Summary
Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.
Introduction
De laatste jaren uiteenlopende genetische, moleculaire en genomische instrumenten ontwikkeld in het model species Arabidopsis thaliana. Deze technologie is enorm vergemakkelijkt de vooruitgang in het begrijpen van hoe de ontwikkeling van de plant wordt geregeld. Onder de ontwikkelingsprocessen bestudeerd met behulp van Arabidopsis als een model, heeft de genetische controle van de bloeitijd is uitvoerig geanalyseerd. Deze studies hebben aangetoond dat planten moduleren zeer nauwkeurig het tijdstip van bloei in reactie op endogene signalen zoals hormonen en de leeftijd van de plant, en ook voor het milieu signalen zoals fotoperiode en temperatuur die synchroniseren bloeitijd met de natuurlijke cyclus van de seizoenen 1, 2. De isolatie en karakterisering van Arabidopsis mutanten met veranderingen in de tijd van de bloei is in de onthulling van een complex netwerk van genen die de bloeitijd te regelen in reactie op endogene en omgevingsfactoren bepalend geweest. Deze genetische circuitsgeïntegreerd op het niveau van een paar meester genen die fungeren als schakelaars van de bloei, en de exacte timing van de bloemen initiatie is afhankelijk van het saldo van de bloei bevorderen en het onderdrukken van activiteiten die stroomopwaarts van de bloemen integrator genen 1,3 werken.
De functionele karakterisering van genen die voor hun rol in de controle van de bloei initiatie, geholpen door het recente gebruik van genomische benaderingen gebleken de centrale rol van transcriptionele regulatie bij de modulering van de bloeitijd. In feite zijn veel van de meester genen bloeiende coderen transcriptiefactoren 4. Daarnaast is een aantal chromatine hermodellering eiwitcomplexen invloed op de expressie van genen meester van de bloei. Een aantal van de Arabidopsis mutanten die veranderde hun bloeitijd bleek mutaties in genen die coderen voor verschillende chromatine modifiers dragen. Verschillende chromatine remodelers die posttranslationele modificaties in histon introducerene staarten, herpositioneren nucleosomen ten opzichte van het DNA of wisselen canonieke histonen door histone varianten nodig voor de goede regulering van de bloei in Arabidopsis 5,6. Sommige chromatine hermodellering activiteiten katalyseren de afzetting of verwijdering van covalente modificaties zoals acetylering of methylatie specifieke histon residuen. Deze histon markeringen worden specifiek herkend door gespecialiseerde effectoren dat andere chromatine remodeling complexen, transcriptiefactoren of onderdelen van de transcriptie machinerie te werven om de transcriptionele activiteit van bloeiende genen reguleren.
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) mogelijk maken om in vivo DNA-bindingsplaatsen voor eiwitten van belang (figuur 1). Deze procedure maakt gebruik van het vermogen van bepaalde chemische stoffen te verknopen de eiwitten aan het DNA. De resulterende DNA-eiwitcomplexen kan vervolgens worden geïmmunoprecipiteerd met specifieke antilichamen against transcriptiefactoren, chromatine-bindende eiwitten, of specifieke modificaties en heterologe epitopen (gewoonlijk aangeduid als "markeringen") bevestigd aan het eiwit van keuze. Het DNA gezuiverd uit deze immunologische neerslagen kunnen worden gebruikt als een matrijs in kwantitatieve PCR (qPCR) reacties beoordelen voor verrijking van specifieke sequenties van belang. Zo kunnen de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren of de verdeling van histon merken bepaalde genen worden vastgesteld 7,8. Bovendien, in combinatie met Next Generation Sequencing (NGS) dat massieve parallelle sequentiebepaling mogelijk maakt chiptechnologie is mogelijk genoom-brede identificatie van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren en onthulling epigenomisch landschappen van histon wijzigingen. Verder is de gelijktijdige analyse van genexpressie voor het bewaken hoe de binding van transcriptiefactoren of de depositie van specifieke histon markeringen gecorreleerd met transcriptionele activity van genen 9.
Het gebruik van ChIP protocollen Arabidopsis is toegestaan evaluatie van het effect dat verschillende transcriptionele regulatoren hebben voor de organisatie van de chromatinestructuur meester genen van bloei en hoe deze structurele veranderingen beïnvloeden genexpressie 5,6. Eerdere resultaten toonden aan dat de Arabidopsis locus EARLY builen IN korte dagen (EBS) fungeert als een repressor van bloei en mutanten in dit gen tonen een versnelling van bloei en opregulatie van de meester-gen van de bloei FT. Verder verlies-van-functie mutaties in FT volledig onderdrukken van de vroege bloei fenotype van de EBS mutante planten, wat aangeeft dat FT nodig is voor de voortijdige ontplooiing van EBS mutanten en dat EBS is voor de onderdrukking van deze meester gen van de bloei 10 , 11. EBS codeert voor een PHD-bevattend eiwit dat specifiek kan binden histon H3 di- en trigemethyleerd in the 4 lysine residu (H3K4me2 / 3), suggereert een rol voor EBS in de chromatine-gemedieerde repressie van FT 12. Het gebruik van de ChIP aanpak aangetoond dat de Arabidopsis-PHD bevattend eiwit EBS 10,11 bindt regulerende gebieden van de florale integrator gen FT haar uitspraken 12 onderdrukken. Aanvullende gegevens verkregen door toepassing van chiptechnologie toonde aan dat dit eiwit vereist is om lage niveaus van histone acetylering, een kenmerk van actieve transcriptie in het chromatine van deze meester gen van bloeiende behouden tijdens de initiële stadia van ontwikkeling Arabidopsis. Deze waarnemingen tezamen met genetische en genexpressie data aantonen dat Arabidopsis PHD-bevattende eiwit een centrale rol in de fijnafstelling van bloeitijd door het moduleren van de expressie van het gen floral integrator 12 FT. De hier gepresenteerde werk geeft een geoptimaliseerde werkwijze niet alleen bruikbaar voor de analyse van histonen, maar ook voor anderechromatine-geassocieerde eiwitten, en met een verhoogde efficiëntie en minder experimenteel tijd. Voorts is dit verslag illustreert hoe het gebruik van ChIP protocols nieuwe inzichten voorziet in de relatie tussen veranderingen in chromatine modificaties en transcriptionele toestanden van plantengenen, en hoe deze chromatine-gemedieerde controlemechanismen effect genexpressie op het begin van de bloei in Arabidopsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verknoping van het plantenmateriaal (1 uur)
- Groeien de Arabidopsis-lijnen die in het experiment (wild type - WT - versus mutanten, en / of lijnen expressie de gecodeerde versie van het eiwit van interesse tot expressie lijnen versus het label niet gefuseerd aan een eiwit) gedurende 12-18 dagen op grote petrischalen (150 mm) met MS-agar medium (1 L: 1x Murashige & Skoog zouten, 10 g sucrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Als alternatief, groeien planten op potten met 3: 1 mix van bodem en vermiculiet.
LET OP! Formaldehyde is giftig bij inademing, aanraking met de huid, en moet in een chemische kap dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen worden behandeld. Stappen 1,2-1,6 moet onder de zuurkast worden uitgevoerd. - Maak kleine gaatjes in het deksel van de 50 ml buizen met een laboratoriumbrander verwarmde naald. Voeg 40 ml 1x PBS buffer en 1,08 ml formaldehyde tot een eindconcentratie van 1% (37% stock sresolutie). Verzamel in die 50 ml tubes 1,5 gram plantenmateriaal. Houd de buisjes op ijs tijdens verknopen.
- Sluit de 50 ml buizen met deksel. Plaats de buizen in een exsiccator en toepassen vacuum. Vacuüm infiltreren het weefsel voor 10 min, laat dan het vacuüm voorzichtig, om te voorkomen dat karnen van de oplossing. Meng het monster. Herhaal tweemaal. Na infiltratie, acht het plantmateriaal en bevestigen dat het wordt licht doorschijnend en neigen te zinken naar de bodem van de buis (figuur 2).
- Voeg 2,5 ml van 2 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M. worden gerealiseerd vacuüm gedurende 5 min. Glycine werkt als een competitieve remmer van formaldehyde crosslinking.
- Gooi de PBS formaldehyde-glycine-oplossing door het inverteren van de gesloten 50 ml buis met gaten in het deksel.
- Tweemaal met 1x PBS en eenmaal spoelen met water plantjes werp de wasoplossing zoals beschreven in stap 1,5. Droog ze op een papieren handdoek en bevriezen in vloeibare nitrogen.
OPMERKING: Bevroren weefsel kan bij -80 ° C worden bewaard weken.
2. Bereiding van antilichamen (1 dag)
Opmerking: Voor immunoprecipitatie, wordt het gebruik van magnetische korrels geconjugeerd met antilichamen via een eiwit G of eiwit een linker met hoge affiniteit voor het constante domein van de zware keten antilichaam aanbevolen. De DNA-eiwitcomplexen kan niet-specifiek hechten aan het oppervlak van de beads-antilichaam conjugaten. Daarom is het noodzakelijk om controles uit te voeren zonder specifieke antilichamen tegen het niet-specifieke achtergrondbinding te kwantificeren.
- Voor elke immunoprecipitatie bereiden 15 ul van magnetische korrels in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Het aantal kralen afhankelijk van de hoeveelheid van het chromatine gebruikt voor immunoprecipitatie en ook de antilichamen.
- Te wassen, voeg 1 ml chromatine immunoprecipitatie (ChIP) verdunningsbuffer om de kralen, meng door rotatie en plaats de 1,5 ml microcentrifuge tuin een magnetisch rek. Wacht ongeveer 1 minuut te laten de kralen hechten aan de magneet. Met de 1,5 ml microcentrifugebuizen nog in het rek, verwijder het supernatant door pipetteren. Herhaal tweemaal.
OPMERKING: Voor iedere plant lijn immunoprecipitatie twee sets nodig: één met de kralen en antilichaam (Ab) en een tweede geen antilichaam (No-Ab) controle met slechts magnetische korrels. - Resuspendeer de kralen in 200 ul ChIP verdunningsbuffer. Voeg de vereiste hoeveelheid van de specifieke Ab een van de twee buizen voor ieder plantenlijn (de exacte verdunning verschilt per Ab en moet experimenteel worden geoptimaliseerd of, in het geval van commerciële antilichamen, de instructies van de fabrikant). Gebruik dit monster voor immunoprecipitatie. Voeg dezelfde hoeveelheid niet-specifieke IgG aan de andere buis, die zal worden gebruikt als negatieve controle.
- Incubeer O / N op een draaiend wiel bij 4 ° C te laten de antilichamen hechten aan de kralen.
3. Chromatine Extraction (4 uur)
Opmerking: In deze stap worden de kernen en de organellen zullen pellet. ExB 1 bevat voldoende sucrose tot hoge dichtheid verschaffen en te voorkomen dat verstoring van organel structuur.
OPMERKING: ExB 2 bevat 1% Triton X-100 om te helpen barsten de chloroplasten open en verwijder chlorofyl.
OPMERKING: Deze stap helpt bij het verwijderen van het reinigingsmiddel uit het monster.
LET OP: Dezebuffer bevat SDS, om de kernen lyseren en laat de chromatine.
LET OP! Zorg ervoor dat het oor beschermingsmiddelen te dragen tijdens het sonicatie stap in het geval dat de echografie-apparaat niet is opgenomen in een geluiddichte kast.
Cruciale stap! De chromatine fragmentatie is grotendeels afhankelijk van de ultrasoonapparaat apparatuur. De sonicatie voorwaarden moeten worden aangepast om verrijking bereiken in de geschikte DNA afmetingen. BekijkenFiguur 3 voor een voorbeeld van hoe de chromatine fragmentatie te optimaliseren.
Opmerking: De monsters kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -20 ° C gedurende enkele weken.
4. Immunoprecipitatie van het eiwit van belang en de Redding van DNA (1 dag, 3 uur)
- Was de korrels gecoat met Ab uit stap 2,4 driemaal met 1 ml ChIP verdunningsbuffer om overmaat antilichaam te verwijderen, zoals beschreven in stap 2.2. Hersuspenderen in 200 pl ChIP verdunningsbuffer. Voeg 50 ul van geïsoleerde chromatine. Incubeer O / N op een draaiend wiel bij 4 ° C.
OPMERKING: Controleer de concentratiop het chromatine in microvolume UV-Vis spectrofotometer. 50 pl geïsoleerde chromatine zou meer dan 10 ug DNA bevatten. - Voor de stappen 4,2-4,5 werk in 4 ° C. Was de kralen tweemaal in 1 ml laag zout wasbuffer zoals beschreven in stap 2.2.
- Was de korrels eenmaal in 1 ml High Salt wasbuffer.
- Was de korrels eenmaal in 1 ml LiCl wasbuffer.
- Was de kralen tweemaal in 1 ml TE-buffer. Na de laatste wasbeurt, zorg ervoor dat de TE-buffer links in de buis volledig te verwijderen door aspiratie met een pipet.
- Haal de INPUT monsters (stap 3.9). Overdracht 5 pi van de invoer voor een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en verder zoals de ChIP monsters. Omgekeerde verknoping door toevoeging van 200 ul van 5% chelateringsionenuitwisselingshars en incubeer gedurende 10 min bij 95 ° C schudden elke 2-3 min. Spin neer op 16.000 xg gedurende 30 sec en de bovenstaande zorgvuldig te dragen naar een nieuwe microcentrifugebuis door pipetteren.
OPMERKING: Terwijl de tranele werkwijze voor het verknopen omkering gaat om een O / N incubatie met NaCl, de incubatie met een ion chelerende hars bij 95 ° C maakt efficiënte decrosslinking en elutie van DNA in 10 min, dus waardoor het protocol een dag korter. - Voeg 2 pl proteinase K (10 mg / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min om eiwitten te verteren en vrij DNA.
- Stop de reactie door incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min.
- Snel draaien bij 16000 g gedurende 30 sec en overbrengen supernatant naar een nieuwe buis door pipetteren.
- Reinig het DNA geïsoleerd met behulp van een standaard DNA-fragmenten zuiveringskit.
OPMERKING: Ga volgens de instructies van de fabrikant. - Breng de DNA bindende kolom uit de kit een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Elueer het gezuiverde DNA door het toevoegen van 20 gl DNase-vrij water tot het midden van de kolom en centrifugeren bij 16.000 xg gedurende 60 sec. Stoppunt: monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken. 5. Het meten van Overvloed van de bindingsplaatsen in de Immunologisch DNA door qPCR (4 uur)
- Ontwerp van primers voor genoomgebieden plaats met een smelttemperatuur (Tm) van 60 ° C en een GC-gehalte van 30% -80%. Zoals chromatine gefragmenteerd door sonificatie, moet de lengte van de geamplificeerde sequentie niet meer dan 150-200 nucleotiden (tabel 1) zijn.
LET OP: Een handig hulpmiddel voor primer ontwerp is Primer 3-programma (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Aanvullende richtlijnen voor primer ontwerp zijn beschikbaar in eerdere rapporten 8, 14,15. - Gebruik een BLAST programma om ervoor te zorgen dat de primers zijn specifieke (vooral promotors kan dit TF bindingssequenties delen) en test de primer efficiëntie using 01:10 verdunningen in water van de input DNA (stap 4.9). Bepaalde gebieden van het genoom beter dan anderen worden gezuiverd. Het is daarom belangrijk om PCR primers te ontwerpen en controleren van het verdunde ingang DNA.
- Verdun het gezuiverde DNA 1:10 met water en Pipetteer 5 ul van de verdunde DNA in een PCR-buis voor elke reactie.
OPMERKING: Verdun alleen de hoeveelheid nodig omdat DNA kan hechten aan de wanden van de 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Multiple-ontdooien bevriezen cycli toename van het aantal aangesloten DNA-moleculen. Voor elk primerpaar, versterking in de ingang, Ab-chip en geen Ab-chip moet worden geanalyseerd. - Om de PCR mix af, voeg SYBR Green PCR Master Mix tot een uiteindelijke concentratie van 1x en 0,5 uM van elke primer. Vullen tot 20 ul met DNase-vrij water.
- Voer de qPCR reactie volgens de instructies van de SYBR Green PCR master mix fabrikant.
- Data-analyse door voudige verrijking methode.
- Maak een spreadsheet met samples namen en ruwe Ct-waarden die zijn verkregen na qPCR reactie.
- Voor elk monster af te trekken van zijn ruwe Ct-waarde van de ruwe Ct-waarde verkregen voor de overeenkomstige No-Ab controle. NB: Na deze wiskundige bewerking, zal Ct waarde voor No-Ab sample gelijk aan 0.
- Bereken voudige verrijking met machtsverheffing bediening met base 2 en exponent (power) gelijk aan de negatieve rest verkregen in stap 6.1.2 (tabel 2).
voudige verrijking = 2 - (Ct (monster) - Ct (No-Ab))
LET OP: In deze method de overvloed van een specifiek DNA-fragment in de ChIP-ed monster wordt vergeleken met de overvloed van dit fragment in No-Ab controle. De aanname van deze methode is dat het niveau van achtergrondsignaal reproduceerbaar verschillende primer sets, monsters en repliceren experimenten. Echter, dit'noise' signaal niveaus variëren tussen de primer sets, monsters, en experimenten.
- Data-analyse door% van de input-methode.
- Maak een spreadsheet met samples namen en ruwe Ct-waarden die zijn verkregen voor hen na qPCR reactie.
- Pas ruwe Ct-waarden voor ingangsmonsters door het aftrekken van een waarde van 2 logaritme van de fractie van het totaal geëxtraheerde chromatine dat werd genomen als input.
NB: In dit protocol is gelijk aan de afgetrokken waarde 3,32, als 10% van de totale chromatine werd genomen als input in dit protocol. Log 2 (10) gelijk aan 3,32. - Bereken% van de input door vermenigvuldiging met 100 de waarde van machtsverheffing bediening met base 2 en exponent (power) gelijk aan resterende aangepaste invoerwaarden afgetrokken van ruwe Ct-waarden van de steekproef (Tabel 3).
% Van de input = 100 * 2 (aangepaste ingang - Ct (monster))
OPMERKING: Bij deze procedure wordt de relatie tussen specifieke DNA overvloed in het ChIP-ed monster op de totale geïsoleerde chromatine (ingangsmonster) berekend. Aanvullende informatie over ChIP gegevensanalyse u naar Haring et al. 8.
OPMERKING: DNA geïsoleerd uit het neergeslagen chromatine moet worden geanalyseerd om te bepalen welke DNA-fragmenten ChIP-ed zijn van de totale chromatine, vanwege de binding aan het eiwit van belang.
6. Data Analysis
OPMERKING: Onder de existing methoden voor de analyse ChIP-data, worden twee meest gebruikte. De eerste daarvan is de vouw verrijking methode, ook genoemd als "relatieve verrijking ',' signaal over achtergrond" of "ten opzichte van de niet-antilichaamcontrole. De tweede methode wordt genoemd als "% van de invoer".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acht belangrijke stappen kunnen uitgevoerd worden uitgekozen in dit ChIP protocol voor het identificeren van in vivo eiwit-DNA-interacties, waaronder kweken en oogsten van plantenmateriaal, verknoping van chromatine, chromatine isolatie, chromatine fragmentatie, selectieve isolatie van de complexen tussen DNA en het eiwit van belang door immunoprecipitatie, eiwitvertering, DNA-zuivering, en qPCR analyse (Figuur 1). Een cruciale stap in de ChIP protocol is de fixatie van DNA-eiwit interacties in een verknopingsreactie. Gewoonlijk wordt formaldehyde verknoping gebruikt in plantaardige ChIP. Formaldehyde penetreert het weefsel en creëert methyleenbruggen tussen NH 2 groepen van eiwitten of eiwitten en nucleotiden in het DNA 1 6. Een efficiënte fixatie van nucleoproteïne complexen in vivo vereist dat formaldehyde chromatine binnen de fabriek kernen bereikt, en het is essentieel dat plantenweefsel is volledig ondergedompeld in tHij formaldehyde buffer om tijdens immunoprecipitatie het eiwit-DNA-complexen effectief afgebroken. Arabidopsis bladeren zijn bedekt met waslaag moeilijk de penetrantie van het verknopingsmiddel in de cellen. Bovendien trichomen begunstigen de vorming van luchtbelletjes op het oppervlak van de bladeren, waardoor de formaldehyde oplossing in het binnenwerk van het plantenweefsel. Om deze beperking te overwinnen, in deze stap vacuum wordt aangebracht op de monsters voorkomen van de vorming van luchtbellen in het fixatie-oplossing en verbetering van de penetratie van formaldehyde in de kernen van alle cellen. Zaailingen na efficiënte verknopingsbehandeling zijn weergegeven in figuur 2.
Een andere belangrijke stap in de chip protocol chromatine scheren. Grote chromatine fragmenten kunnen resulteren in lage resolutie in kaart brengen van de bindingsplaatsen van het eiwit van interesse in de DNA-sequentie. Daarentegen kunnen zeer kleine fragmenten efficiënte amplificatie belettenhet gebonden DNA door qPCR. Volgens empirische ervaring moet de optimale chromatine grootte bereik voor ChIP analyse tussen de 200 en 600 bp, en de voorwaarden om de juiste versnippering van het chromatine moeten worden ingesteld, afhankelijk van de ultrasoonapparaat apparaat beschikbaar zijn in het laboratorium te bereiken. Figuur 3 toont de procedure chromatine afschuiving optimaliseren om het maximale verrijking in het gewenste bereik van DNA afmetingen bereiken. Voor sonicatie, chromatine bestaat voornamelijk uit zeer grote fragmenten. Een verhoogd aantal cycli sonificatie geleidelijk vermindert de gemiddelde grootte van de DNA in ChIP monsters bereiken van de optimale verrijking in het bereik van 200-600 bp na 20-30 cycli (punt 3.8 van het protocol en figuur 3).
Hier wordt de identificatie van de EBS eiwitbindingsplaatsen op regulerende gebieden van de bloemen integrator FT als voorbeeld van het nut van de ChIP techniek. De binding van EBS aan tHij FT locus ontrafeld door middel ChIP assays met Arabidopsis lijnen expressie een cMYC EBS-fusie-eiwit onder controle van de natieve promoter EBS (PEBS :: cMYC-EBS). Deze tag versie van EBS volledig functioneel, zoals aangegeven door het wildtype fenotype van EBS mutante planten die dit construct. Vier regio's binnen de genomische FT locus werden getest op EBS binden; een in het promotorgebied van het gen (FTII), twee rond de transcriptionele startplaats (FTIV, FTVI), en een andere in het eerste intron van FT (FTVII) (Figuur 4A). Zoals getoond in figuur 4B, ChIP resultaten tonen aan dat de EBS-eiwit een regulerende sequentie dichtbij de transcriptionele startplaats van de meester gen bloei FT 12 kunnen binden. Verder kan het EBS-eiwit interactie zowel in vitro als in vivo met histone deacetylases zoals hda6 ander chromatine-gerelateerd eiwit betrokken bij de regulatievan de bloeitijd in Arabidopsis 1 7. Om de mogelijke invloed van EBS op de niveaus van histone acetylering bij de genomische regio FT beoordelen, werden ChIP assays uitgevoerd met een antilichaam gericht tegen histon H3 geacetyleerd in lysines 9 en 14, een histon markering gecorreleerd met transcriptioneel actief chromatine 1 2 . Bovendien zijn deze gegevens illustreren hoe ChIP benaderingen kunnen bijdragen aan het licht te werpen op de moleculaire mechanismen die de transcriptionele regulatie van plantaardige ontwikkelingsprocessen moduleren.
Figuur 1. Schema van de Chromatine immunoprecipitatie protocol. ChIP is een techniek gebruikelijke interacties tussen eiwitten en DNA, door een chemische verbinding vast te onderzoeken. Chromatine met geconserveerde interacties geïsoleerd van de kernen en gefragmenteerd. Door het gebruik van antilichamen tegen het eiwit van belang,we kunnen fragmenten van DNA verbonden om het te selecteren. Het antilichaam is geconjugeerd met magnetische kralen die snelle en simpele isolatie met een magnetische rek mogelijk maken. Daarna worden eiwitten verwijderd door proteinase behandeling en DNA vrijkomt. Gezuiverd DNA-fragmenten worden vervolgens gebruikt als sjablonen in qPCR reacties op hun relatieve rijkdom te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Voorbeeld van een weefsel na verknoping met formaldehyde. Om de interacties tussen DNA en eiwitten te onderzoeken in vivo complexen moeten bevestigd worden ze stabiel en duurzaam door meerdere stappen van het protocol. In deze versie van het protocol, fixatie gebeurt door formaldehyde behandeling. Efficiënte penetratie van formaldehyde thrdoorgedreven het weefsel is cruciaal voor het succes van de chip werkwijze. (A) Voor de verknopingsstap het plantenmateriaal drijft op het oppervlak van de oplossing en is bedekt met kleine luchtbelletjes; de abaxiale en adaxiale oppervlakken van de bladeren verschillen in kleur. (B) Na fixatie, moet plantjes zichtbaar worden geweekt in de oplossing, licht transparant, en gelijkmatig ondergedompeld in de verknoping oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Optimalisatie van sonicatie voorwaarden voor ChIP analyse. Chromatine geïsoleerd uit vast materiaal bestaat uit uiteenlopende fragmenten lengten met een sterke band aan de bovenkant van de gel die extreem lange chromatine afmetingen (tweede lijn links). Met increazingen aantal sonicatie cycli, is het hoogtepunt van chromatine fragmenten maten verschoven naar kleinere fragmenten. In het getoonde experiment, optimale cyclus getallen variëren tussen 20 en 30, waarna de optimale chromatine fragmenten, variërend van 200 tot 600 bp zijn meer overvloedig in de chip monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. ChIP-analyses blijkt dat EBS bindt FT en EBS mutaties veranderen het niveau van de histon H3 acetylering in deze bloemen integrator gen. (A) Genomic regio FT met zwarte dozen die exons. Vier fragmenten verspreid over regulerende gebieden van deze bloemen integrator gen werden getest (grijsboxes) van dat specifieke qPCR primers. (B) EBS bindt de regio FT IV, ligt dicht bij de transcriptie startplaats. Myc-EBS overeenkomt met mutantplanten EbS uiting van de cMYC-gemerkte versie van EBS; Myc geeft transgene planten die het cMYC-epitoop niet gefuseerd aan een gen van Arabidopsis. (C) EBS mutant planten geven hogere overvloed aan H3K9,14Ac dan wild type Landsberg erecta (L re) in alle vier de regio's FT beoordeeld. Foutenbalken tonen de standaarddeviatie (B en C). Gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde gegevens in The Plant Cell 1 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Vooruit | Omgekeerde | Regio getest |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabel 1. Primers gebruikt in deze studie.
| Monster | Ruwe Ct Waarden | Ct-Ct (No-Ab) | Voudige verrijking 2 - (Ct (monster) - Ct (No-Ab)) |
| No-Ab | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5,3 | 39.4 |
Tabel 2. Voorbeeld van de chip data-analyse door "fold verrijking" methode. Ct-waarden voor No-Ab monsters vertegenwoordigen de achtergrond signaal veroorzaakt door niet-specifieke binding van DNA aan de Ab / magnetische korrels. De Ct-waarden hoger mag zijn dan 30. Het verschil tussen de Ct-waarden van No-Ab en Ab monster moet hoger zijn dan 1.
| Stap 1 - Stel de ingang | |||
| Aangepaste ingang = Raw Ct (input) - Log 2 (fractie van de totale chromatine) | |||
| Ruwe Ct | input van de totale chromatine | Log 2 10 | |
| Invoer | 29.5 | 10% | 3.32 |
| Aangepaste ingang = 29,5-3,32 = 26,18 | |||
| Stap 2 -% van de input berekeningen | |||
| Monster | Ruwe Ct | Ct (aangepaste input) -CT (monster) | 2 Ct (aangepaste input) -CT (monster) * 100% |
| Invoer | 26.18 | ||
| ChIP-Ab | 31,45 | -5,27 | 2.59 |
| No-Ab | 34.5 | -8,32 | 0.31 |
Tabel 3. Voorbeeld van de chip data-analyse door "% van de input" methode. Ingangen vertegenwoordigen de totale verknoopte chromatine geïsoleerd van kernen, zodat de Ct-waarden moet gelijk zijn voor alle primer paren zijn. Gebruikelijk is 5% of 10% van het totale chromatine genomen als ingang. No-Ab vormt een negatieve controle monster - de kralen niet bedekt door specifieke antilichamen tegen het eiwit of de tag van interest. ChIP-Ab staat voor het monster na de immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit of tag van belang.
| PBS 10x |
| 1,3 M NaCl |
| 30 mM Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Extractiebuffer 1 (ExB 1) |
| 0,4 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl |
| 5 mM β-Mercaptoethanol |
| Proteaseremmers |
| Extractiebuffer 2 (ExB 2) |
| 0,25 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl2 |
| 1% Triton X-100 </ td> |
| 5 mM β-Mercaptoethanol |
| Proteaseremmers |
| Extractiebuffer 3 (ExB 3) |
| 1,7 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 0,15% Triton X-100 |
| 2 mM MgCl2 |
| 5 mM β-Mercaptoethanol |
| Proteaseremmers |
| Sonicatiebuffer |
| 50 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| Proteaseremmers |
| ChIP verdunningsbuffer |
| 1,1% Triton X-100 |
| 1,2 mM EDTA |
| 16,7 mM Tris-HCl pH 8 |
| 167 mM NaCl |
| Proteaseremmers |
| Laag zout buffer |
| 150 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| High Salt Wasbuffer |
| 500 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| LiCl Wasbuffer |
| 0,25 M LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% natriumdeoxycholaat |
| 1 mM EDTA |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 1 mM EDTA |
Tabel 4. Buffer samenstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ChIP protocol beschreven is een reproduceerbare en krachtige techniek interacties tussen eiwitten en specifieke DNA-sequenties in vivo analyse in Arabidopsis planten. Een succesvolle identificatie van bindingsplaatsen voor de eiwitten van belang vereist een adequate selectie van plantaardige organen of ontwikkelingsstadia waar de relevante interacties daadwerkelijk plaatsvinden. Bovendien is het essentieel om de juiste fixatie van het plantenmateriaal en een optimale afschuiving van het chromatine door sonicatie verkrijgen. Zeer specifieke antilichamen voor de efficiënte immunoprecipitatie van de geselecteerde eiwit / tag zijn ook essentieel.
Het gebruik van ChIP benaderingen in planten geconfronteerd met een aantal problemen in verband met de aanwezigheid van secundaire metabolieten en celwanden die mogelijk kan interfereren met de verschillende stappen van het protocol. Bovendien is de complexiteit van plantenorganen, vaak met meerdere celtypen waarin het DNA-bindende eiwit interest kan differentieel aanwezig of actief zijn, hebben het gebruik van deze methodologie belemmerd. Daarom, wanneer mogelijk is het zeer voordelig om te gebruiken in ChIP nadert homogene weefsels waar de aanwezigheid en / of activiteit van het eiwit van belang zijn al aangetoond. Complex plantaardige materialen met verschillende weefsels de neiging om een verdunning van de celtypen, waar het eiwit daadwerkelijk functies veroorzaken. Tissue snijden 2 0 zijn gebruikt in installaties voor studies in individuele weefsels of celtypen. Echter, de laatste jaren verschillende procedures ontwikkeld voor de isolatie van celtype specifieke chromatine in Arabidopsis 8 een reeks optimale fragmenten (zie Representatieve resultaten sectie) 7. Zoals hierboven besproken, de voorwaarden waaraan deze grootteverdeling bereiken sterk afhankelijk van de specifieke ultrasone apparatuur. In elk geval moet chromatine bij lage temperatuur worden gehouden omkering van de verknoping favoriete voorkomendoor de warmte die tijdens sonicatie. De sonicatie Inrichting keuze moet een goede reproduceerbaarheid, die samen met optimale fragmentatie omstandigheden, is essentieel voor ChIP analyse (Figuur 3) te verschaffen.
Een andere belangrijke factor in de succesvolle ChIP experimenten is gekozen antilichaam voor immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Antilichamen opgewekt tegen planten transcriptiefactoren kan nuttig zijn voor ChIP analyse, maar deze sera moeten grondig worden getest, omdat antilichamen gecontroleerd Western blot experimenten zijn niet altijd geldig voor chip. Verder worden antilichamen opgewekt tegen verschillende labels vaak gebruikt voor dit protocol. ChIP-grade antilichamen die specifiek herkent verschillende labels zijn in de handel verkrijgbaar en hebben het voordeel dat ze zijn getest in diverse laboratoria. Het nadeel van het gebruik van deze commerciële antilichamen is dat het eiwit van belang te worden gefuseerd met het overeenkomstige epitoopuitgedrukt in transgene lijnen (Figuur 4B). In dat geval is het raadzaam dat de chimere eiwit functioneel door het genereren van Arabidopsis transgene lijnen met het fusie-eiwit in een genetische achtergrond die deficiënt is in het gen dat codeert voor ons eiwit van interesse. De complementatie van de fenotypische afwijkingen van de mutant lijn in de transgene planten zal bevestigen dat het fusie-eiwit behoudt de normale activiteit van het endogene proteïne. Bij transgene lijnen geproduceerd op de bindingsplaatsen van transcriptionele regulatoren te identificeren, verdient het de voorkeur de endogene promotor gebruikt om de expressie van het gelabeld eiwit te drijven, waardoor de problemen verbonden met het gebruik van sterke constitutieve promoters (zie hierboven). Specifieke antilichamen voor histon posttranslationele modificaties zoals methylering of acetylering van bepaalde residuen worden ook vaak gebruikt in ChIP analyses om de epigenomisch landschappen van genen betrokken bij het bepalenregulering van een aantal ontwikkelingsprocessen, met inbegrip van de beheersing van de bloeitijd (Figuur 4C). Als de antilichamen tegen markeringen, ChIP-grade commerciële antilichamen de voorkeur bij histon markeringen.
ChIP experimentele benaderingen gekoppelde genexpressie analyses instrumenteel bij het vergroten van kennis over hoe transcriptiefactoren, chromatine remodeling proteïnen en histone covalente modificaties moduleren de expressie van genen betrokken bij de regulatie van plantaardige biologische processen en reacties zijn. Oorspronkelijk ontwikkeld als een methode om de interactie van de in het chromatine met bijzondere loci of gengebieden eiwitten te analyseren, is het uiteenspatten van genomische bronnen en NGS technologie kon ChIP een krachtig instrument voor het genoom-brede profilering van DNA-bindende eiwitten, worden als transcriptiefactoren of gemodificeerde histonen en histon varianten. ChIP-chip en ChIP-seq hebben een nieuwe wereldwijde Dimen voorziensie de analyses van chromatine interacties tussen eiwitten en DNA in Arabidopsis 2 5. ChIP-seq methoden worden als alternatieve keuze voor ChIP-chip, die is gebaseerd op hybridisatie arrays en introduceert een lichte voorkeur, aangezien deze arrays bevatten een beperkt aantal probes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y.
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M.
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R.
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
