Summary
Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l'identification des sites d'ADN d'Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d'intérêt, et l'analyse qPCR de l'ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d'Arabidopsis.
Introduction
Au cours des dernières années, un large éventail d'outils génétiques, moléculaires et génomiques ont été développés dans le espèce modèle Arabidopsis thaliana. Cette technologie a facilité énormément le progrès dans la compréhension comment le développement de la plante est réglementé. Parmi les processus développementaux étudiés en utilisant Arabidopsis comme un modèle, le contrôle génétique de la période de floraison a été largement analysé. Ces études ont montré que les plantes modulent très précisément le moment de la floraison, en réponse à des signaux endogènes tels que les hormones et l'âge de la plante, et également à des signaux environnementaux tels que la photopériode et la température qui synchronisent floraison avec le cycle naturel des saisons 1, 2. L'isolement et la caractérisation de mutants d'Arabidopsis avec des altérations dans le temps de la floraison a été déterminant pour dévoiler un réseau complexe de gènes qui régulent la période de floraison, en réponse à des facteurs endogènes et environnementaux. Ces circuits sont génétiquesintégré au niveau de quelques gènes maîtres qui agissent comme des interrupteurs de la floraison, et le moment exact de l'initiation florale dépend de l'équilibre de la floraison et de la promotion de réprimer les activités qui travaillent en amont des gènes intégrateurs floraux 1,3.
La caractérisation fonctionnelle des gènes identifiés pour leur rôle dans le contrôle de la floraison initiation, aidé par l'utilisation récente des approches génomiques, ont révélé le rôle central de la régulation transcriptionnelle dans la modulation du temps de la floraison. En fait, la plupart des gènes maîtres de floraison encodage facteurs de transcription 4. En outre, un certain nombre de complexes de protéines de remodelage de la chromatine influence l'expression des gènes de base de la floraison. Un certain nombre de mutants d'Arabidopsis isolés pour leur temps de floraison altérée avéré porteurs de mutations dans les gènes codant pour une variété de modificateurs de la chromatine. Rénovateurs de la chromatine différents qui introduisent modifications post-traductionnelles dans histone queues, repositionner nucléosomes par rapport à l'ADN ou des histones canoniques échangent par des variantes des histones sont nécessaires à la bonne régulation de la floraison chez Arabidopsis 5,6. Certaines de ces activités de remodelage de la chromatine catalyser le dépôt ou le retrait des modifications covalentes telles que l'acétylation ou méthylation des histones dans les résidus spécifiques. Ces marques des histones sont spécifiquement reconnus par des effecteurs spécialisées qui recrutent d'autres complexes de remodelage de la chromatine, des facteurs de transcription ou des composants de la machinerie transcriptionnelle de réguler l'activité transcriptionnelle des gènes de floraison.
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) permet l'identification de l'ADN in vivo sites de liaison pour des protéines d'intérêt (Figure 1). Cette procédure tire parti de la capacité de certains produits chimiques pour réticuler les protéines à l'ADN. Les complexes de protéines-ADN résultants peuvent être ensuite immunoprécipitées en utilisant des anticorps spécifiques against facteurs de transcription, des protéines de liaison à la chromatine, ou des modifications particulières et des epitopes hétérologues (communément appelés "tags") fixés à la protéine de choix. L'ADN purifié à partir de ces immunoprécipités peut être utilisé comme un modèle dans quantitatives réactions PCR (qPCR) pour évaluer l'enrichissement des séquences particulières d'intérêt. De cette manière, les sites de liaison de facteurs de transcription ou la distribution des marques d'histone dans des gènes particuliers peuvent être établis 7,8. En outre, combiné avec Next Generation Sequencing (NGS) qui permet le séquençage massivement parallèle, la technologie des puces a rendu possible l'identification du génome entier des sites de liaison de facteurs de transcription ainsi que des paysages épigénomiques dévoilement de modifications des histones. En outre, l'analyse simultanée de l'expression génique permet de surveiller la façon dont la liaison des régulateurs de transcription ou le dépôt de marques particulières des histones en corrélation avec la transcription activity 9 de gènes.
L'utilisation de protocoles de puce dans Arabidopsis a permis d'évaluer l'impact d'une variété de régulateurs de transcription sur l'organisation de la chromatine des gènes maîtres de la floraison et de la façon dont ces changements structurels influent sur l'expression des gènes 5,6. Résultats précédents ont montré que le locus Arabidopsis BOLTING TOT EN JOURS COURTS (EBS) agit comme un répresseur de la floraison et les mutants dans ce spectacle de gène d'une accélération de la floraison et la régulation positive du gène maître de la floraison FT. En outre, les mutations de perte de fonction dans FT suppriment complètement la floraison phénotype précoce des plantes ebs de mutants, indiquant que FT est nécessaire pour la floraison prématurée des mutants ebs et que EBS est nécessaire à la répression de ce gène maître de la floraison 10 , 11. EBS code pour une protéine contenant PHD qui peuvent se lier spécifiquement histone H3 di- et triméthylée en the lysine 4 résidus (H3K4me2 / 3), ce qui suggère un rôle pour EBS dans la répression de la chromatine médiée par FT 12. L'utilisation de l'approche de ChIP démontré que l'Arabidopsis contenant PHD-protéine EBS 10,11 lie régions régulatrices du gène FT intégrateur floral pour réprimer son expression 12. Des données supplémentaires obtenues grâce à l'utilisation de la technologie à puce ont montré que cette protéine est nécessaire pour maintenir de faibles niveaux de l'acétylation des histones, une caractéristique de la transcription active, dans la chromatine de ce gène maître de la floraison au cours des étapes initiales du développement d'Arabidopsis. Ces observations, ainsi que des données d'expression génétique et le gène, démontrer que cette PHD-contenant des protéines d'Arabidopsis a un rôle central dans le réglage fin de la période de floraison en modulant l'expression du gène de l'intégrateur floral FT 12. Le travail présenté ici fournit un procédé optimisé utile non seulement pour l'analyse des histones, mais aussi pour d'autreschromatine des protéines associées, et avec une efficacité accrue et une réduction du temps expérimental. En outre, ce rapport illustre comment l'utilisation de protocoles de puce a fourni de nouvelles informations sur la relation entre les changements de modifications de la chromatine et les états de la transcription de gènes de plantes, et comment ces mécanismes de l'impact du contrôle de l'expression du gène de la chromatine médiation sur le début de la floraison chez Arabidopsis.
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Protocol
1. réticulation du matériel végétal (1 h)
- Cultiver les lignées d'Arabidopsis utilisés dans l'expérience (de type sauvage - WT - contre les mutants, et / ou lignées exprimant la version étiqueté de votre protéine d'intérêt par rapport lignées exprimant la balise pas fusionnés à toute protéine) pendant 12-18 jours sur de grandes boîtes de Pétri (150 mm) avec du milieu MS-agar (1 L: sels de Murashige & Skoog 1x, 10 g de saccharose, 0,5 g de MES, pH 5,7 (KOH), 1% de gélose). Alternativement, cultiver des plantes sur des pots contenant 3: 1 mélange de terre et de vermiculite.
ATTENTION! Le formaldéhyde est toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion, et doit être manipulé dans une hotte chimique de porter un équipement de protection individuelle approprié. Les étapes 1.2 à 1.6 doit être effectué sous la hotte. - Faire des petits trous dans le couvercle des tubes de 50 ml avec une aiguille de brûleur chauffe-laboratoire. Ajouter 40 ml de PBS 1x tampon et 1,08 ml de formaldéhyde à une concentration finale de 1% (37% de stock solution). Recueillir 1,5 g de matière végétale dans ces tubes de 50 ml. Gardez les tubes sur la glace lors de la réticulation.
- Fermer les tubes de 50 ml avec le couvercle. Placer les tubes dans un dessiccateur et appliquer le vide. Vide infiltrer le tissu pendant 10 min, puis relâchez attentivement le vide, pour empêcher barattage jusqu'à la solution. Mélanger l'échantillon. Répéter deux fois. Après infiltration, observer le matériel végétal et confirmer qu'il devient légèrement translucide et ont tendance à couler au fond du tube (Figure 2).
- Ajouter 2,5 ml de 2 M de glycine pour obtenir une concentration finale de 0,125 M. Appliquer vide pendant 5 min. La glycine agit comme un inhibiteur compétitif de formaldéhyde réticulation.
- Jeter la solution de formaldéhyde-glycine PBS en inversant le tube fermé de 50 ml, avec des trous dans le couvercle.
- Rincer les plantules deux fois avec PBS 1x et une fois avec de l'eau de jeter la solution de lavage comme décrit dans l'étape 1.5. Séchez-les sur une serviette en papier et geler dans nitroge liquiden.
NOTE: Le tissu congelé peut être conservé à -80 ° C pendant plusieurs semaines.
2. Préparation des anticorps (1 jour)
NOTE: Pour l'immunoprécipitation, l'utilisation de billes magnétiques conjuguées à des anticorps via une protéine G ou la protéine A de liaison à forte affinité pour le domaine constant de la chaîne lourde d'anticorps est recommandée. Les complexes ADN-protéines peuvent se fixer de manière non spécifique à la surface des conjugués anticorps-perles. Pour cette raison, il est nécessaire d'effectuer des contrôles sans anticorps spécifiques pour quantifier la liaison de fond non spécifique.
- Pour chaque immunoprécipitation, préparer 15 pi de billes magnétiques dans un tube de 1,5 ml. La quantité de perles dépend de la quantité de la chromatine utilisés pour l'immunoprécipitation et également sur les anticorps.
- Pour laver, ajouter 1 ml de Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) tampon de dilution pour les perles, mélanger par rotation et placez le 1,5 ml microcentrifugeuse tuêtre dans un rack magnétique. Attendez environ 1 min de laisser les perles attachent à l'aimant. Avec les 1,5 ml microtubes encore dans le rack, retirez le surnageant par pipetage. Répéter deux fois.
NOTE: Pour chaque ligne de l'usine deux ensembles d'immunoprécipitation sont nécessaires: l'un avec des perles et des anticorps (AB) et un second pas d'anticorps (Pas-Ab) de contrôle avec des billes magnétiques seulement. - Remettre en suspension les billes dans 200 pl de tampon de dilution ChIP. Ajouter la quantité requise de l'Ab spécifique à l'un des deux tubes préparés pour chaque ligne de l'usine (la dilution exacte diffère pour chaque Ab et doit être optimisé expérimentalement ou, dans le cas d'anticorps commerciaux, suivez les instructions du fabricant). Utilisez cet exemple pour l'immunoprécipitation. Ajouter la même quantité de IgG non spécifique à l'autre tube, qui sera utilisé comme contrôle négatif.
- Incuber O / N sur une roue tournant à 4 ° C pour laisser l'anticorps joindre aux billes.
3. Extraction de la chromatine (4 h)
NOTE: Dans cette étape, les noyaux et tous les organites se sédimenter. ExB 1 contient suffisamment de saccharose pour fournir une haute densité et empêcher la rupture de la structure des organites.
REMARQUE: ExB 2 contient 1% de Triton X-100 pour aider à éclater les chloroplastes ouverte et enlever la chlorophylle.
NOTE: Cette étape permet d'enlever le détergent de l'échantillon.
NOTE: Cetampon contient SDS, pour lyser les noyaux et relâchez la chromatine.
ATTENTION! Assurez-vous de porter des équipements de protection auditive lors de l'étape de sonication en cas l'appareil à ultrasons ne sont pas contenues dans une armoire insonorisée.
Étape cruciale! La fragmentation de la chromatine dépend en grande partie de l'équipement de traitement par ultrasons. Les conditions de sonication doivent être ajustées pour parvenir à l'enrichissement dans les tailles des ADN appropriés. VoirFigure 3 pour un exemple de la façon d'optimiser la fragmentation de la chromatine.
Note: Les échantillons peuvent être congelés et conservés à -20 ° C pendant plusieurs semaines.
4. immunoprécipitation de la protéine d'intérêt et de sauvetage de l'ADN (1 jour, 3 heures)
- Laver les billes revêtues de l'étape 2.4 à partir de Ab trois fois avec 1 ml de tampon de dilution de ChIP pour éliminer l'excès d'anticorps de la manière décrite dans l'étape 2.2. Remettre en suspension dans 200 pi de tampon de dilution ChIP. Ajouter 50 pi de la chromatine isolée. Incuber O / N sur une roue tournant à 4 ° C.
NOTE: Consultez les concentrations dsur de la chromatine dans microvolume spectrophotomètre UV-Vis. 50 ul de la chromatine isolée doivent contenir plus de 10 ug d'ADN. - Pour les étapes des travaux de 4,2-4,5 à 4 ° C. Laver les billes deux fois dans 1 ml de tampon de lavage faible teneur en sel comme décrit dans l'étape 2.2.
- Laver les billes une fois dans 1 ml de tampon de lavage à haute sel.
- Laver les billes une fois dans 1 ml de tampon de lavage LiCl.
- Laver les billes deux fois dans 1 ml de tampon TE. Après le dernier lavage, assurez-vous de supprimer complètement le tampon TE gauche dans le tube par aspiration avec une pipette.
- Sortez les échantillons d'entrée (étape 3.9). Transfert 5 pi de l'entrée dans un nouveau tube de 1,5 ml et continuer comme avec les échantillons de copeaux. Inverse de réticulation par addition de 200 ul de résine de 5% chélatrice échangeuse d'ions, et incuber pendant 10 min à 95 ° C en secouant toutes les 2-3 min. Isoler à 16.000 g pendant 30 sec et transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube par pipetage.
REMARQUE: Alors que le traProcédé de réticulation d'inversion conditionnelle comporte un rapport O / N incubation avec du NaCl, l'incubation avec une résine chélatante d'ions à 95 ° C permet de déréticulation et élution de l'ADN dans les 10 min efficace, rendant ainsi le protocole jour une plus courte. - Ajouter 2 ul de proteinase K (10 mg / ml) et incuber à 37 ° C pendant 30 min à digérer les protéines et de libérer l'ADN.
- Arrêter la réaction par incubation à 95 ° C pendant 10 min.
- Tourner rapidement à 16.000 g pendant 30 sec et transférer le surnageant dans un nouveau tube par pipetage.
- Nettoyez l'ADN isolé en utilisant un kit de purification de fragments d'ADN standard.
REMARQUE: Procédez selon les instructions du fabricant. - Transférer la colonne liaison à l'ADN à partir du kit à un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger. Eluer l'ADN purifié en ajoutant 20 pi d'eau exempte de DNase à l'axe de la colonne et tournant à 16 000 xg pendant 60 sec. Point d'arrêt: Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs semaines. 5. Mesure abondance des sites de liaison à l'ADN immunoprécipitée par qPCR (4 h)
- Des amorces de conception pour les régions génomiques d'intérêt avec une température de fusion (Tm) de 60 ° C et une teneur en GC de 30% à 80%. Comme la chromatine est fragmenté par sonication, la longueur de la séquence amplifiée ne devrait pas être plus long que les nucleotides 150-200 (tableau 1).
REMARQUE: Un outil utile pour la conception d'amorce est Primer 3 programme (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Des lignes directrices supplémentaires pour la conception d'amorce sont disponibles dans les rapports précédents 8, 14,15. - Utilisez un programme BLAST pour vous assurer que les amorces sont spécifiques (en particulier les promoteurs peuvent partager des séquences de liaison TF similaire) et de tester l'usin d'efficacité primaireg dilutions 1:10 dans de l'eau de l'ADN d'entrée (étape 4.9). Certaines régions du génome seront purifiés mieux que d'autres. Il est donc important de concevoir des amorces de PCR et de les vérifier sur l'ADN d'entrée diluée.
- Diluer l'ADN purifié à 1:10 avec de l'eau et la pipette 5 pi de l'ADN dilué dans un tube PCR pour chaque réaction.
REMARQUE: Diluer seulement la quantité nécessaire, que l'ADN peut fixer aux parois des tubes de 1,5 ml à centrifuger. De multiples cycles de congélation-décongélation d'augmenter le nombre de molécules d'ADN ci-jointes. Pour chaque paire d'amorces, l'amplification dans l'entrée, Ab-puce et non-Ab ChIP doit être analysé. - Pour compléter le mélange de PCR, ajouter Sybr Green PCR Master Mix à une concentration finale de 1 x, et 0,5 uM de chaque amorce. Remplissez jusqu'à 20 pi avec de l'eau exempte de DNase.
- Effectuer la réaction qPCR en suivant les instructions du fabricant mix master Sybr Green PCR.
- L'analyse des données par la méthode d'enrichissement pli.
- Créer une feuille de calcul avec des échantillons noms et les valeurs Ct premières qui ont été obtenus après réaction qPCR.
- Pour chaque échantillon, de soustraire sa valeur brute la valeur Ct Ct brut obtenu pour le contrôle Pas-Ab correspondant. NOTE: Après cette opération mathématique, la valeur Ct pour l'échantillon Pas-Ab est égale à 0.
- Calculer l'enrichissement fois en opération d'exponentiation avec base 2 et exposant (puissance) égal au reste négatif obtenu à l'étape 6.1.2 (tableau 2).
pliez enrichissement = 2 - (Ct (échantillon) - Ct (Pas-Ab))
NOTE: Dans ce méthod l'abondance d'un fragment d'ADN spécifique dans l'échantillon ChIP-ed est comparée à l'abondance de ce fragment dans le contrôle Pas-Ab. L'hypothèse de cette méthode est que le niveau de signal de fond est reproductible entre les différents jeux d'amorces, des échantillons, et de reproduire des expériences. Cependant, ce niveau de signal'noise' ne varient entre jeux d'amorces, des échantillons et des expériences.
- L'analyse des données par% de méthode d'entrée.
- Créer une feuille de calcul avec des échantillons noms et les valeurs Ct premières qui ont été obtenus pour eux après la réaction qPCR.
- Ajustez les valeurs de Ct premières pour échantillons d'entrée en soustrayant une valeur de logarithme de base 2 de la fraction de la chromatine total extrait qui a été prise comme une entrée.
NOTE: Dans ce protocole, la valeur soustraite est égal 3,32, comme 10% de la chromatine total a été pris comme une entrée dans ce protocole. Connectez-2 (10) est égal à 3,32. - Calculez% de l'apport en multipliant par 100 la valeur de l'opération d'exponentiation avec base 2 et exposant (puissance) correspondant au reste de valeurs d'entrée ajustés à partir des valeurs de Ct soustraites premières de l'échantillon (tableau 3).
% D'entrée = 100 * 2 (entrée ajusté - Ct (échantillon))
NOTE: Avec cette procédure, la relation entre l'abondance d'ADN spécifique dans l'échantillon ChIP-ed à la chromatine isolée (échantillon d'entrée) total est calculé. De plus amples détails sur l'analyse des données de la puce peuvent être trouvés dans Haring et al., 8.
REMARQUE: l'ADN isolé de la chromatine précipitée doit être analysé afin de déterminer les fragments d'ADN ont été ChIP-ed de la chromatine totale, en raison de sa liaison à la protéine d'intérêt.
Analyse des données 6.
NOTE: Parmi les exIsting façons d'analyser les données puce, deux sont les plus couramment utilisés. Le premier d'entre eux est la méthode d'enrichissement pli, également appelé comme 'enrichissement relatif »,« signal sur fond »ou« par rapport au témoin sans anticorps'. La deuxième méthode est désigné comme "% de l'entrée".
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Representative Results
Huit principales étapes peuvent être distinguées dans ce protocole de puce pour l'identification d'interactions in vivo protéine-ADN, y compris culture et la récolte de la matière végétale, la réticulation de la chromatine, l'isolement de la chromatine, la fragmentation de la chromatine, isolement sélectif des complexes entre l'ADN et la protéine d'intérêt par immunoprécipitation, la digestion des protéines, purification de l'ADN, et l'analyse qPCR (figure 1). Une étape cruciale dans le protocole de puce est la fixation d'interactions protéine-ADN dans une réaction de réticulation. Typiquement, le formaldéhyde réticulation est utilisée dans l'usine puce. Le formaldéhyde pénètre dans le tissu et crée des ponts méthylène entre les groupes NH 2 de protéines ou de protéines et de nucleotides dans l'ADN 1 6. Une fixation efficace des complexes de nucléoprotéine in vivo nécessite que le formaldéhyde atteint la chromatine à l'intérieur des noyaux de plantes, et il est essentiel que le tissu végétal est entièrement immergé dans ttampon de formaldéhyde-il pour que, pendant immunoprécipitation les complexes protéine-ADN sont effectivement tiré vers le bas. Feuilles d'Arabidopsis sont traitées dans des couches de cire difficile que la pénétrance de l'agent de réticulation dans les cellules. En outre, les trichomes favorisent la formation de bulles d'air sur la surface des feuilles, ce qui empêche la solution de formaldéhyde à partir de pénétrer à l'intérieur du tissu végétal. Pour surmonter cette limitation, dans cette étape de vide est appliquée sur les échantillons, ce qui empêche la formation de bulles dans la solution de fixation et en améliorant la pénétration de formaldéhyde dans les noyaux de toutes les cellules. Les semis après le traitement de réticulation efficace sont indiqués sur la figure 2.
Une autre étape clé dans le protocole de puce est chromatine cisaillement. Pour les fragments de chromatine peuvent donner lieu à basse résolution de la cartographie des sites de liaison de la protéine d'intérêt dans la séquence d'ADN. En revanche, très petits fragments peuvent empêcher une amplification efficace del'ADN lié par qPCR. Selon l'expérience empirique, la gamme de taille chromatine optimale pour analyse de la puce doit être comprise entre 200 et 600 pb, et les conditions pour obtenir la fragmentation appropriée de la chromatine doivent être réglés en fonction du dispositif de sonication disponible dans le laboratoire. La figure 3 illustre la Procédure pour optimiser la chromatine cisaillement pour obtenir l'enrichissement maximum dans la plage de tailles désirée ADN. Avant ultrasons, la chromatine est principalement constitué de très grands fragments. Une augmentation du nombre de cycles de sonication réduit progressivement la taille moyenne de l'ADN dans des échantillons de la puce, pour atteindre l'enrichissement optimal dans la gamme de 200-600 pb après 20-30 cycles (section 3.8 du protocole et figure 3).
Ici, l'identification des sites à des régions régulatrices de l'intégrateur floral FT liaison aux protéines EBS est représenté comme un exemple de l'utilité de la technique de la puce. La liaison de l'EBS à til a été locus FT démêlé à travers des essais de ChIP avec des lignées d'Arabidopsis exprimant une protéine de fusion-cMyc EBS sous le contrôle du promoteur natif EBS (PEBS ::-cMyc EBS). Cette version marqués d'EBS est entièrement fonctionnelle comme indiqué par le phénotype de type sauvage de ebs plantes mutantes exprimant cette construction. Quatre régions dans le locus FT génomique ont été testés pour la liaison EBS; une dans la région de promoteur du gène (FTII), deux autour du site d'initiation de la transcription (FTIV, FTVI), et une autre dans le premier intron du FT (FTVII) (figure 4A). Comme le montre la figure 4B, des résultats d'ChIP démontrent que la protéine peut se lier EBS une séquence régulatrice à proximité du site de début de transcription du gène de la floraison maître 12 FT. En outre, la protéine EBS peut interagir à la fois in vitro et in vivo avec des histones désacétylases, tels que hda6, une autre protéine apparentée à la chromatine impliqué dans la régulationdu moment de la floraison chez Arabidopsis 1 7. Afin d'évaluer l'influence possible de l'EBS sur les niveaux de l'acétylation des histones dans la région génomique de FT, les dosages de copeau ont été effectuées en utilisant un anticorps dirigé contre l'histone H3 acétylée dans lysines 9 et 14, une marque de histone corrélée avec la transcription de la chromatine active 1 2 . En outre, ces données illustrent comment les approches de puce peut contribuer à faire la lumière sur les mécanismes moléculaires qui modulent la régulation transcriptionnelle des processus de développement de la plante.
Figure 1. Schéma du protocole Immunoprécipitation de la chromatine. Puce est une technique couramment utilisée pour étudier les interactions entre les protéines et l'ADN, fixés par un composé chimique. Chromatine avec des interactions conservés est isolé à partir des noyaux et fragmenté. En utilisant des anticorps contre la protéine d'intérêt,on peut sélectionner des fragments d'ADN qui s'y rattachent. L'anticorps est conjugué à des billes magnétiques qui permettent l'isolement rapide et simple en utilisant une grille magnétique. Dans l'étape suivante, les protéines sont éliminées par traitement de la proteinase et de l'ADN est libéré. Fragments d'ADN purifiés sont ensuite utilisés comme modèles dans les réactions de qPCR pour mesurer leur abondance relative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Exemple d'un tissu après réticulation avec du formaldehyde. Afin d'étudier les interactions entre l'ADN et des protéines, dans des complexes in vivo doivent être fixés pour les rendre stables et durables à travers les multiples étapes du protocole. Dans cette version du protocole, la fixation se fait par traitement au formaldehyde. Pénétration efficace de formaldéhyde through le tissu est cruciale pour le succès de la méthode de la puce. (A) avant l'étape de réticulation de la matière végétale flotte à la surface de la solution et est recouvert de petites bulles d'air; les surfaces abaxiales et adaxiales des feuilles diffèrent par la couleur. (B) Après fixation, les plantules doivent être visiblement trempé dans la solution, légèrement transparent, et uniformément immergé dans la solution de réticulation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Optimisation des conditions de sonication pour l'analyse de la puce. Chromatine isolée de matériel fixe est constitué d'un large éventail de fragments longueurs avec une forte bande en haut du gel représentant tailles de chromatine extrêmement longues (deuxième ligne sur la gauche). Avec Increachanter nombre de cycles de sonication, le pic de la chromatine fragments tailles est déplacé vers de plus petits fragments. Dans l'expérience le montre, les numéros de cycle optimal varient entre 20 et 30, après quoi les fragments chromatine optimales allant de 200 à 600 pb sont plus abondants dans l'échantillon de la puce. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. ChIP analyses montrent que EBS lie FT et EBS mutations modifient le niveau de acétylation des histones H3 dans ce gène intégrateur floral. (A) région génomique de FT avec boîtes noires représentant les exons. Quatre fragments couvrant des régions régulatrices de ce gène intégrateur floral ont été testés (grisboîtes) en concevant des amorces spécifiques qPCR. (B) EBS lie la région FT IV, situé à proximité du site de début de transcription. Myc-EBS correspond à EBS plantes mutantes exprimant la version cMyc étiqueté d'EBS; Myc dénote plantes transgéniques exprimant l'épitope cMyc pas fusionnés à tout gène d'Arabidopsis. (C) ebs plantes mutantes présentent une plus grande abondance de H3K9,14Ac que le type sauvage Landsberg erecta (L er) dans les quatre régions FT évalués. Les barres d'erreur montrent écart type (B et C). Modifié à partir de données déjà publiées dans The Plant Cell 1 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Vers l'avant | Inverser | Région testé |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tableau 1. Amorces utilisées dans cette étude.
| Échantillon | Raw Ct Valeurs | Ct-Ct (Pas-Ab) | Enrichissement Fold 2 - (Ct (échantillon) - Ct (Pas-Ab)) |
| Non-Ab | 34,5 | 0 | 1 |
| Un B | -5.3 | 39,4 |
Tableau 2. Exemple de l'analyse des données de la puce par l'enrichissement "Pliage" méthode. Valeurs CT pour No-Ab échantillons représentent le signal de fond provoqué par la liaison non spécifique de l'ADN pour les billes magnétiques AB /. Ces valeurs Ct devraient dépasser 30. Différence entre les valeurs de Ct de Non-Ab Ab et l'échantillon doit être supérieur à 1.
| Étape 1 - Ajustez l'entrée | |||
| Entrée ajusté = Raw Ct (entrée) - log 2 (fraction de la chromatine au total) | |||
| Raw Ct | entrée de la chromatine totale | Connectez-2 10 | |
| Contribution | 29,5 | 10% | 3.32 |
| Entrée ajusté = 29,5 à 3,32 = 26,18 | |||
| Étape 2 -% des calculs d'entrée | |||
| Échantillon | Raw Ct | Ct (entrée ajusté) -Ct (échantillon) | 2 Ct (entrée ajusté) -Ct (échantillon) * 100% |
| Contribution | 26.18 | ||
| ChIP-Ab | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| Non-Ab | 34,5 | -8,32 | 0,31 |
Tableau 3. Exemple d'analyse des données de la puce par la méthode "% de l'entrée". Entrées représentent la chromatine réticulé total isolé à partir de noyaux, de sorte que les valeurs de Ct doit être égale pour tous les couples d'amorces. De manière classique, 5% ou 10% de la chromatine totale est prise comme entrée. Non-Ab représente un échantillon de contrôle négatif - les perles non recouvert d'anticorps spécifiques dirigés contre la protéine ou une étiquette de interest. ChIP-Ab représente l'échantillon après l'immunoprécipitation avec les anticorps contre la protéine ou une étiquette d'intérêt.
| PBS 10x |
| 1,3 M de NaCl |
| 30 mM de Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Tampon d'extraction 1 (ExB 1) |
| 0,4 M de saccharose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| MM MgCl 10 |
| 5 mm β-mercaptoéthanol |
| Les inhibiteurs de protéase |
| Tampon d'extraction 2 (ExB 2) |
| 0,25 M de saccharose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM de MgCl2 |
| 1% de Triton X-100 </ td> |
| 5 mm β-mercaptoéthanol |
| Les inhibiteurs de protéase |
| Tampon d'extraction 3 (ExB 3) |
| 1,7 M de saccharose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 0,15% de Triton X-100 |
| 2 mM de MgCl2 |
| 5 mm β-mercaptoéthanol |
| Les inhibiteurs de protéase |
| Tampon de sonication |
| 50 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM d'EDTA |
| 1% de SDS |
| Les inhibiteurs de protéase |
| Tampon de dilution ChIP |
| 1,1% de Triton X-100 |
| 1,2 mM d'EDTA |
| 16,7 mM Tris-HCl pH 8 |
| 167 mM de NaCl |
| Les inhibiteurs de protéase |
| Tampon faible teneur en sel |
| 150 mM de NaCl |
| SDS à 0,1% |
| 1% de Triton X-100 |
| 2 mM d'EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| Tampon de lavage High Salt |
| 500 mM de NaCl |
| SDS à 0,1% |
| 1% de Triton X-100 |
| 2 mM d'EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| Tampon LiCl Wash |
| 0,25 M de LiCl |
| 1% de NP-40 |
| Le désoxycholate de sodium à 1% |
| 1 mM d'EDTA |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 1 mM d'EDTA |
Tableau 4. la composition du tampon.
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Discussion
Le protocole décrit ci-ChIP est une technique reproductible et puissant pour analyser les interactions entre les protéines et les séquences d'ADN spécifiques in vivo dans des plantes Arabidopsis. Une identification réussie des sites de liaison pour les protéines d'intérêt exige une sélection adéquate des organes de la plante ou des stades de développement où les interactions pertinentes ont effectivement lieu. En outre, il est essentiel d'obtenir une fixation appropriée de la matière végétale et un cisaillement optimale de la chromatine par sonication. Anticorps hautement spécifiques pour l'immunoprécipitation efficace de la protéine / balise sélectionnée sont également essentiels.
Le recours à des approches de puce dans les plantes est confronté à des difficultés liées à la présence de métabolites secondaires et les parois cellulaires qui peuvent potentiellement nuire à différentes étapes du protocole. De plus, la complexité des organes végétaux, contenant souvent plusieurs types de cellules, où la protéine de liaison à l'ADN d'intEREST peut être différentielle présente ou active, ont entravé l'utilisation de cette méthodologie. Pour cette raison, chaque fois que possible, il est plus avantageux d'utiliser dans la puce approches tissus homogènes où la présence et / ou l'activité de la protéine d'intérêt ont déjà été démontrés. Les matières végétales contenant des complexes différents tissus ont tendance à provoquer une dilution des types où les fonctions de protéines cellulaires en fait. Tissue sectionnement 2 0 ont été utilisés dans les usines pour des études dans les tissus individuels ou types de cellules. Cependant, au cours des dernières années, différentes procédures ont été élaborées pour l'isolement du type de cellule spécifique de la chromatine chez Arabidopsis 8 à une gamme de fragments optimaux (voir la section des résultats représentatifs) 7. Comme indiqué ci-dessus, les conditions pour atteindre cet distribution de la taille dépend grandement sur l'équipement d'échographie spécifique utilisé. Dans tous les cas, la chromatine doit être conservé à basse température pour empêcher l'inversion de la réticulation désiréepar la chaleur générée pendant la sonication. Le dispositif de sonication de choix devrait fournir un bon niveau de reproductibilité, qui, avec des conditions optimales de fragmentation, est essentiel pour l'analyse ChIP (figure 3).
Un autre facteur clé dans des expériences de ChIP avec succès l'anticorps est choisi pour l'immunoprécipitation de la protéine d'intérêt. Des anticorps dirigés contre des facteurs de transcription de la plante peuvent être utiles pour l'analyse de la puce, mais ces sérums doivent être testés à fond parce que les anticorps vérifiés dans des expériences de Western blot ne sont pas nécessairement valables pour la puce. En outre, des anticorps dirigés contre des marqueurs différents sont fréquemment utilisés pour ce protocole. Anticorps ChIP grade reconnaissant spécifiquement une variété de marqueurs sont disponibles dans le commerce, et ont l'avantage qu'ils ont été testées dans plusieurs laboratoires. L'inconvénient de l'utilisation de ces anticorps commerciaux est que la protéine d'intérêt doit être fusionnée à l'épitope correspondantet exprimé dans des lignées transgéniques (figure 4B). Dans ce cas, il est recommandé de veiller à ce que la protéine chimérique est fonctionnel en générant des lignées transgéniques d'Arabidopsis portant la protéine de fusion dans un fond génétique déficiente en le gène codant pour notre protéine d'intérêt. La complémentation des anomalies phénotypiques de la lignée mutante dans les plantes transgéniques confirme que la protéine de fusion conserve l'activité normale de la protéine endogène. Lorsque lignées transgéniques sont produites pour identifier les sites de liaison de régulateurs transcriptionnels, il est préférable d'utiliser le promoteur endogène de conduire l'expression de la protéine marquée en évitant les problèmes associés à l'utilisation de promoteurs constitutifs forts (voir ci-dessus). Des anticorps spécifiques pour les modifications post-traductionnelles telles que la méthylation des histones ou l'acétylation de résidus spécifiques sont également souvent utilisés dans des analyses pour déterminer ChIP les paysages épigénomiques de gènes impliqués dans lala réglementation d'un certain nombre de processus de développement, y compris le contrôle des temps de floraison (figure 4C). Comme pour les anticorps contre les tags, les anticorps commerciaux Chip-grade sont l'option préférée dans le cas des marques des histones.
ChIP approches expérimentales couplées à l'expression du gène analyses ont contribué à accroître nos connaissances sur la façon dont les facteurs de transcription, des protéines de remodelage de la chromatine, et des modifications d'histone covalentes modulent l'expression de gènes impliqués dans la régulation de végétaux processus et les réponses biologiques. Initialement développé comme une méthode pour analyser l'interaction des protéines présentes dans la chromatine avec notamment les régions de loci ou gènes, l'éclatement de ressources génomiques et de la technologie NGS a permis puce pour devenir un outil puissant pour le profilage du génome entier de protéines de liaison à l'ADN de ces en tant que facteurs de transcription ou des histones modifiées et variantes des histones. ChIP-chip et ChIP-seq ont fourni une nouvelle dimen mondialeSion aux analyses des interactions entre les protéines et l'ADN de la chromatine chez Arabidopsis 2 5. Approches de puce suivants sont considérés comme l'alternative de choix pour ChIP-chip, qui est basé sur les tableaux d'hybridation et introduit un certain biais, étant donné que ces tableaux contiennent un nombre limité de sondes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
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