Summary
Chromatin immunoprecipitation डीएनए विवो में एराबिडोप्सिस प्रोटीन के बाध्यकारी साइटों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यह प्रक्रिया क्रोमेटिन पार से जोड़ने और विखंडन, ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ चयनात्मक एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation, और बाध्य डीएनए की qPCR विश्लेषण भी शामिल है। हम Arabidopsis पौधों के लिए अनुकूलित एक सरल चिप परख का वर्णन है।
Introduction
हाल के वर्षों के दौरान, आनुवंशिक आणविक और जीनोमिक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला के मॉडल प्रजातियों Arabidopsis thaliana में विकसित किया गया है। यह तकनीक संयंत्र विकास नियंत्रित किया जाता है कैसे को समझने में काफी प्रगति की है। एक मॉडल के रूप में एराबिडोप्सिस का उपयोग कर अध्ययन में विकास की प्रक्रिया के अलावा, फूल समय के आनुवंशिक नियंत्रण बड़े पैमाने पर विश्लेषण किया गया है। इन अध्ययनों से पौधों ऐसे हार्मोन और संयंत्र की उम्र के रूप में अंतर्जात संकेतों के जवाब में फूल की बहुत ठीक समय मिलाना पता चला है कि, और यह भी 1 मौसम के प्राकृतिक चक्र के साथ समय फूल सिंक्रनाइज़ ऐसे फोटो पीरियड और तापमान के रूप में पर्यावरण के संकेतों को, 2। फूल के समय में परिवर्तन के साथ एराबिडोप्सिस म्यूटेंट के अलगाव और लक्षण अंतर्जात और पर्यावरणीय कारकों के जवाब में फूल समय को नियंत्रित करने वाले जीन की एक जटिल नेटवर्क के अनावरण में निर्धारक किया गया है। ये आनुवंशिक सर्किट रहे हैंफूल के स्विच के रूप में काम करते हैं कि कुछ मास्टर जीन के स्तर पर एकीकृत, और फूलों की दीक्षा का सही समय फूल को बढ़ावा देने और पुष्प करनेवाला जीन 1,3 के अपस्ट्रीम है कि काम की गतिविधियों के दमन के संतुलन पर निर्भर करता है।
जीनोमिक दृष्टिकोण के हाल के उपयोग द्वारा सहायता प्राप्त फूल दीक्षा के नियंत्रण में उनकी भूमिका के लिए पहचान की जीन के कार्यात्मक विशेषताओं, फूल समय के मॉडुलन में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की केंद्रीय भूमिका को उजागर किया है। वास्तव में, फूल सांकेतिक शब्दों में बदलना प्रतिलेखन के मास्टर जीन की कई 4 कारकों। इसके अलावा, क्रोमेटिन पुर्ननिर्माण प्रोटीन परिसरों में से एक नंबर फूल के मास्टर जीनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है। उनकी बदल फूल समय के लिए पृथक एराबिडोप्सिस म्यूटेंट के एक नंबर क्रोमेटिन संशोधक की एक किस्म एन्कोडिंग जीन में म्यूटेशन ले जाने के लिए निकला। Histon में posttranslational संशोधनों से शुरू होने वाले विभिन्न क्रोमेटिन remodelersई पूंछ, डीएनए के सापेक्ष nucleosomes स्थान या एराबिडोप्सिस 5,6 में फूल का उचित नियमन के लिए हिस्टोन वेरिएंट द्वारा आवश्यक विहित histones रहे हैं विनिमय। इन क्रोमेटिन पुनर्गठन गतिविधियों के कुछ बयान या ऐसे विशिष्ट हिस्टोन अवशेषों में एसिटिलीकरण या मिथाइलेशन के रूप में सहसंयोजक संशोधनों को हटाने के लिए उत्प्रेरित। ये हिस्टोन के निशान विशेष रूप से फूल जीन के गतिविधि को विनियमित करने के लिए अन्य क्रोमेटिन remodeling के परिसरों, प्रतिलेखन कारक या ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी के घटकों की भर्ती कि विशेष प्रभावोत्पादक द्वारा मान्यता प्राप्त हैं।
Chromatin immunoprecipitation (चिप) में विवो डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के हित के लिए साइटों (चित्रा 1) की पहचान की अनुमति देता। इस प्रक्रिया के डीएनए के लिए पार से लिंक करने के लिए कुछ रसायनों की क्षमता की वजह से प्रोटीन लाभ लेता है। जिसके परिणामस्वरूप डीएनए प्रोटीन परिसरों तो विशिष्ट एंटीबॉडी आगा का उपयोग करके immunoprecipitated किया जा सकताइंस्ट प्रतिलेखन कारक है, क्रोमेटिन बाध्यकारी प्रोटीन, या विशेष संशोधनों और heterologous एपिटोप्स पसंद के प्रोटीन से जुड़ी (आमतौर पर "टैग" के रूप में करने के लिए कहा गया है)। इन immunoprecipitates से शुद्ध डीएनए ब्याज की विशेष दृश्यों के संवर्धन के लिए आकलन करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्रतिक्रियाओं में एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह, प्रतिलेखन कारक के बंधन साइटों या विशेष जीन में हिस्टोन के निशान से वितरण 7.8 स्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण सक्षम बनाता है कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के साथ संयुक्त, चिप प्रौद्योगिकी प्रतिलेखन कारक के बाध्यकारी साइटों के साथ-साथ हिस्टोन संशोधनों के अनावरण Epigenomic परिदृश्य के जीनोम चौड़ा पहचान संभव बना दिया है। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति का एक साथ विश्लेषण ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के बंधन या विशेष हिस्टोन के निशान के बयान ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों के साथ संबंध स्थापित कैसे निगरानी की अनुमति देता हैजीन 9 के ty।
एराबिडोप्सिस में चिप प्रोटोकॉल का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों की एक किस्म क्रोमेटिन फूल के मास्टर जीन के संगठन और कैसे इन संरचनात्मक परिवर्तन जीन अभिव्यक्ति 5,6 प्रभाव पर है कि प्रभाव का आकलन करने की अनुमति दी है। पिछले परिणाम ही दिनों में एराबिडोप्सिस ठिकाना जल्दी पेंच (ईबीएस) इस जीन शो में फूल और फूल एफटी के मास्टर जीन की अपरेगुलेशन की एक त्वरण फूल और म्यूटेंट के एक repressor के रूप में कार्य करता है कि पता चला है। इसके अलावा, एफटी में नुकसान के समारोह के म्यूटेशन को पूरी तरह से एफटी ईबीएस म्यूटेंट के समय से पहले फूल के लिए और ईबीएस 10 फूल के इस मास्टर जीन के दमन के लिए आवश्यक है कि आवश्यक है यह दर्शाता है कि ईबीएस उत्परिवर्ती पौधों की जल्दी फूल फेनोटाइप को दबाने 11। ईबीएस विशेष हिस्टोन H3 di- बाँध और वीं में trimethylated सकता है कि एक पीएचडी युक्त प्रोटीन को कूटबद्धएफटी 12 के क्रोमेटिन की मध्यस्थता दमन में ईबीएस के लिए एक भूमिका सुझाव ई लाइसिन 4 छाछ (/ 3 H3K4me2),। चिप दृष्टिकोण का उपयोग एराबिडोप्सिस पीएचडी युक्त प्रोटीन ईबीएस 10,11 अपनी अभिव्यक्ति 12 को दबाने के लिए पुष्प करनेवाला जीन एफटी की विनियामक क्षेत्रों कि बांध का प्रदर्शन किया। चिप प्रौद्योगिकी के उपयोग के माध्यम से प्राप्त अतिरिक्त डेटा इस प्रोटीन एराबिडोप्सिस विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान फूल के इस मास्टर जीन की क्रोमेटिन में हिस्टोन एसिटिलीकरण, सक्रिय प्रतिलेखन की एक बानगी के निम्न स्तर को बनाए रखने के लिए आवश्यक है कि पता चला है। एक साथ आनुवंशिक और जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ इन टिप्पणियों, इस एराबिडोप्सिस पीएचडी युक्त प्रोटीन पुष्प करनेवाला जीन एफटी 12 की अभिव्यक्ति के नियमन से फूल समय के ठीक ट्यूनिंग में एक केंद्रीय भूमिका है कि प्रदर्शित करता है। यहां प्रस्तुत काम histones के विश्लेषण के लिए बल्कि अन्य के लिए न केवल उपयोगी एक अनुकूलित तरीका प्रदान करता हैक्रोमेटिन प्रोटीन जुड़े, और वृद्धि की दक्षता के साथ और प्रयोगात्मक समय कम कर दिया। इसके अलावा, इस रिपोर्ट चिप प्रोटोकॉल का उपयोग एराबिडोप्सिस में फूल की शुरुआत पर जीन अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के प्रभाव के इन क्रोमेटिन की मध्यस्थता तंत्र क्रोमेटिन संशोधनों में परिवर्तन और संयंत्र जीन के राज्यों के बीच संबंधों में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और कैसे है कि कैसे दिखाता है।
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Protocol
संयंत्र सामग्री के 1. Crosslinking (1 घंटा)
- एराबिडोप्सिस प्रयोग में इस्तेमाल लाइनों बढ़ने (- गुम्मट - जंगली प्रकार म्यूटेंट बनाम, और / या टैग व्यक्त लाइनों बनाम अपने हित के प्रोटीन के टैग किया संस्करण व्यक्त लाइनों किसी भी प्रोटीन के लिए जुड़े हुए नहीं) बड़े पेट्री डिश पर 12-18 दिनों के लिए (150 मिमी) एमएस अगर मध्यम (1 एल: 1x Murashige और Skoog लवण, 10 ग्राम सुक्रोज, 0.5 ग्राम एमईएस, पीएच 5.7 (KOH), 1% अगर) के साथ। मिट्टी और vermiculite का एक मिश्रण: वैकल्पिक रूप से, 3 से युक्त बर्तन पर पौधों को विकसित।
चेतावनी! संक्रामक त्वचा के साथ संपर्क में है और अगर निगल लिया, साँस लेना द्वारा विषाक्त है, और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने एक रासायनिक हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए। 1.2 कदम - 1.6 धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए। - एक प्रयोगशाला बर्नर गर्म सुई के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब के ढक्कन में छोटे छेद बनाओ। 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पीबीएस के 40 मिलीलीटर बफर जोड़ें और formaldehyde के 1.08 मिलीलीटर (शेयर 37% रोंolution)। उन 50 मिलीलीटर ट्यूब में संयंत्र सामग्री की 1.5 ग्राम लीजिए। तिर्यक के दौरान बर्फ पर ट्यूबों रखें।
- ढक्कन के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब बंद करें। Desiccator में ट्यूबों प्लेस और वैक्यूम लागू होते हैं। वैक्यूम तो 10 मिनट के लिए ऊतक घुसपैठ समाधान ऊपर मंथन को रोकने के लिए, ध्यान से निर्वात जारी। नमूना मिलाएं। दो बार दोहराएँ। घुसपैठ के बाद संयंत्र सामग्री का निरीक्षण और यह थोड़ा पारदर्शी हो जाता है कि इस बात की पुष्टि और ट्यूब (चित्रा 2) के नीचे डूब जाते हैं।
- 5 मिनट के लिए वैक्यूम लागू 0.125 एम के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 2 एम ग्लाइसिन के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। ग्लाइसिन फॉर्मेल्डीहाइड तिर्यक की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला के रूप में कार्य करता है।
- ढक्कन में छेद के साथ बंद 50 मिलीलीटर ट्यूब inverting द्वारा पीबीएस फॉर्मेल्डीहाइड ग्लाइसिन समाधान त्यागें।
- 1.5 चरण में वर्णित के रूप में पानी धोने के समाधान को खारिज करने के साथ दो बार 1x पीबीएस के साथ और एक बार पौधे कुल्ला। एक कागज तौलिया पर उन्हें सूखी और तरल nitroge में फ्रीजएन।
नोट: जमे हुए ऊतक सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
एंटीबॉडी का 2. तैयारी (1 दिन)
नोट: immunoprecipitation के लिए, एक प्रोटीन जी या प्रोटीन एंटीबॉडी भारी श्रृंखला के लगातार डोमेन के लिए उच्च आत्मीयता के साथ एक linker के माध्यम से एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के उपयोग की सिफारिश की है। डीएनए प्रोटीन परिसरों मोती एंटीबॉडी conjugates की सतह के लिए unspecifically संलग्न कर सकते हैं। कारण है कि, यह बाध्यकारी गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि यों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के बिना नियंत्रण के प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है।
- प्रत्येक immunoprecipitation के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में चुंबकीय मोतियों की 15 μl तैयार करते हैं। मोतियों की राशि immunoprecipitation के लिए और भी एंटीबॉडी पर इस्तेमाल किया क्रोमेटिन की मात्रा पर निर्भर करता है।
- तू, मोती के लिए chromatin immunoprecipitation (चिप) कमजोर पड़ने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने रोटेशन द्वारा मिश्रण और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge जगह, धोने के लिएएक चुंबकीय रैक में हो। मोती चुंबक के लिए देते हैं यह बताने के लिए लगभग 1 मिनट रुको। रैक में अभी भी 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के साथ, pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। दो बार दोहराएँ।
नोट: मोती और एंटीबॉडी (अब) और एक दूसरे का कोई एंटीबॉडी केवल चुंबकीय मोतियों के साथ (कोई अटल बिहारी) पर नियंत्रण के साथ एक: दो immunoprecipitation के सेट की जरूरत है प्रत्येक संयंत्र लाइन के लिए। - चिप कमजोर पड़ने बफर के 200 μl में मोती Resuspend। (सटीक कमजोर पड़ने प्रत्येक एबी के लिए अलग है और प्रयोगात्मक अनुकूलित किया जाना है या वाणिज्यिक, एंटीबॉडी के मामले में निर्माता के निर्देशों का पालन करें) प्रत्येक संयंत्र लाइन के लिए तैयार दो ट्यूबों में से एक के लिए विशिष्ट Ab के लिए आवश्यक राशि जोड़ें। Immunoprecipitation के लिए इस नमूने का प्रयोग करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा जो अन्य ट्यूब, के लिए unspecific आईजीजी की एक ही राशि जोड़ें।
- एंटीबॉडी मोतियों को देते हैं यह बताने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर हे / एन सेते हैं।
3. Chromatin निष्कर्षण (4 घंटा)
नोट: इस चरण में, नाभिक और सभी अंगों गोली जाएगा। ExB एक उच्च घनत्व प्रदान करते हैं और organelle संरचना के विघटन को रोकने के लिए पर्याप्त सुक्रोज में शामिल है।
नोट: ExB 2 1% ट्राइटन X-100 खुला क्लोरोप्लास्ट फट और क्लोरोफिल को हटाने में मदद करने के लिए होता है।
नोट: यह कदम नमूना से डिटर्जेंट को हटाने में मदद करता है।
नोट: यहबफर नाभिक lyse और क्रोमेटिन जारी करने के लिए, एसडीएस में शामिल है।
चेतावनी! अल्ट्रासाउंड डिवाइस एक ध्वनिरहित कैबिनेट में निहित नहीं है, मामले में sonication चरण के दौरान कान सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए सुनिश्चित करें।
महत्वपूर्ण कदम! क्रोमेटिन विखंडन काफी हद तक sonication के उपकरणों पर निर्भर करता है। sonication की स्थिति उचित डीएनए आकारों में संवर्धन के लक्ष्य को हासिल करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। देखनाक्रोमेटिन विखंडन अनुकूलन करने के लिए कैसे का एक उदाहरण के लिए चित्रा 3।
नोट: नमूने जमे हुए हैं और कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
ब्याज की प्रोटीन और डीएनए के बचाव के 4. Immunoprecipitation (1 दिन, 3 घंटा)
- 2.2 कदम के रूप में वर्णित एंटीबॉडी से अधिक दूर करने के लिए चिप कमजोर पड़ने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कदम से 2.4 तीन बार एबी के साथ लिपटे मोतियों को धो लें। चिप कमजोर पड़ने बफर के 200 μl में Resuspend। पृथक क्रोमेटिन के 50 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर हे / एन सेते हैं।
नोट: concentrati चेकmicrovolume यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्रोमेटिन की पर। पृथक क्रोमेटिन के 50 μl डीएनए के 10 से अधिक ग्राम को शामिल करना चाहिए। - 4 डिग्री सेल्सियस में कदम 4.2-4.5 काम के लिए। 2.2 चरण में वर्णित के रूप में कम नमक धुलाई बफर के 1 मिलीलीटर में मोती दो बार धो लें।
- उच्च नमक धुलाई बफर के 1 मिलीलीटर में एक बार मोती धो लें।
- LiCl धुलाई बफर के 1 मिलीलीटर में एक बार मोती धो लें।
- ते बफर के 1 मिलीलीटर में मोती दो बार धो लें। पिछले धोने के बाद पूरी तरह से एक विंदुक के साथ आकांक्षा द्वारा ट्यूब में छोड़ ते बफर दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
- इनपुट के नमूने (कदम 3.9) बाहर ले जाओ। एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण इनपुट के 5 μl और चिप के नमूनों के साथ के रूप में जारी है। 5% chelating आयन एक्सचेंज राल के 200 μl जोड़कर तिर्यक उल्टा है, और हर 2-3 मिनट मिलाते हुए 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। 30 सेकंड के लिए 16,000 XG पर स्पिन और ध्यान से pipetting द्वारा एक नया microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
नोट: टीआरए जबकिउत्क्रमण crosslinking के लिए पारंपरिक विधि इसलिए प्रोटोकॉल एक दिन में कम कर रही है, कुशल decrosslinking और 10 मिनट में डीएनए के क्षालन के लिए अनुमति देता है सोडियम क्लोराइड, 95 डिग्री सेल्सियस पर एक chelating आयन राल के साथ ऊष्मायन के साथ एक हे / एन ऊष्मायन शामिल है। - Proteinase कश्मीर के 2 μl (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और 30 मिनट के प्रोटीन को पचाने और डीएनए को रिहा करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो।
- जल्दी से 30 सेकंड के लिए 16,000 XG पर स्पिन और pipetting द्वारा एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
- डीएनए एक मानक डीएनए टुकड़े शुद्धि किट का उपयोग कर पृथक साफ करें।
नोट: निर्माता के निर्देशों के अनुसार आगे बढ़ें। - एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब किट से डीएनए बाध्यकारी स्तंभ स्थानांतरण। स्तंभ के केंद्र के लिए DNase मुक्त पानी की 20 μl जोड़ने और 60 सेकंड के लिए 16,000 XG पर कताई द्वारा शुद्ध डीएनए Elute। बिंदु बंद करो: नमूने कई हफ्तों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। 5. qPCR द्वारा immunoprecipitated डीएनए में बाध्यकारी साइटों की बहुतायत मापने (4 घंटा)
- 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान के पिघलने (टीएम) और 30% -80% की एक जीसी सामग्री के साथ ब्याज की जीनोमिक क्षेत्रों के लिए डिजाइन प्राइमरों। क्रोमेटिन sonication द्वारा खंडित है, के रूप में परिलक्षित अनुक्रम की लंबाई 150-200 न्यूक्लियोटाइड (तालिका 1) की तुलना में अब नहीं होना चाहिए।
नोट: प्रथम डिजाइन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्राइमर 3 कार्यक्रम है (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)। प्रथम डिजाइन के लिए अतिरिक्त दिशानिर्देश 14,15, पिछली रिपोर्टों 8 में उपलब्ध हैं। - प्राइमरों विशिष्ट हैं यह सुनिश्चित करने के लिए एक विस्फोट प्रोग्राम का उपयोग करें (विशेष रूप से प्रमोटरों दृश्यों बाध्यकारी समान टीएफ साझा कर सकते हैं) और प्राइमर दक्षता usin का परीक्षणजी इनपुट डीएनए (कदम 4.9) के पानी में 1:10 dilutions। जीनोम के कुछ क्षेत्रों को दूसरों से बेहतर शुद्ध हो जाएगा। यह पीसीआर प्राइमरों डिजाइन और पतला इनपुट डीएनए पर उन्हें जांच करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।
- प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए एक पीसीआर ट्यूब में पानी और पिपेट से पतला डीएनए के 5 μl शुद्ध डीएनए 01:10 पतला।
नोट: डीएनए 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब की दीवारों को संलग्न कर सकते हैं, के रूप में की जरूरत ही राशि पतला। एकाधिक विगलन ठंड चक्र जुड़ी डीएनए अणु की संख्या में वृद्धि। इनपुट में प्रत्येक प्राइमर जोड़ी, प्रवर्धन के लिए, अब चिप और कोई अटल बिहारी चिप विश्लेषण होना है। - पीसीआर मिश्रण को पूरा करने के लिए, 1x के अंतिम एकाग्रता के लिए SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिश्रण जोड़ने के लिए, और प्रत्येक प्राइमर के 0.5 माइक्रोन। DNase मुक्त पानी के साथ 20 μl को भरें।
- SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिश्रण निर्माता के निर्देशों का पालन qPCR प्रतिक्रिया प्रदर्शन।
- गुना संवर्धन विधि से डेटा विश्लेषण।
- QPCR प्रतिक्रिया के बाद प्राप्त किया गया है कि नमूने के नाम और कच्चे सीटी मूल्यों के साथ एक स्प्रेडशीट बनाएं।
- प्रत्येक नमूने के लिए, अपने कच्चे सीटी मूल्य से इसी कोई अटल बिहारी नियंत्रण के लिए प्राप्त कच्चे सीटी मूल्य घटाना। नोट: इस गणितीय आपरेशन के बाद, कोई अटल बिहारी नमूना के लिए सीटी मान 0 के बराबर होगा।
- आधार 2 और कदम 6.1.2 (तालिका 2) में प्राप्त नकारात्मक शेष के बराबर प्रतिपादक (शक्ति) के साथ घातांक आपरेशन द्वारा गुना संवर्धन की गणना।
संवर्धन गुना = 2 - (सीटी (नमूना) - सीटी (कोई अटल बिहारी))
नोट: इस metho मेंडी चिप एड नमूने में एक विशिष्ट डीएनए टुकड़ा की बहुतायत नहीं, अब नियंत्रण में यह टुकड़ा की बहुतायत के साथ तुलना की जाती है। इस पद्धति की धारणा पृष्ठभूमि संकेत के स्तर अलग प्राइमर सेट, नमूने, और दोहराने के प्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, इस'noise' संकेत स्तर प्राइमर सेट, नमूने, और प्रयोगों के बीच भिन्न है।
- इनपुट विधि के% से डेटा विश्लेषण।
- नमूने के नाम और qPCR प्रतिक्रिया के बाद उनके लिए प्राप्त किया गया है कि कच्चे सीटी मूल्यों के साथ एक स्प्रेडशीट बनाएं।
- एक निवेश के रूप में लिया गया था कि कुल निकाले क्रोमेटिन के अंश से लघुगणक आधार 2 के एक मूल्य को घटाकर की इनपुट के नमूने के लिए कच्चे सीटी मूल्यों को समायोजित करें।
नोट: कुल क्रोमेटिन की एक 10% इस प्रोटोकॉल में एक निवेश के रूप में लिया गया था के रूप में घटाया मूल्य, 3.32 के बराबर होती है इस प्रोटोकॉल में। लॉग-2 (10) के 3.32 के बराबर होती है। - 100 से ख के साथ घातांक आपरेशन के मूल्य गुणा करके इनपुट के% की गणनाएएसई 2 और नमूना (3 टेबल) के कच्चे सीटी मूल्यों से घटाया समायोजित इनपुट मूल्यों के शेष के बराबर प्रतिपादक (बिजली)।
इनपुट के% = 100 * 2 (समायोजित इनपुट - सीटी (नमूना))
नोट: इस प्रक्रिया के साथ, कुल पृथक क्रोमेटिन (इनपुट नमूना) के लिए चिप एड नमूने में विशिष्ट डीएनए बहुतायत के बीच संबंध गणना की जाती है। चिप डेटा विश्लेषण पर आगे की जानकारी हैरिंग एट अल। 8 में पाया जा सकता है।
नोट: उपजी क्रोमेटिन से अलग डीएनए इसकी वजह से ब्याज की प्रोटीन के लिए बाध्य करने के लिए, कुल क्रोमेटिन से चिप-एड किया गया है जो डीएनए टुकड़े का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया जाना है।
6. डेटा विश्लेषण
नोट: पूर्व के बीच मेंचिप डेटा का विश्लेषण करने के तरीके isting, दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है। उनमें से पहले भी 'नो एंटीबॉडी नियंत्रण के सापेक्ष' 'रिश्तेदार संवर्धन', 'पृष्ठभूमि पर' संकेत या के रूप में नामित गुना संवर्धन विधि है। दूसरी विधि "इनपुट के%" के रूप में नामित किया गया है।
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Representative Results
आठ मुख्य कदम बढ़ रही है और संयंत्र सामग्री, क्रोमेटिन के पार से जोड़ने, क्रोमेटिन अलगाव, क्रोमेटिन विखंडन, डीएनए और बीच परिसरों के चुनिंदा अलगाव की कटाई सहित इन विवो प्रोटीन डीएनए बातचीत, की पहचान के लिए इस चिप प्रोटोकॉल में अकेले बाहर किया जा सकता है immunoprecipitation, प्रोटीन पाचन, डीएनए शुद्धि, और qPCR विश्लेषण (चित्रा 1) द्वारा ब्याज की प्रोटीन। चिप प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एक पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया में डीएनए, प्रोटीन बातचीत का निर्धारण है। आमतौर पर, formaldehyde के पार से जोड़ने संयंत्र चिप में प्रयोग किया जाता है। : संक्रामक ऊतक प्रवेश और डीएनए 1 से 6 में राष्ट्रीय राजमार्ग 2 प्रोटीन का समूह या प्रोटीन और न्यूक्लियोटाइड के बीच methylene पुलों बनाता है। विवो में nucleoprotein परिसरों के एक कुशल निर्धारण फॉर्मेल्डीहाइड संयंत्र नाभिक के भीतर क्रोमेटिन पहुंचता है कि आवश्यकता है, और यह है कि संयंत्र के ऊतकों को पूरी तरह से टी में डूबे हुए है आवश्यक हैवह formaldehyde के बफर immunoprecipitation के दौरान प्रोटीन डीएनए परिसरों को प्रभावी ढंग से नीचे खींच रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए। एराबिडोप्सिस पत्तियों मोम परतों में कवर कर रहे हैं मुश्किल है कि कोशिकाओं में crosslinking एजेंट का अंतर्वेधन। इसके अलावा, ट्राईकोम्स संयंत्र के ऊतकों के अंदर से हो रही formaldehyde समाधान रोकने, पत्तियों की सतह पर हवा के बुलबुले के गठन के पक्ष में हैं। इस कदम वैक्यूम निर्धारण समाधान में बुलबुले के गठन को रोकने और सभी कोशिकाओं के नाभिक में formaldehyde के प्रवेश में सुधार, नमूने के लिए आवेदन किया है, इस सीमा को पार करने के लिए। कुशल पार से जोड़ने के इलाज के बाद Seedlings चित्रा 2 पर दिखाए जाते हैं।
चिप प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम क्रोमेटिन बाल काटना है। बड़े chromatin टुकड़े डीएनए अनुक्रम में ब्याज की प्रोटीन की बाध्यकारी साइटों के कम संकल्प मानचित्रण में परिणाम कर सकते हैं। इसके विपरीत, बहुत छोटे से टुकड़े के कुशल प्रवर्धन रोका जा सकता हैqPCR से बंधे डीएनए। अनुभवजन्य अनुभव के अनुसार, चिप विश्लेषण के लिए इष्टतम क्रोमेटिन आकार सीमा होती है। प्रयोगशाला में उपलब्ध sonication डिवाइस के आधार पर स्थापित किया जाना है क्रोमेटिन की उचित विखंडन को प्राप्त करने के लिए 200 और 600 बी पी, और शर्तों के बीच होना 3 दिखाता आंकड़ा चाहिए प्रक्रिया डीएनए आकार के वांछित सीमा में अधिकतम संवर्धन प्राप्त करने के लिए क्रोमेटिन बाल काटना अनुकूलन करने के लिए। Sonication से पहले, क्रोमेटिन मुख्य रूप से बहुत बड़े टुकड़े के होते हैं। Sonication के चक्रों की संख्या में वृद्धि उत्तरोत्तर 20-30 चक्र (प्रोटोकॉल की धारा 3.8 और चित्रा 3) के बाद 200-600 बीपी की रेंज में इष्टतम संवर्धन तक पहुंच गया, चिप नमूने में डीएनए का औसत आकार कम कर देता है।
इधर, पुष्प करनेवाला एफटी की नियामक क्षेत्रों के लिए बाध्यकारी साइटों ईबीएस प्रोटीन की पहचान चिप तकनीक की उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। करने के लिए टी ईबीएस के बंधनवह एफटी ठिकाना मूल निवासी ईबीएस प्रमोटर (pEBS :: cMyc-ईबीएस) के नियंत्रण में एक cMyc-ईबीएस संलयन प्रोटीन व्यक्त एराबिडोप्सिस लाइनों के साथ चिप assays के माध्यम से सुलझाया गया था। इस निर्माण व्यक्त ईबीएस उत्परिवर्ती पौधों की जंगली प्रकार phenotype के रूप में दिखाया ईबीएस के इस टैग किया संस्करण को पूरी तरह कार्यात्मक है। जीनोमिक एफटी ठिकाना भीतर चार क्षेत्रों ईबीएस बाइंडिंग के लिए परीक्षण किया गया; जीन ट्रांसक्रिप्शनल शुरू साइट के आसपास (एफटीआईआई), दो (FTIV, FTVI), और एफटी (FTVII) (चित्रा 4 ए) के पहले Intron में एक दूसरे के प्रमोटर क्षेत्र में एक। चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, चिप परिणाम ईबीएस प्रोटीन एफटी 12 फूल के मास्टर जीन की ट्रांसक्रिप्शनल शुरू साइट के लिए करीब एक नियामक अनुक्रम बाध्य कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, ईबीएस प्रोटीन इन विट्रो में और इस तरह के HDA6, विनियमन में शामिल एक और क्रोमेटिन से संबंधित प्रोटीन के रूप में हिस्टोन deacetylases साथ विवो दोनों में बातचीत कर सकते हैंएराबिडोप्सिस 1 से 7 में समय फूल की। एफटी की जीनोमिक क्षेत्र में हिस्टोन एसिटिलीकरण के स्तर पर ईबीएस के संभावित प्रभाव का आकलन करने के लिए, चिप assays lysines 9 और 14 में acetylated हिस्टोन H3 के खिलाफ निर्देशित एक एंटीबॉडी का उपयोग प्रदर्शन किया गया, एक हिस्टोन निशान transcriptionally सक्रिय क्रोमेटिन के साथ सहसंबद्ध 1 2 । इसके अलावा, इन डेटा चिप दृष्टिकोण संयंत्र विकास की प्रक्रिया की ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन मिलाना कि आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला करने के लिए योगदान कर सकते हैं वर्णन कैसे।
Chromatin immunoprecipitation प्रोटोकॉल। चिप की चित्रा 1. योजना सामान्यतः एक रासायनिक यौगिक द्वारा तय प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल एक तकनीक है। संरक्षित बातचीत के साथ क्रोमेटिन नाभिक और खंडित से अलग है। ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके,हम इसे से जुड़ी डीएनए के टुकड़े का चयन कर सकते हैं। एंटीबॉडी एक चुंबकीय रैक का उपयोग कर तेज और सरल अलगाव को सक्षम है कि चुंबकीय मोती संयुग्मित है। अगले चरण में, प्रोटीन proteinase उपचार से हटा रहे हैं और डीएनए जारी की है। शुद्ध डीएनए टुकड़े तो उनके रिश्तेदार बहुतायत को मापने के लिए qPCR प्रतिक्रियाओं में टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा formaldehyde के साथ पार से जोड़ने के बाद एक ऊतक के 2. उदाहरण। है विवो परिसरों में, डीएनए और प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच के क्रम में प्रोटोकॉल के कई चरणों के माध्यम से उन्हें स्थिर और टिकाऊ बनाने के लिए तय किया जाना है। प्रोटोकॉल के इस संस्करण में, निर्धारण formaldehyde के उपचार के द्वारा होता है। Formaldehyde के लिए thr के कुशल पैठough ऊतक चिप विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। (ए) संयंत्र सामग्री समाधान की सतह पर तैरता है और छोटे हवाई बुलबुले के साथ कवर किया जाता है पार से जोड़ने कदम से पहले; पत्तियों के abaxial और adaxial सतहों रंग में मतभेद है। निर्धारण के बाद (बी), पौधे दिख समाधान में भिगो किया जाना चाहिए, थोड़ा पारदर्शी, और समान रूप से तिर्यक समाधान में डूब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चिप विश्लेषण के लिए sonication शर्तों 3. अनुकूलन। Chromatin तय सामग्री से अलग आंकड़ा बेहद लंबी क्रोमेटिन आकार (बाईं ओर दूसरी पंक्ति) का प्रतिनिधित्व जेल के शीर्ष पर एक मजबूत बैंड के साथ लंबाई के टुकड़े की व्यापक रेंज के होते हैं। Increa के साथsonication के चक्रों की संख्या गाते हैं, chromatin टुकड़े आकार के चोटी के छोटे टुकड़े करने की दिशा में स्थानांतरित कर दिया है। दिखाया प्रयोग में, इष्टतम चक्र संख्या जिसके बाद 200 से 600 बीपी को लेकर इष्टतम chromatin टुकड़े चिप नमूने में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, 20 और 30 के बीच बदलती हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4 चिप ईबीएस एफटी बांध और म्यूटेशन इस पुष्प करनेवाला जीन में हिस्टोन H3 एसिटिलीकरण के स्तर में परिवर्तन ईबीएस कि शो का विश्लेषण करती है। एक्सॉनों का प्रतिनिधित्व काले बक्से के साथ एफटी (ए) जीनोमिक क्षेत्र। इस पुष्प करनेवाला जीन की विनियामक क्षेत्रों में फैले चार टुकड़े परीक्षण किया गया (ग्रेविशिष्ट qPCR प्राइमरों डिजाइन द्वारा बक्से)। (बी) ईबीएस ट्रांसक्रिप्शनल शुरू साइट के करीब स्थित एफटी चतुर्थ क्षेत्र, बांधता है। MYC-ईबीएस ईबीएस के cMyc टैग संस्करण व्यक्त उत्परिवर्ती पौधों ईबीएस से मेल खाती है; MYC cMyc व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों किसी भी एराबिडोप्सिस जीन से जुड़े हुए नहीं मिलान अर्थ। (सी) ईबीएस उत्परिवर्ती पौधों का मूल्यांकन सभी चार फुट क्षेत्रों में जंगली प्रकार लैंड्सबर्ग erecta (एल ईआर) की तुलना में H3K9,14Ac के उच्च बहुतायत प्रदर्शित करते हैं। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (बी और सी) दिखा। संयंत्र सेल में पहले से प्रकाशित आंकड़ों से संशोधित 1 2। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| आगे | रिवर्स | क्षेत्र का परीक्षण किया |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | एफटी द्वितीय |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | एफटी चतुर्थ |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | एफटी छठी |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | एफटी सातवीं |
इस अध्ययन में इस्तेमाल तालिका 1 प्राइमरों।
| नमूना | कच्चे सीटी मूल्यों | सीटी सीटी (कोई अटल बिहारी) | गुना संवर्धन 2 - (सीटी (नमूना) - सीटी (कोई अटल बिहारी)) |
| कोई अटल बिहारी | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5.3 | 39.4 |
कोई अटल बिहारी नमूने के लिए विधि "संवर्धन गुना"। सीटी मूल्यों से चिप डेटा विश्लेषण की तालिका 2 उदाहरण अटल बिहारी / चुंबकीय मोतियों को डीएनए के unspecific बाध्यकारी की वजह से पृष्ठभूमि संकेत प्रतिनिधित्व करते हैं। ये सीटी मूल्यों कोई अटल बिहारी और अब नमूने की सीटी मूल्यों के बीच 30 अंतर 1 से अधिक होना चाहिए से अधिक होना चाहिए।
| चरण 1 - इनपुट समायोजित करें | |||
| समायोजित इनपुट = कच्चे सीटी (इनपुट) - 2 लॉग (कुल क्रोमेटिन के अंश) | |||
| कच्चे सीटी | कुल क्रोमेटिन से इनपुट | 2 10 लॉग | |
| इनपुट | 29.5 | 10% | 3.32 |
| समायोजित इनपुट = 29.5-3.32 = 26.18 | |||
| चरण 2 - इनपुट गणना की% | |||
| नमूना | कच्चे सीटी | सीटी (समायोजित इनपुट) -Ct (नमूना) | 2 सीटी (समायोजित इनपुट) -Ct (नमूना) * 100% |
| इनपुट | 26.18 | ||
| चिप-AB | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| कोई अटल बिहारी | 34.5 | -8.32 | 0.31 |
"% इनपुट की" विधि द्वारा चिप डेटा विश्लेषण के पटल 3. उदाहरण। आदानों नाभिक से अलग कुल पार से जुड़े क्रोमेटिन का प्रतिनिधित्व करते हैं, तो सीटी मूल्यों सभी प्राइमर जोड़े के लिए बराबर होना चाहिए। पारंपरिक, 5% या कुल क्रोमेटिन का 10% एक निवेश के रूप में लिया जाता है। Interes के प्रोटीन या टैग के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी से लेपित नहीं मोती - नहीं, अब एक नकारात्मक नियंत्रण के नमूने का प्रतिनिधित्वटी। चिप Ab प्रोटीन या ब्याज के टैग के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation के बाद नमूना के लिए खड़ा है।
| पीबीएस 10x |
| 1.3 एम NaCl |
| 30 मिमी ना 2 4 HPO |
| 30 मिमी नः 2 4 पीओ |
| पीएच 7 |
| निष्कर्षण बफर 1 (ExB 1) |
| 0.4 एम सुक्रोज |
| 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 10 मिमी MgCl |
| 5 मिमी β-mercaptoethanol |
| प्रोटीज इनहिबिटर्स |
| निष्कर्षण बफर 2 (ExB 2) |
| 0.25 एम सुक्रोज |
| 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 10 मिमी 2 MgCl |
| 1% ट्राइटन X-100 </ टीडी> |
| 5 मिमी β-mercaptoethanol |
| प्रोटीज इनहिबिटर्स |
| निष्कर्षण बफर 3 (ExB 3) |
| 1.7 एम सुक्रोज |
| 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 0.15% ट्राइटन X-100 |
| 2 मिमी 2 MgCl |
| 5 मिमी β-mercaptoethanol |
| प्रोटीज इनहिबिटर्स |
| Sonication बफर |
| 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 10 मिमी EDTA |
| 1% एसडीएस |
| प्रोटीज इनहिबिटर्स |
| चिप कमजोर पड़ने बफर |
| 1.1% ट्राइटन X-100 |
| 1.2 मिमी EDTA |
| 16.7 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 167 मिमी NaCl |
| प्रोटीज इनहिबिटर्स |
| कम नमक बफर |
| 150 मिमी NaCl |
| 0.1% एसडीएस |
| 1% ट्राइटन X-100 |
| 2 मिमी EDTA |
| 20 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| उच्च नमक धुलाई बफर |
| 500 मिमी NaCl |
| 0.1% एसडीएस |
| 1% ट्राइटन X-100 |
| 2 मिमी EDTA |
| 20 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| LiCl धो बफर |
| 0.25 एम LiCl |
| 1% एनपी 40 |
| 1% सोडियम deoxycholate |
| 1 मिमी EDTA |
| 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 |
| 1 मिमी EDTA |
तालिका 4. बफर संरचना।
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Discussion
यहाँ वर्णित चिप प्रोटोकॉल Arabidopsis पौधों में विवो में प्रोटीन और विशिष्ट डीएनए दृश्यों के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और शक्तिशाली तकनीक है। ब्याज की प्रोटीन के लिए बाध्यकारी साइटों की एक सफल पहचान प्रासंगिक बातचीत वास्तव में जगह ले जा रहे हैं, जहां संयंत्र अंगों या विकास के चरणों की एक पर्याप्त चयन की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह संयंत्र सामग्री का एक उचित निर्धारण और sonication द्वारा क्रोमेटिन के एक इष्टतम बाल काटना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। चयनित प्रोटीन / टैग के कुशल immunoprecipitation के लिए अति विशिष्ट एंटीबॉडी भी जरूरी है।
पौधों में चिप दृष्टिकोण का उपयोग संभावित प्रोटोकॉल में विभिन्न चरणों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि माध्यमिक चयापचयों और सेल दीवारों की उपस्थिति से संबंधित कुछ कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। इसके अलावा, संयंत्र अंगों की जटिलता, अक्सर अनेक प्रकार की कोशिकाओं से युक्त जहां पूर्णांक के डीएनए बाध्यकारी प्रोटीनerest विभिन्न वर्तमान या सक्रिय किया जा सकता है, इस पद्धति का उपयोग रुकावट है। यह चिप में उपयोग करने के लिए सबसे लाभप्रद है जब भी संभव है कि कारण के लिए ब्याज की प्रोटीन की उपस्थिति और / या गतिविधि पहले से ही प्रदर्शन किया गया है, जहां सजातीय ऊतकों दृष्टिकोण। विभिन्न ऊतकों युक्त परिसर संयंत्र सामग्री प्रकार की कोशिकाओं, जहां वास्तव में प्रोटीन कार्यों के कमजोर पड़ने का कारण बन जाते हैं। 2 0 सेक्शनिंग ऊतक व्यक्ति ऊतकों या प्रकार की कोशिकाओं में पढ़ाई के लिए संयंत्रों में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, हाल के वर्षों के दौरान विभिन्न प्रक्रियाओं इष्टतम टुकड़े की एक श्रृंखला के लिए एराबिडोप्सिस 8 में सेल प्रकार विशिष्ट क्रोमेटिन का अलगाव (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) के लिए विकसित किया गया है 7। ऊपर चर्चा की, की स्थिति बहुत इस्तेमाल किया विशिष्ट अल्ट्रासाउंड उपकरणों पर निर्भर इस आकार के वितरण के लक्ष्य को हासिल करने के लिए। किसी भी मामले में, क्रोमेटिन इष्ट तिर्यक के उत्क्रमण को रोकने के लिए कम तापमान पर रखा जाना चाहिएगर्मी से sonication के दौरान उत्पन्न। चुनाव के sonication डिवाइस एक साथ इष्टतम विखंडन की स्थिति के साथ, चिप विश्लेषण (चित्रा 3) के लिए आवश्यक है, जो reproducibility के एक अच्छे स्तर, प्रदान करना चाहिए।
सफल चिप प्रयोगों में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक ब्याज की प्रोटीन की immunoprecipitation के लिए चुना एंटीबॉडी है। संयंत्र प्रतिलेखन कारक के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी चिप विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन पश्चिमी धब्बा प्रयोगों में जाँच एंटीबॉडी जरूरी चिप के लिए मान्य नहीं हैं क्योंकि इन सीरा अच्छी तरह से जांच की जानी चाहिए। इसके अलावा, विभिन्न टैग के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी अक्सर इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। विशेष रूप से टैग की एक किस्म को पहचानने चिप ग्रेड एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और वे कई प्रयोगशालाओं में परीक्षण किया गया है कि फायदा है। इन वाणिज्यिक एंटीबॉडी के उपयोग के लिए दोष यह है कि ब्याज की प्रोटीन इसी मिलान से जुड़े हुए हो गया है कि हैऔर ट्रांसजेनिक लाइनों (चित्रा 4 बी) में व्यक्त किया। इस मामले में, यह कैमेरिक प्रोटीन एराबिडोप्सिस हमारे हित के प्रोटीन एन्कोडिंग जीन की कमी एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि में संलयन प्रोटीन असर ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करके कार्यात्मक है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती है। ट्रांसजेनिक पौधों में उत्परिवर्ती लाइन की प्ररूपी असामान्यताओं के पूरक संलयन प्रोटीन अंतर्जात प्रोटीन की सामान्य गतिविधियों को बरकरार रखे हुए है कि इस बात की पुष्टि करेगा। ट्रांसजेनिक लाइनों ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के बंधन साइटों की पहचान करने के लिए उत्पादन किया जाता है, जब वह विधान मजबूत प्रमोटरों (ऊपर देखें) के उपयोग से संबंधित समस्याओं को रोकने, टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव अंतर्जात प्रमोटर का उपयोग करने के लिए बेहतर है। यह भी अक्सर चिप में इस्तेमाल किया जाता है जैसे कि मेथिलिकरण या विशिष्ट अवशेषों की एसिटिलीकरण रूप हिस्टोन posttranslational संशोधनों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी में शामिल जीनों की Epigenomic परिदृश्य निर्धारित करने के लिए विश्लेषण करती हैफूल समय के नियंत्रण (चित्रा 4C) सहित विकास की प्रक्रिया के एक नंबर के विनियमन। टैग के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए के रूप में, चिप ग्रेड वाणिज्यिक एंटीबॉडी हिस्टोन के निशान के मामले में पसंदीदा विकल्प हैं।
जीन अभिव्यक्ति के लिए युग्मित चिप प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रतिलेखन कारक है, क्रोमेटिन remodeling प्रोटीन, और हिस्टोन सहसंयोजक संशोधनों संयंत्र जैविक प्रक्रियाओं और प्रतिक्रियाओं के नियमन में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति मिलाना के बारे में हमारे ज्ञान को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है विश्लेषण करती है। प्रारंभ में विशेष लोकी या जीन क्षेत्रों के साथ क्रोमेटिन में मौजूद प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक विधि के रूप में विकसित की है, जीनोमिक संसाधनों और NGS प्रौद्योगिकी के फट चिप डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन इस तरह के जीनोम चौड़ा रूपरेखा के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनने के लिए अनुमति दी गई है प्रतिलेखन कारक या संशोधित histones और हिस्टोन वेरिएंट के रूप में। चिप चिप और चिप seq एक नई वैश्विक Dimen प्रदान की हैएराबिडोप्सिस 2 5 में क्रोमेटिन प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए सायन। चिप seq के दृष्टिकोण इन सरणियों जांच की एक सीमित संख्या में होते हैं, यह देखते हुए संकरण सरणियों पर आधारित है और कुछ पूर्वाग्रह का परिचय है जो चिप-चिप, के लिए पसंद के विकल्प पर विचार कर रहे हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
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