficacité 1,4,5. Le dosage de zéro optimisé décrit ici démontre des résultats robustes, des capacités d'analyse et quantifiables basés sur l'image, coût-efficacité, l'adaptabilité et à d'autres applications.
Des dosages de grattage ont été utilisés dans de multiples capacités d'évaluer la migration et la prolifération cellulaire dans différentes conditions expérimentales 5. Le test implique l'ensemencement des cellules désignées, les cultiver à compléter ou à proximité de la confluence, et gratter la monocouche résultant avec une aiguille stérile ou pipette 6. L'analyse est le plus souvent réalisée en comparant la largeur de la rayure sur plusieurs points de temps à des endroits choisis au hasard 7-9. En dépit de son utilisation importante, l'essai de rayure est confondu par des problèmes avec la reproductibilité et la quantification. La variabilité dansgénération de la rayure ne modifie pas le micro-environnement des cellules, mais peut également empêcher la migration des cellules en endommageant la surface de la plaque sous-jacente et la matrice extracellulaire-5. Les dosages sont effectués fréquemment plus de 7 à 12 heures, mais pour des lignées cellulaires présentant migration plus lente et de plus longs temps de dosage, la prolifération devient un facteur de confusion 7,10. Enfin, les cellules sénescentes générés par le processus de grattage peuvent libérer des facteurs qui interfèrent avec la signalisation extracellulaire nécessaire pour combler l'écart dans la monocouche 1. Optimiser le dosage de zéro nécessite la création d'un espace cohérent qui ne perturbe pas les propriétés de surface, ce qui minimise dosage longueur de temps, et de prévenir la mort des cellules non désirées lors de la manipulation. Le dosage est basé bouchon une optimisation du dosage d'une zone d'exclusion de cellules. Cet essai utilise un bouchon placé au milieu du puits, qui exclut la croissance des cellules, mais permet aux cellules d'être plaqués autour de la zone d'exclusion central.Pour évaluer la migration, le bouchon est enlevé, et la zone d'exclusion résultante fournit une surface pour la migration se produise. Toutefois, ce dosage est difficile pour personnaliser ou adapter 10 et pour certaines applications, cette technique peut également être prohibitif.
Contrairement aux tests de grattage et de leurs dérivés, des tests de migration trans-de puits (ou de Boyden dosages de chambre) évaluer la migration en quantifiant le nombre de cellules qui se déplacent d'une chambre, à travers une membrane de filtration microporeuse, dans une chambre contenant des agents chimiotactiques 8,11, 12. Cette technique a une utilité limitée pour les cellules adhérentes comme MSC, car après la migration à travers la membrane poreuse, les cellules adhèrent au côté de la membrane exposée aux agents chimiotactiques, et peuvent être difficiles à quantifier avec précision. Alors que le test est en mesure d'examiner certains schémas de migration en trois dimensions, les types de cellules restreintes pour lesquelles il est en mesure de quantifier avec précision la limite de la migration des cellules de son utilitaire 10. Une autre alternative pour des essais de rayure utilise une matrice de micro-colonne, qui mesure la motilité cellulaire à travers un espace à trois dimensions en utilisant la capacité des cellules à se déformer et à migrer dans la matrice en tant que substitut. Polydimethlysiloxane (PDMS) élastomères durcis sur un moule précis et traités avec de l'ozone et de la fibronectine produit un micro-environnement homogène et non dégradable. Micro-pilier espacement peut également être modifié selon les besoins pour évaluer la capacité des cellules pour entrer dans le tableau 4. Le moule est créée par profonde gravure ionique réactive de plaquettes de silicium pour créer une version négative de la haute rapport d'aspect 13 gamme. Bien que le dosage est renforcé par sa personnalisation, la capacité de modéliser la migration en trois dimensions, et l'analyse par la visualisation directe des cellules migrantes, la difficulté à créer des réseaux de micro-pilier économique empêche son utilisation généralisée.
Le dosage de zéro optimisé décrit dans ce protocole offre une efficacité, des cosProcédé de t-efficace pour produire des rayures uniformes qui peuvent être analysées en utilisant un logiciel disponible gratuitement. Au lieu de simples mesures de largeur faites à travers le scratch avant et après la migration cellulaire, le logiciel permet à l'utilisateur de déterminer les zones à gratter totaux avant et après la migration. Cet avancement limite la question d'essayer de déterminer où le zéro les mesures de largeur doivent être prises, et si la largeur de la rayure est uniforme le long de sa longueur. En outre, une optimisation soignée du nombre de cellules, la confluence des cellules et le type et le degré de dommages infligés aux cellules est discutée afin d'optimiser le dosage.
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Protocol
Remarque: Pour cette étude, des cellules stromales mésenchymateuses du poumon (LR-MSC) à partir de tissu pulmonaire distale ont été isolés soit en fonction de leur expression de marqueurs de surface cellulaire (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 élevé, EpCAM neg) 14,15, à l'aide explantation hors croissance de 16, ou en utilisant une digestion enzymatique 17. LR-adhérent CSM ont été cultivées dans du DMEM riche en glucose avec et sans glutamine, 15% de FBS, de la glutamine mM antibiotique / antimycotique, et deux 1x (médias désormais complet) et on incube à 37 ° C, 5% CO 2. LR-MSC ont été passées 3-4 fois afin d'assurer une population de cellules ayant des caractéristiques de croissance relativement homogènes pour l'essai de migration.
1. Préparation d'une monocouche confluente
- Pour détacher MSC de boîtes de culture de 100 mm, laver les cellules avec 10 ml de 37 ° C préchauffé PBS, aspirer le PBS et ajouter 4 ml de trypsine (0,25%). Incuber 3 à 5 min dans un incubateur à 37 °. Aspirer le cElls dans un tube conique, ajouter un volume égal de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules vers le bas.
Remarque: incubation plus long peut modifier la trypsine dans les récepteurs de la surface cellulaire et potentiellement affecter la migration. - Aspirer le milieu et remettre les cellules dans un milieu complet frais. Compter les cellules, à l'exclusion des cellules mortes en utilisant exclusion du bleu trypan et de la plaque de cellules stromales mésenchymateuses 500.000 dans 4 ml de milieu complet sur une boîte de culture cellulaire de 60 mm.
Note: En fonction de la source des cellules, des tests peuvent être nécessaires pour déterminer le nombre optimal de cellules nécessaires. - Incuber les cellules jusqu'à ce que les plaques sont 90% de confluence pour une fixation optimale des cellules et la prolifération, habituellement 48-72 h pour MSC.
Remarque: 100% de confluence est pas recommandé, car un grand nombre de cellules expérience inhibition de contact de l'ancrage à charge, ce qui peut modifier leur capacité migratoire. Plaques avec moins de 80% de confluence se traduira par des photos inutilisables parce que le logiciel d'analyse d'image va interpréter écarts entre les cellules dans le cadre du périmètre de la rayure (voir figure 1D). - Après que les cellules ont atteint 90% de confluence, les cellules comme endommager approprié pour l'application. Pour évaluer les dommages cellulaires après exposition à soluble extrait de la fumée de cigarette (CSE), générer 100% CST en dessinant la fumée à partir du 1er Université du Kentucky cigarette de recherche (3R4F) à travers 25 ml de milieu complet dans un flacon Büchner plus de 2 min 18.
- Incuber les cellules pendant 24 heures dans 4 ml 1-4% CST diluée dans un milieu complet. Après incubation, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS chaud stérile, avant de remplacer avec 4 ml de milieu complet frais.
Remarque: endommager les cellules avec des concentrations élevées de l'extrait de la fumée de cigarette (> 5%) peut réduire sensiblement la confluence.
2. Création du Scratch
- Dans un environnement stérile, retirer le couvercle de la plaque de 60 mm de MSC endommagés, et de jeter un bord droit (par exemple, une règle en plastique stérilisé) across le rebord supérieur de la plaque. Sans retirer le support, utiliser une pipette de 200 pi stérile guidée par le straight-edge stérile pour faire de un à quatre rayures parallèles à travers la plaque d'environ 5 mm d'intervalle et 50 mm de long.
Remarque: A bord droit minimise la quantité de réglages en rotation nécessaires à la plaque quand il est sur la platine du microscope. Il est impératif que les rayures apparaissent complètement verticale (ou horizontale) sur l'écran. Générer de multiples rayures sur une plaque de 60 mm ne modifie pas le micro-environnement d'une manière qui affecte la migration des cellules (données non présentées), mais elle peut être une considération pour les autres types de cellules. L'utilisation de petits puits est déconseillé car la variabilité de la croissance de cellules près du bord du puits devient plus prononcée et peut affecter la génération uniforme de rayures. - Aspirer les médias et laver délicatement les plaques avec 2 ml de milieux complets pré-chauffé pour empêcher les cellules d'adhérer au centre de la rayure, et de supprimer la cellules qui ont été ébranlée par le grattage. Remplacer avec 4 ml de milieu complet frais.
- L'utilisation d'un marqueur permanent stérile, étiqueter chaque scratch parmi 1-4 sur la face inférieure de la plaque à l'emplacement qui ne sera pas interférer avec l'imagerie des rayures.
Remarque: Il est important que les images de la même zéro sont comparés avant et après la migration, car il peut y avoir des variations dans la largeur de zéro.
3. Prenant images initiales de la rayure
Remarque: Si le dosage de zéro est effectuée sur des plaques multiples, il est recommandé que les images initiales de toutes les rayures sur une seule plaque sont prises avant rayures sont faites sur la plaque suivante.
- Utiliser un microscope à contraste de phase inversée avec un appareil pour générer les images nécessaires à l'analyse.
- Placer la plaque de culture sur le microscope, et d'utiliser l'objectif de faible puissance (10X) pour localiser zéro # 1. Si de la condensation sur le couvercle de la plaque de culture est une entrave claire image des cellules, utilisez un ensemble de stade chauffé à 37 ° C.
- Garder le scratch complètement horizontal et dans le centre du champ de vision, obtenir autant d'images que nécessaire pour englober 90% de la longueur de la rayure. Obtenir des images de parties distinctes de la rayure sans chevauchement entre les images.
Remarque: La réfraction de la lumière sur les bords de la boîte de culture surexpose les images, ce qui les rend impossibles à analyser. Par conséquent, ne pas prendre des images de la première et dernière 5% de la longueur de la rayure. - Enregistrez les images de chaque zéro dans un dossier distinct.
- Répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour les égratignures 2, 3, et 4.
- Remettre les assiettes à l'incubateur immédiatement après l'imagerie initiale. Laissez cellules migrent pour 4-7 heures.
Remarque: 7 h est optimale lors de l'évaluation MSC endommagés avec le CST. Incubation des cellules pendant plus de 7 heures est pas recommandé car la prolifération cellulaire peut agir comme un facteur de confusion pour la migration cellulaire (voir la note 8.2 ci-dessous en option).
- Télécharger ImageJ et installer le plugin de guérison des plaies outil (se référer à la Table des Matières / Équipement).
- Ouvrez le fichier d'image dans ImageJ, puis cliquez sur "Process" et "Trouver Edges" de mettre en évidence les cellules environnantes le scratch pour la guérison des plaies outil pour calculer l'aire de zéro (figure 2B). Ensuite, cliquez sur "Image", "Ajuster", "Seuil de couleur" et dans le menu déroulant intitulé "Seuil de couleur" changer la valeur de "B & W."
- Dans le menu "seuil de couleur", régler les deux curseurs de seuil de luminosité jusqu'à ce contraste optimal entre le zéro et la cellule avant est atteint. Afin de permettre la plus grande gamme en essayant de créer contraste de l'image, déplacez le curseur en bas complètement à droite (image complètement noire), puis ajustez le curseur dessus pour générer un contraste maximum.
- Ajuster lentement le bri topghtness curseur de gauche à droite jusqu'à ce que l'image affiche proprement le contour de la rayure (figure 2C). Une fois les bords de la rayure ont été identifiés, cliquez sur "Plus Outils» dans la barre d'outils ImageJ, sélectionnez "MRI_Wound_Healing_Tool" dans le menu déroulant, puis appuyez sur la touche "m" (qui apparaîtra dans la barre d'outils ImageJ) pour mettre en évidence la zone de zéro et la sortie de la zone calculée dans une fenêtre de résultats pop-out (figure 2D).
- Copier et coller tous les numéros de la fenêtre des résultats (figure 2E) dans un tableur Excel. Assurez-vous de séparer les données individuelles des égratignures.
5. Compte Images finales du Scratch
- Après que les cellules ont migré (4-7 heures), répétez les étapes 3.2 à 3.4. Image les plaques dans le même ordre qu'ils ont été rayés de sorte que les cellules sur chaque plaque ont eu le temps égal à migrer.
Remarque: Les cellules peuvent être visualisés à de multiples points dans le temps, en fonction de leur sensitivité à la fois des changements de température et de pH. Alternativement, imagerie de cellules vivantes peut être utilisé pour suivre les cellules en temps réel lors de leur migration.
6. Analyse finales Scratch Images
- Répétez les étapes 4.2 à 4.5 pour des images de Final Scratch.
7. Calcul de la zone de Scratch pour quantifier la migration
- Calculer la superficie moyenne de pré-migration par la moyenne des valeurs de la zone de départ des rayures respectifs.
- Calculer le montant total de la migration en soustrayant la zone de migration finale pour chaque image, calculée à l'étape 6, à partir de la zone de pré-migration moyenne (étape 7.1). Générer une liste de valeurs pour chaque zéro représentant l'évolution de la migration.
- Regrouper les données provenant de plusieurs rayures à l'intérieur du même groupe d'essai (à savoir toutes les plaques et les griffes sur les cellules exposées à 0% CSE). Utiliser une analyse de l'essai Écart d'analyser les différences entre les groupes expérimentaux.
- Si les cellules sont lentes à migreret exiger un temps d'incubation plus longue après grattage (supérieure à 12.10 h), effectuer une BrDU ou EdU incorporation test 19 pour déterminer si les cellules sont en cours de prolifération pendant toute la période pendant laquelle l'essai de migration est en cours. Choisir un temps d'essai de migration pour éviter la prolifération cellulaire significative.
8. Facultatif
- Pour évaluer si la sénescence cellulaire importante est en cours à la suite de la procédure de grattage, effectuer une bêta-galactosidase dosage de la sénescence associée sur une plaque d'essai à des moments prédéterminés après grattage 19.
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Representative Results
Les tests de grattage présentées ici ont été réalisées en utilisant des cellules stromales mésenchymateuses résidents du poumon murins (LR-MSC) et isolés comme référence dans les notes de protocole. La LR-MSC ont été ensemencées à une densité de 500.000 cellules dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm, et cultivé à 90% de confluence en 48 heures. Pour générer des dommages, 4% CST (décrite ci-dessus) a été incubé avec les cellules pendant 24 heures après la période initiale d'ensemencement mais avant l'essai de zéro. Pour chaque essai, la rayure a été généré à l'aide d'une pointe de pipette 200 pi. Les premières images ont été prises après le scratch avait été générée, et toutes les cellules et les débris ont été emportés avec les médias complets. Comme le montre la figure 1A et B, confluent appropriée est important de veiller à ce que le logiciel d'imagerie peut identifier correctement les frontières de la rayure. Comme le montre la figure 1C, les cellules ne sont pas suffisamment confluentes (soit en raison de l'insuffisance des densités d'ensemencement, l'insuffisance inctemps de ubation, ou des dommages excessifs), qui peut entraîner des rayures avec des limites hétérogènes qui ne sont pas faciles à distinguer par le logiciel d'imagerie (figure 1D). La figure 2 montre acquisition et d'analyse d'image. Figure 2A représente l'image originale avant l'analyse. La figure 2b montre le résultat de l'outil «Trouver Edges" sous le menu "Action" (étape 4.2) et la figure 2C montre l'image suivante réglage de la barre de défilement "Couleur Seuil" (étape 4.3). Figure 2D représente l'image finale analysé après l'exécution du MRI_Wound_Healing_Tool plugin (étape 4.4). Figure 2E représente la fenêtre de résultats de pop-out, en soulignant (boîte rouge) les numéros qui sont générés. Représentant pré et post-migration images sont présentés dans la figure 3, avec des limites de la zone de zéro correspondant tel que défini par le logiciel d'imagerie. Figure 4 graphically illustre la capacité migratoire modifié vu dans LR-MSC après les dégâts avec 4% de CST. Dans la figure 4A et B, les zones à gratter de la moyenne calculée (en pixels) pour chacune des 4 rayures faites à travers une plaque de LR-CSM à 95% de confluence soit avant ou après la migration, avec l'exposition soit à 0% CST ou 4% CST sont comparées. Figure 4C compare la variation moyenne calculée dans la zone de zéro (zone de post-migration soustraite de la zone de pré-migration) dans LR-MSC exposés à 0% ou 4% CST, démontrant moins de migration (variation moyenne plus faible dans la zone de zéro ) après une exposition à 4% CST.
Figure 1: Corriger confluent est critique pour la génération de l'essai de zéro reproductible robuste. (A) murin LR-CSM à 95% de confluence, approprié pour scrRegarder la. (B) Un zéro réussi à 95% de confluence. (C) LR-CSM à 70% de confluence, trop faible pour une égratignure succès. (D) L'acquisition d'image à 70% de confluence peut produire de fausses limites. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Des images représentatives démontrant acquisition et d'analyse d'image (A) de l'image d'origine.. (B) l'image après l'application de l'outil «Trouver Edges" sous le menu "Action" (étape 4.2). (C) l'image qui suit le réglage de la barre de défilement "Couleur Seuil" (étape 4.3). (D) l'image après avoir exécuté le plugin MRI_Wound_Healing_Tool (étape 4.4). (E) Résultats fenêtre pop-up en évidence (encadré rouge) les numéros qui sont générés pour chaque zone. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Des images représentatives à partir de zéro dosage comparant rayés LR-MSC avant et après la migration (A) représentant l'image d'origine pré-migration.. (B) Esquisse d'calculée zone de zéro pré-migration. (C) représentant l'image d'origine post-migration. (D) Aperçu de la zone de zéro calculée post-migration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4: Les résultats représentatifs à partir de zéro dosage comparant la quantification de la zone de travail avant et après la migration LR-MSC, et l'exposition à 0% ou 4% CST. (A) de la représentation graphique de la surface moyenne de zéro calculée (en pixels) pour chacune des 4 rayures faites à travers une plaque de LR-CSM à 95% de confluence soit avant ou après la migration, à l'exposition à 0% CST, avec les données présentées comme moyenne et écart type. (B) Représentation graphique de la moyenne zone de zéro calculée (en pixels) pour chacune des 4 rayures faites à travers une plaque de LR-CSM à 95% de confluence soit avant ou après la migration, à l'exposition à 4% CST, avec les données présentées comme moyenne et écart type. (C) Comparaison de l'évolution moyenne calculée dans la zone scratch (migration post-pré) dans LR-MSC exposé à 0% ou 4% CST, démontrant moins de migration (variation moyenne plus faible dans scrzone atch) après une exposition à 4% CST, avec les données présentées sous forme de moyenne et l'écart type, * P = 2,99 x 10 -8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici offre une méthode quantitative robuste standardisée pour réaliser et analyser les tests de grattage. Dosages à gratter simples sont couramment utilisés dans de nombreux domaines d'étude pour examiner la migration cellulaire. Cependant, traditionnellement le dosage de zéro a manqué un set-up et la quantification protocole standardisé, qui a conduit à des problèmes avec la reproductibilité 7,10. Beaucoup de modifications et optimisations pour améliorer le dosage de zéro ont réduit ces questions, y compris l'imagerie individuelle des cellules vivantes, des essais à base d'arrêt-standardisés, et trois essais dimensions micro-pilier 4,8,10. Cependant, ces tests peuvent être difficiles à personnaliser ou d'adapter 10 et pour certaines applications, ces techniques peuvent aussi être prohibitif.
Pour produire un protocole d'essai normalisé de zéro, il ya plusieurs étapes critiques dans le protocole présentées ici qui nécessitent des informations spécifiques sur les cellules INVOLved, et l'optimisation du dosage en fonction des caractéristiques cellulaires pertinents. En particulier, il est important d'optimiser le nombre de cellules nécessaires et la durée de culture nécessaire pour atteindre une monocouche uniforme de 90 à 100% de confluence pour l'essai (étape 1.3 et l'étape 1.4). Avec trop peu de cellules (moins de 90% confluentes), les cellules ne seront pas former une monocouche suffisante. Non seulement cela affectera le microenvironnement cellulaire, mais il sera également affecter la capacité du logiciel d'imagerie pour identifier correctement les bords de la rayure. Par contre, trop de cellules de la monocouche (100% de confluence, cellules ou empilés) peuvent ainsi entraîner une inhibition de contact, et donc de modifier les caractéristiques de migration des cellules. Certaines variations du protocole de dosage de zéro recommandent la croissance des cellules à 100% de confluence et ne considèrent pas cette limitation potentiel de certaines cellules de contact sensibles tels que MSC 8. Les mêmes préoccupations devraient être appliquées à l'ampleur des dégâts qui est infliDECT sur les cellules (étape 1.5). Le protocole décrit ici est conçu pour évaluer les changements dans la migration cellulaire après les dommages causés par l'exposition à la fumée de cigarette soluble sur les cellules souches mésenchymateuses de capacité migrateurs, mais cet essai pourrait être tout aussi utile pour évaluer l'effet de différents types de dommages sur la migration cellulaire. Il est important que les dégâts affligés est suffisante pour fournir une distinction statistique entre les groupes expérimentaux et de contrôle. Cependant, trop de dégâts peut également conduire à la confluence des cellules réduite, qui encore une fois peut affecter la capacité du logiciel d'imagerie pour identifier correctement les bords de la rayure.
Tant la sénescence cellulaire et la prolifération cellulaire peuvent être des facteurs de confusion qui peut faussement modifier les résultats de l'essai de zéro. En particulier, la génération de la rayure doit être examinée attentivement pour éviter des dommages excessifs aux cellules environnantes qui pourraient résulter dans la sénescence. Gratter avec une pointe de pipette en plastique plutôt que d'un hypodermeic aiguille ou un scalpel évite l'excès de dommages tout en préservant l'intégrité de la surface de la plaque de la culture dans la zone de migration et de la matrice extracellulaire (Étape 2.1). En outre, la longueur de temps pendant laquelle la migration cellulaire est autorisé à se produire doit être soigneusement examiné afin d'éviter la prolifération cellulaire significative en tant que variable de confusion (étape 3.7). Pour l'analyse de la migration LR-MSC, 7 heures est optimal lors de l'évaluation des cellules endommagées avec le CST. Incubation des cellules pendant plus de 12 heures est généralement pas recommandée, mais cela peut ne pas appliquer à tous les types de cellules, en particulier ceux avec des taux de doublement très faibles. Pour évaluer à la fois la sénescence cellulaire et la prolifération cellulaire, une combinaison de sénescence associée à la bêta-galactosidase et BrDU ou EdU incorporation peut être effectuée sur les cellules à la fin de l'essai 19. Surtout, le protocole décrit ici est accessible à des laboratoires avec des capacités techniques limitées, nécessitant seulement une bonne qualité à contraste de phase inversé microscope et la caméra. leréactifs sont peu coûteux, et le logiciel d'imagerie est open source. Toutefois, afin de garantir des résultats optimaux à partir de cette analyse, y compris une bonne reproductibilité et la capacité d'effectuer une analyse statistique rigoureuse, l'optimisation minutieuse devrait être considérée pour chaque nouveau type de cellule ou de dommages expérimentale scénario qui est tentée.
Optimisations présentées dans cette adresse de protocole certaines des limitations présentes dans le travail déjà accompli pour normaliser les épreuves de grattage. Considérant que les protocoles d'essai de grattage prennent traditionnellement largeur mesures à gratter d'un instantané de la 8,9 de zéro, le protocole présenté ici utilise des mesures de la région à partir d'images prises sur toute la longueur de la rayure d'augmenter la rigueur statistique et de prendre en considération les incohérences dans la largeur de le scratch initial. Basé sur des tests répétés (données non présentées), la largeur de zéro ne peut pas être considérée comme parfaitement cohérente sur toute sa longueur. Après la migration, les bords de ee scratch devenir plus hétérogène, ce qui rend plus difficile de calculer avec précision une largeur de zéro, et en outre nécessite des calculs de superficie. Ce protocole utilise MRI_Wound_Healing_Tool, un programme informatique spécialisé, afin de réduire la subjectivité et d'accroître la cohérence dans l'analyse de la zone de zéro. Bien qu'il ne sait pas si les calculs de largeur simples pourraient donner des résultats suffisamment précis pour distinguer entre les différences subtiles dans la migration due au CST avant ou autre dommageable, ce protocole démontre cette sensibilité. Optimisations présentées dans ce protocole réorganiser le dosage de zéro commun pour répondre à ces limitations d'une manière économiquement viable, d'offrir des options de personnalisation, et de fournir des techniques supplémentaires pour démontrer la sensibilité et de valider les résultats.
Le dosage de zéro quantitative optimisé décrit dans ce protocole est encore limitée en considérant une population de cellules, plutôt que des cellules individuelles. Cette assum techniquees que la population de cellules est relativement homogène, et que cela se traduira par des caractéristiques de migration relativement homogènes. Selon l'application, il peut être plus pertinent de considérer la migration des cellules individuelles au lieu de 8. En outre, le protocole de dosage de zéro décrit ici est dépendante d'une population de cellules qui prolifèrent pas assez rapidement pour confondre analyse de la migration sur une période de 4-7 h. Les lignées cellulaires qui peuvent proliférer intensivement pendant cette courte période de temps ne serait pas approprié pour l'analyse en utilisant cette technique. Malgré ces limites, ce protocole d'analyse quantitative de zéro a le potentiel pour une utilisation dans de nombreuses applications différentes. Par exemple, un dosage à base de cellules peut endommagement être optimisée et ensuite utilisé pour évaluer la capacité de traitement en particulier pour limiter les dommages cellulaires. En variante, cet essai peut être utilisé avec des lignées cellulaires de cancer à évaluer des traitements potentiels pour limiter la capacité migratoire et le potentiel métastatique par conséquent, of ces cellules. Ce test de zéro optimisée est également encore limitée par d'éventuelles perturbations à le microenvironnement cellulaire qui sont inévitables dans la génération de la rayure. Cependant, en choisissant avec soin le niveau de la confluence des cellules, l'apoptose et l'augmentation de la production de feuilles de cellules qui ont partiellement séparés sur le bord de la rayure peut être évitée.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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