Summary
immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.
Introduction
בשנים האחרונות מגוון רחב של כלים גנטיים, מולקולריים והגנומי פותחו בthaliana ארבידופסיס מיני מודל. טכנולוגיה זו יש להקל מאוד את ההתקדמות בהבנה כיצד התפתחות צמח מוסדרת. בין התהליכים התפתחותיים למדו באמצעות ארבידופסיס כמודל, הבקרה הגנטית של זמן פריחה כבר נותחה בהרחבה. מחקרים אלה הראו כי צמחים לווסת בדיוק מאוד הזמן של פריחה בתגובה לרמזים אנדוגני כגון הורמונים והגיל של הצמח, וגם לאותות סביבתיים כגון photoperiod וטמפרטורה לסנכרן פריחת זמן עם מחזור הטבעי של עונות 1, 2. הבידוד והאפיון של מוטציות ארבידופסיס עם שינויים בזמן של פריחה היה הקובע בחשיפת רשת מורכבת של גנים המווסתים את זמן הפריחה בתגובה לגורמי אנדוגני והסביבתיים. מעגלים הגנטיים אלהמשולב ברמה של כמה גני הורים הפועלים כמתגים של פריחה, והעיתוי של הייזום הפרחוני המדויק תלוי באיזון של פריחת קידום ומדחיק את פעילות שעובדות במעלה הזרם של גני אינטגרטור הפרחוני 1,3.
האפיון הפונקציונלי של הגנים שזוהו על תפקידם בשליטה של ייזום פריחה, נעזר בשימוש האחרון של גישות הגנומי, חשפו את התפקיד המרכזי של רגולציה תעתיק באפנון של זמן פריחה. למעשה, רבים מהגנים ההורים של שעתוק לקודד פריחת גורמי 4. בנוסף, מספר מתחמי חלבון שיפוץ הכרומטין להשפיע על הביטוי של גני הורים של פריחה. מספר מוטציות ארבידופסיס המבודדים לזמן הפריחה שינה התברר לשאת מוטציות בגני מקודדי מגוון של מכפילי הכרומטין. remodelers הכרומטין שונה שמציג את השינויים בposttranslational Histonדואר זנבות, למקם nucleosomes ביחס ל- DNA או להחליף ההיסטונים הקנונית על ידי גרסאות היסטון נחוצים לוויסות הנכונה של הפריחה בארבידופסיס 5,6. חלק מפעילויות שיפוץ הכרומטין אלה לזרז את התצהיר או הסרת שינויים קוולנטיים כגון acetylation או מתילציה בשאריות היסטון ספציפיות. סימני היסטון אלה מוכרים במיוחד על ידי effectors מיוחדת שמגייסות מתחמים אחרים שיפוץ הכרומטין, גורמי שעתוק או רכיבים של מכונות תעתיק להסדיר את פעילות תעתיק של גנים פורחים.
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מאפשר זיהוי של in vivo אתרים לחלבונים של עניין מחייב DNA (איור 1). הליך זה מנצל את היכולת של כימיקלים מסוימים לקישור צולב חלבונים לדנ"א. מתחמי DNA החלבון וכתוצאה מכך ניתן immunoprecipitated אז באמצעות אגא נוגדנים הספציפיגורמי שעתוק Inst, מחייב חלבוני הכרומטין, או שינויים מסוימים וepitopes Heterologous (המכונים "תגים" בדרך כלל) שצורפו לחלבון של בחירה. ה- DNA מטוהר מimmunoprecipitates אלה יכול לשמש כתבנית בתגובות PCR (qPCR) כדי להעריך להעשרה של רצפים מסוימים של עניין. בדרך זו, ניתן להקים אתרי הקישור של גורמי שעתוק או ההפצה של סימני היסטון בגנים מסוימים 7,8. בנוסף, בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS) המאפשר רצף מקביל מאסיבי, טכנולוגיית שבבים הפכה אפשרית זיהוי הגנום של אתרי הקישור של גורמי שעתוק כמו גם נופי epigenomic הסרת לוט משינויי היסטון. יתר על כן, הניתוח בו זמני של ביטוי גנים מאפשר ניטור איך המחייב של רגולטורי תעתיק או התצהיר של סימני היסטון מסוימים לתאם עם תעתיק פעילויותיוty של גנים 9.
השימוש בפרוטוקולי שבב בארבידופסיס אפשר להעריך את ההשפעה שמגוון של רגולטורי תעתיק יש בארגון הכרומטין של גני הורים של פריחה וכיצד שינויים המבניים אלה משפיעים על ביטוי גני 5,6. תוצאות קודמות הראו כי הנעילה מוקד ארבידופסיס מוקדם בימים קצרים (EBS) פועלת כמדכאת של פריחה ומוטציות בגן זה מופע ההאצה של פריחה וגברת ביטוי של גן ההורים של FT פריחה. בנוסף, מוטציות פסד של הפונקציה בFT לדכא באופן מלא את הפנוטיפ הפריחה המוקדם של הצמחים מוטנטים EBS, המצביע על כך FT דרוש לפריחה המוקדמת של מוטציות EBS ושEBS הוא הכרחי לדיכוי של גן הורים זה של פריחת 10 , 11. EBS מקודד חלבון המכיל PHD שיכול להיקשר באופן ספציפי di- היסטון H3 וtrimethylated בהליזין דואר 4 שאריות (H3K4me2 / 3), המצביעות על תפקיד לEBS בדיכוי בתיווך הכרומטין של 12 FT. השימוש בגישת השבב הוכיח כי EBS החלבון המכיל PHD ארבידופסיס 10,11 נקשר אזורי רגולציה של FT גן אינטגרטור הפרחוני להדחיק ביטויה 12. נתונים נוספים שהושגו באמצעות השימוש בטכנולוגיית השבבים הראו כי נדרש חלבון זה כדי לשמור על רמות נמוכות של acetylation היסטון, סימן היכר של שעתוק פעיל, בהכרומטין של גן הורים זה של פריחה בשלבים ראשוניים של פיתוח ארבידופסיס. תצפיות אלה, יחד עם נתונים ביטוי גנטי וגן, להוכיח שיש חלבון זה ארבידופסיס PHD המכיל תפקיד מרכזי בכוונון העדין של זמן פריחה על ידי ויסות הביטוי של גן אינטגרטור הפרחוני 12 FT. העבודה המוצגת כאן מספקת שיטה מותאמת שימושית לא רק לניתוח של ההיסטונים אלא גם לאחריםהכרומטין קשורים חלבונים, ועם התייעלות וצמצום זמן ניסוי. יתר על כן, דו"ח זה מדגים כיצד השימוש בפרוטוקולי שבב סיפק תובנות חדשות את הקשר בין שינויים בשינויי הכרומטין ומדינות תעתיק של גני צמח, וכיצד מנגנונים אלה בתיווך הכרומטין של השפעת שליטת ביטוי גנים בתחילת הפריחה בארבידופסיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Crosslinking של צמח החומר (1 שעה)
- לגדול קווי ארבידופסיס השתמשו בניסוי (הסוג בר - WT - לעומת מוטציות, ו / או קווים המבטאים את הגרסה מתויגת של חלבון עניין שלך לעומת קווים המבטאים את התג לא התמזגו לכל חלבון) ל12-18 ימים בצלחות פטרי גדולים (150 מ"מ) עם (1 ליטר: מלחי 1x Murashige & Skoog, סוכרוז 10 גרם, MES 0.5 גרם, pH 5.7 (KOH), אגר 1%) הבינוני MS-אגר. לחלופין, לגדל צמחים בעציצים המכילים 3: 1 תערובת של אדמה ורמיקוליט.
זהירות! פורמלדהיד הוא רעיל על ידי שאיפה, במגע עם עור ואם נבלע, ויש לטפל במנדף כימי לובש ציוד מגן אישי מתאים. צעדים 1.2-1.6 צריכים להתבצע מתחת למכסת מנוע קטר. - לעשות חורים קטנים במכסה של 50 מיליליטר הצינורות עם מחט מבערים מחוממים מעבדה. הוסף 40 מיליליטר של 1x PBS חיץ ו1.08 מיליליטר של פורמלדהיד לריכוז סופי של 1% (של 37% מניותolution). לאסוף 1.5 גרם של חומר צמחי בצינורות 50 מיליליטר אלה. שמור את הצינורות על קרח במהלך crosslinking.
- סגור את הצינורות 50 מיליליטר עם המכסה. מניחים את הצינורות בתא ייבוש ולהחיל ואקום. אבק לחדור את הרקמה למשך 10 דקות, ואז לשחרר את הוואקום בזהירות, כדי למנוע געשו את הפתרון. מערבבים את המדגם. חזור פעמיים. לאחר חדירה, להתבונן החומר הצמחי ולאשר שהוא הופך להיות מעט שקוף ונוטה לשקוע לתחתית של התחתית (איור 2).
- להוסיף 2.5 מיליליטר של 2 מ 'גליצין כדי להשיג ריכוז סופי של 0.125 מ' החל ואקום במשך 5 דקות. גליצין פועל כמעכב תחרותי של crosslinking פורמלדהיד.
- מחק את פתרון פורמלדהיד-גליצין PBS על ידי צינור היפוך 50 מיליליטר הסגור עם חורים במכסה.
- יש לשטוף את שתילי פעמיים עם PBS 1x ופעם עם מים השלכת פתרון הכביסה כמתואר בשלב 1.5. לייבש אותם על מגבת נייר ולהקפיא בnitroge הנוזליn.
הערה: רקמה קפוא יכולה להישמר ב -80 ° C במשך שבועות.
2. הכנת הנוגדנים (יום 1)
הערה: לimmunoprecipitation, השימוש בחרוזים מגנטיים מצומדות עם נוגדנים באמצעות חלבון G או חלבון מקשר עם זיקה גבוהה לתחום הקבוע של השרשרת הכבדה הנוגדן מומלץ. מתחמי חלבון דנ"א יכולים לצרף unspecifically אל פני השטח של conjugates חרוזים-הנוגדן. מסיבה זו, יש צורך לבצע בקרות ללא נוגדנים ספציפיים לכמת את הרקע שאינו ספציפי מחייב.
- עבור כל immunoprecipitation, להכין 15 μl של חרוזים מגנטיים בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הסכום של חרוזים תלויים בכמות של הכרומטין משמש לimmunoprecipitation וגם על הנוגדנים.
- לשטוף, להוסיף 1 מיליליטר של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) חיץ דילול לחרוזים, מערבב על ידי סיבוב ולמקם את microcentrifuge 1.5 מיליליטר ט"ולהיות במעמד מגנטי. לחכות 1 דקות כדי לתת לחרוזים לצרף המגנט. עם 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge עדיין במעמד, להסיר את supernatant ידי pipetting. חזור פעמיים.
הערה: לקו כל צמח יש צורך בשתי מערכות immunoprecipitation: אחד עם חרוזים ונוגדן (AB) ושני לא נוגדן (לא-Ab) שליטה עם חרוזים מגנטיים בלבד. - Resuspend את החרוזים 200 μl של חיץ דילול שבב. להוסיף את הכמות הנדרשת של Ab הספציפי לאחד משני הצינורות שהוכנו עבור כל קו צמח (הדילול המדויק שונה עבור כל Ab וצריך להיות מותאמים באופן ניסיוני או, במקרה של נוגדנים מסחריים, בצע את ההוראות של היצרן). השתמש בדוגמה זו לimmunoprecipitation. מוסיף את אותה הכמות של IgG נוקבים לצינור האחר, אשר ישמש כביקורת שלילית.
- דגירה O / N על גלגל מסתובב ב 4 ° C כדי לאפשר הנוגדנים לצרף את החרוזים.
3. הכרומטין הפקה (4 שעות)
הערה: בשלב זה, גרעינים וכל האברונים יהיו גלולה. 1 ExB מכיל מספיק סוכרוז לספק צפיפות גבוהה ולמנוע את ההפרעה של מבנה אברון.
הערה: ExB 2 מכיל 1% Triton X-100 כדי לעזור פרצו כלורופלסטים פתוחים ולהסיר כלורופיל.
הערה: פעולה זו מסייעת להסיר את חומר הניקוי מהמדגם.
הערה: זהמאגר מכיל SDS, לlyse הגרעינים ולשחרר את הכרומטין.
זהירות! הקפד ללבוש ציוד הגנת אוזן במהלך שלב sonication במקרה מכשיר אולטרסאונד לא כלול בממשלה אטומה לרעש.
צעד חיוני! פיצול הכרומטין תלוי במידה רבה בציוד sonication. צריכים להיות מותאמים לתנאי sonication להשיג העשרה בגדלי DNA המתאימים. לִרְאוֹתאיור 3 לדוגמא של איך לייעל את פיצול הכרומטין.
הערה: אפשר להקפיא דוגמאות ומאוחסנות ב -20 ° C למשך מספר שבועות.
4. Immunoprecipitation של החלבון של עניין וההצלה של ה- DNA (יום 1, 3 שעות)
- שטוף את החרוזים מצופים Ab מצעד 2.4 שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של חיץ דילול שבב כדי להסיר את העודפים של נוגדן כמתואר בשלב 2.2. גלול ב200 μl של חיץ דילול שבב. הוסף 50 μl של הכרומטין המבודד. דגירה O / N על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: בדוק שהריכוזעל של הכרומטין בUV-Vis microvolume ספקטרופוטומטר. 50 μl של הכרומטין המבודד צריך להכיל יותר מ -10 מיקרוגרם של ה- DNA. - לעבודה 4.2-4.5 שלבים ב 4 מעלות צלזיוס. שטוף את החרוזים פעמיים ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה דל מלח כמתואר בשלב 2.2.
- שטוף את החרוזים פעם ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה מלח הגבוה.
- שטוף את החרוזים פעם ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה LiCl.
- שטוף את החרוזים פעמיים ב 1 מיליליטר של חיץ TE. לאחר השטיפה האחרונה, הקפד להסיר באופן מלא את מאגר TE עזב בצינור על ידי שאיפה עם טפטפת.
- קח את דגימות INPUT (שלב 3.9). העברת 5 μl של הקלט לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש ולהמשיך כעם דגימות השבב. הפוך crosslinking ידי הוספת 200 μl של 5% שרף חילוף יונים chelating, ודגירה של 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס רועדות כל דקות 2-3. ספין למטה ב16,000 XG במשך 30 שניות ולהעביר בזהירות את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש על ידי pipetting.
הערה: בעוד traשיטת ditional לcrosslinking היפוך כרוכה O / דגירה N עם NaCl, הדגירה עם שרף יון chelating על 95 מעלות צלזיוס מאפשרת לdecrosslinking וelution של DNA ב 10 דקות יעילים, ולכן עושה ביום אחד פרוטוקולים קצרים יותר. - הוסף 2 μl של proteinase K (10 מ"ג / מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לעכל חלבונים ולשחרר DNA.
- לעצור את התגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- מהירות ספין ב16,000 XG במשך 30 שניות ולהעביר supernatant לצינור חדש על ידי pipetting.
- נקה את ה- DNA מבודד באמצעות ערכת טיהור שברי DNA סטנדרטית.
הערה: המשך על פי הוראות היצרן. - העבר את העמודה מחייבת DNA מהערכה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש. Elute DNA מטוהר על ידי הוספת 20 μl מים ללא DNase למרכז הטור ומסתובב ב16,000 XG במשך 60 שניות. תפסיק נקודה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -80 ° C למשך מספר שבועות. 5. מדידת שפע של אתרי קישור ב- DNA immunoprecipitated ידי qPCR (4 שעות)
- פריימרים עיצוב לאזורים הגנומי של עניין עם טמפרטורת התכה (TM) של 60 מעלות צלזיוס ותוכן GC של 30% -80%. כהכרומטין הוא מקוטע על ידי sonication, אורכו של רצף מוגבר לא צריך להיות ארוך יותר מ150-200 נוקלאוטידים (טבלת 1).
הערה: כלי שימושי לעיצוב פריימר פריימר היא 3 תכנית (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). הנחיות נוספות לעיצוב פריימר זמינות בדוחות קודמים 8, 14,15. - השתמש בתכנית תפציץ לוודא כי פריימרים ספציפיים (במיוחד יזמים יכולים לשתף TF דומה מחייבים רצפים) ולבדוק את יעילות usin פריימרז דילולים 1:10 במים של ה- DNA הקלט (שלב 4.9). אזורים מסוימים של הגנום יהיו מטוהרים יותר טובים מאחרים. לכן חשוב לתכנן פריימרים PCR ולבדוק אותם על ה- DNA הקלט בדילול מלא.
- לדלל את ה- DNA המטוהר 1:10 עם מים ופיפטה 5 μl של ה- DNA המדולל בצינור PCR לכל תגובה.
הערה: לדלל רק את הסכום הדרוש, כמו ה- DNA יכול לצרף לקירות של 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. מחזורי הקפאה-הפשרה מרובה להגדיל את מספר מולקולות ה- DNA המצורפים. עבור כל זוג פריימר, הגברה בקלט, Ab-השבב ולא-Ab השבב להיות מנותח. - כדי להשלים את תערובת PCR, להוסיף תערובת אמן Sybr גרין PCR לריכוז סופי של 1X, ו 0.5 מיקרומטר של כל צבע יסוד. מלא עד 20 μl עם מים ללא DNase.
- בצע את תגובת qPCR ביצוע ההוראות של יצרן תערובת אמן Sybr גרין PCR.
- ניתוח נתונים בשיטת העשרה פי.
- צור גיליון אלקטרוני עם דגימות שמות וערכי ה- CT גלם שהתקבלו לאחר תגובת qPCR.
- עבור כל דגימה, לגרוע מן ערך ה- CT הגלם שלה ערך ה- CT גלם המתקבל לשליטה המקבילה לא-Ab. הערה: לאחר פעולה מתמטית זה, ערך ה- CT למדגם לא-Ab יהיה שווה 0.
- חישוב העשרה פי ידי פעולת exponentiation עם בסיס 2 ומעריך (כוח) שווה ליתרה השלילית שהושגה בשלב 6.1.2 (טבלה 2).
לקפל העשרה = 2 - (CT (לדוגמא) - CT (לא-Ab))
הערה: בmetho זהד השפע של קטע DNA ספציפי במדגם שבב אד הוא בהשוואה לשפע של בר זה בשליטה לא-Ab. ההנחה של שיטה זו היא שהרמה של אות רקע היא שחזור בין סטים שונים פריימר, דגימות, וניסויים לשכפל. עם זאת, רמות אות'noise' זה לא משתנות בין קבוצות פריימר, דגימות, וניסויים.
- ניתוח נתונים על ידי% משיטת קלט.
- צור גיליון אלקטרוני עם דגימות שמות וערכי ה- CT גלם שהתקבלו עבורם לאחר תגובת qPCR.
- התאם ערכי ה- CT גלם לדגימות קלט על ידי הפחתת ערך של לוגריתם בסיס 2 מהחלק של הכרומטין חילוץ הכולל שנלקח כקלט.
הערה: בפרוטוקול זה הערך המופחת שווה 3.32, כ-10% מהכרומטין הכולל נלקחו כקלט בפרוטוקול זה. התחבר 2 (10) שווים 3.32. - לחשב% מתשומות על ידי הכפלה ב -100 הערך של פעולת exponentiation עם בASE 2 ומעריך (כוח) שווה לשאר ערכי קלט מותאמים מופחתים ערכי ה- CT גלם של המדגם (לוח 3).
% מקלט = 100 * 2 (קלט מותאם - CT (לדוגמא))
הערה: עם הליך זה, את הקשר בין שפע DNA הספציפי במדגם שבב אד לסך הכל הכרומטין המבודד (מדגם הקלט) מחושב. ניתן למצוא פרטים נוספים על ניתוח נתונים שבב בהרינג et al. 8.
יש DNA מבודד מהכרומטין זירז להיות מנותח על מנת לקבוע שה- DNA שברים היה שבב אד מהכרומטין הכולל, בשלה מחייב את החלבון של עניין: הערה.
ניתוח 6. נתונים
הערה: בין לשעברisting דרכים של ניתוח שבב נתונים, שתיים הנפוצים ביותר. הראשון שבם הוא שיטת ההעשרה פי, גם בשם כמו "העשרה היחסית ',' אות על רקע" או "ביחס לשליטה לא-הנוגדן". השיטה השנייה נקראת כמו "% של קלט".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן בחרו לצאת שמונה שלבים עיקריים בפרוטוקול שבב זה לזיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ"א in vivo, כוללים גידול וקציר של חומר צמחי, cross-linking של הכרומטין, בידוד הכרומטין, פיצול הכרומטין, בידוד סלקטיבי של המתחמים בין ה- DNA ו החלבון של עניין על ידי immunoprecipitation, עיכול חלבון, טיהור DNA, וניתוח qPCR (איור 1). צעד מכריע בפרוטוקול השבב הוא הקיבעון של אינטראקציות חלבון דנ"א בתגובת cross-linking. בדרך כלל, cross-linking פורמלדהיד משמש במפעל שבב. פורמלדהיד חודר את הרקמה ויוצר גשרים בין תילן NH 2 קבוצות של חלבונים או חלבונים ונוקלאוטידים ב- DNA 1 6. קיבעון יעיל של מתחמי nucleoprotein in vivo דורש שפורמלדהיד מגיע הכרומטין בתוך גרעיני מפעל, וזה חיוני כי רקמות צמח היא שקועות לחלוטין בtהוא חיץ פורמלדהיד כדי להבטיח כי במהלך immunoprecipitation קומפלקסי החלבונים-DNA הם הורידו בצורה יעילה. העלים ארבידופסיס מכוסים בשכבות שעווה שקשה penetrance סוכן crosslinking לתוך התאים של. בנוסף, trichomes להעדיף את ההיווצרות של בועות אוויר על פני השטח של העלים, מניעת פתרון פורמלדהיד ממקבל פנימי של רקמות הצמח. כדי להתגבר על מגבלה זו, בואקום שלב זה מוחל על הדגימות, מניעת היווצרות של בועות בפתרון הקיבעון ושיפור החדירה של פורמלדהיד לגרעינים של כל התאים. שתילים לאחר טיפול cross-linking יעיל מוצגים באיור 2.
עוד צעד מפתח בפרוטוקול השבב הוא גז הכרומטין. שברי הכרומטין גדולים יכולים לגרום למיפוי ברזולוציה הנמוך של אתרי הקישור של החלבון של עניין ברצף ה- DNA. בניגוד לכך, שברים קטנים מאוד יכולים למנוע הגברה יעילה שלDNA כפות בידי qPCR. על פי ניסיון אמפירי, טווח גודל הכרומטין האופטימלי לניתוח שבב צריך להיות בין 200 ל -600 נ"ב, והתנאים להשגת הפיצול המתאים של הכרומטין צריך להיות מוגדרות בהתאם למכשיר sonication זמין במעבדה. איור 3 ממחישים את הליך כדי לייעל גז הכרומטין כדי להשיג את ההעשרה המרבית בטווח הרצוי של גדלי DNA. לפני sonication, הכרומטין כולל בעיקר שברים גדולים מאוד. מספר גדל של מחזורי sonication בהדרגה מקטין את הגודל הממוצע של ה- DNA בדגימות שבב, שהגיע להעשרה האופטימלית בטווח של 200-600 נ"ב לאחר 20-30 מחזורים (סעיף 3.8 לפרוטוקול ואיור 3).
כאן, זיהוי של חלבון EBS אתרי קישור לאזורי רגולציה של אינטגרטור הפרחוני FT מוצג כדוגמא לתועלת של טכניקת השבב. כריכה של EBS לtלוקוס הוא FT היה פרום באמצעות מבחני שבב עם קווי ארבידופסיס לבטא חלבון היתוך cMyc-EBS תחת השליטה של אמרגן EBS ילידים (pEBS :: cMyc-EBS). זה גרסה מתויגת של EBS היא מתפקד במלואה, כפי שמוצג על ידי הפנוטיפ הסוג בר של EBS צמחים מוטנטים להביע מבנה זה. ארבעה אזורים במוקד FT הגנומי נבדקו עבור EBS מחייב; אחד באזור האמרגן של הגן (FTII), שתי סביב אתר התחלת תעתיק (FTIV, FTVI), ועוד אחד באינטרון הראשון של FT (FTVII) (איור 4 א). כפי שניתן לראות באיור 4, תוצאות השבב להוכיח כי חלבון EBS יכול להיקשר רצף רגולציה קרוב לאתר התחלת תעתיק של גן ההורים של פריחת 12 FT. יתר על כן, חלבון EBS יכול לקיים אינטראקציה הן במבחנה in vivo עם deacetylases היסטון כגון HDA6, חלבון הקשור להכרומטין אחר המעורב בוויסותפריחת זמן בארבידופסיס 1 7. על מנת להעריך את ההשפעה האפשרית של EBS על הרמות של acetylation היסטון באזור הגנומי של FT, מבחני שבב בוצעו באמצעות נוגדן המכוון נגד היסטון H3 acetylated בlysines 9 ו -14, סימן היסטון מתואם עם תעתיק הכרומטין הפעיל 1 2 . יתר על כן, נתונים אלה ממחישים כיצד גישות שבב יכולות לתרום כדי לשפוך אור על המנגנונים המולקולריים המווסתים את הרגולציה תעתיק של תהליכים התפתחותיים צמח.
תכנית איור 1. של הכרומטין immunoprecipitation פרוטוקול. השבב היא טכניקה הנפוצה לחקור אינטראקציות בין החלבונים ו- DNA, שנקבעו על ידי תרכובת כימית. הכרומטין עם אינטראקציות השתמרו מבודד מהגרעינים ומקוטעים. על ידי שימוש בנוגדנים נגד החלבון של עניין,אנחנו יכולים לבחור שברי DNA קשורים אליו. הנוגדן מצומדת לחרוזים מגנטיים המאפשרים בידוד מהיר ופשוט באמצעות מתלה מגנטית. בשלב הבא, חלבונים יוסרו על ידי טיפול proteinase וDNA הוא שוחרר. שברי DNA מטוהרים משמשים לאחר מכן כתבניות בתגובות qPCR למדוד השפע היחסי שלהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. דוגמא של רקמה לאחר cross-linking עם פורמלדהיד. על מנת לחקור אינטראקציות בין דנ"א וחלבון, במתחמי vivo צריך להיות קבוע כדי להפוך אותם יציבים ועמיד לאורך השלבים המרובים של הפרוטוקול. בגרסה זו של הפרוטוקול, קיבעון מתרחש על ידי טיפול פורמלדהיד. חדירה יעילה של thr פורמלדהידough הרקמות היא חיוניות להצלחה של שיטת השבב. (א) לפני צעד cross-linking החומר הצמחי צף על פני השטח של הפתרון, והוא מכוסה בבועות אוויר קטנות; משטחי abaxial וadaxial של העלים שונים בצבע. (ב) לאחר קיבוע, שתילי צריכים להיות טבולים בעליל בפתרון, מעט שקוף, ושקוע באופן שווה בפתרון crosslinking. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אופטימיזציה של תנאי sonication לניתוח שבב. הכרומטין מבודד מחומר קבוע מורכב ממגוון הרחב של ברי אורכים עם להקה חזקה בחלק העליון של ג'ל המייצג גדלים ארוכים מאוד הכרומטין (שורה שנייה משמאל). עם increaלשיר מספר מחזורי sonication, השיא של גדלי שברי הכרומטין הוא הוסט לעבר שברים קטנים יותר. בניסוי שמוצג, מספרי מחזור אופטימליים להשתנות בין 20 ו -30, לאחר שברי הכרומטין אופטימליים החל 200-600 נקודות בסיס הם יותר בשפע במדגם השבב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שבב 4. איור הניתוחים מראה כי EBS נקשר FT וEBS מוטציות לשנות את הרמה של acetylation היסטון H3 בגן אינטגרטור פרחוני זה. () אזור הגנומי של FT עם קופסות שחורות המייצגות אקסונים. ארבעה שברים פורש אזורי רגולציה של גן אינטגרטור פרחוני זה נבדקו (אפורתיבות) על ידי עיצוב פריימרים ספציפיים qPCR. (ב) EBS נקשר אזור FT הרביעי, הממוקם בסמוך לאתר התחלת תעתיק. Myc-EBS המתאים לEBS צמחים מוטנטים המבטא את גרסת cMyc מתויג של EBS; Myc מציין צמחים מהונדסים מבטא cMyc epitope לא התמזגו לכל גן ארבידופסיס. (ג) EBS צמחים מוטנטים להציג שפע גבוה יותר של H3K9,14Ac מסוג בר erecta (אה L) לנדסברג בכל ארבעת אזורי FT העריכו. ברים שגיאה להראות סטיית תקן (B ו- C). שונה מהנתונים שפורסמו בעבר בתא הצמח 1 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| קָדִימָה | לַהֲפוֹך | האזור נבדק |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT השני |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT השישי |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT שביעי |
Primers הטבלה 1. השתמש במחקר זה.
| לִטעוֹם | ערכי הגלם Ct | CT-CT (לא-Ab) | העשרה של פי 2 - (CT (לדוגמא) - CT (לא-Ab)) |
| לא-Ab | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5.3 | 39.4 |
דוגמא 2. טבלה של ניתוח נתונים שבב על ידי ערכי ה- CT "לקפל העשרה" שיטה. לאף Ab דגימות מייצגת את אות הרקע שנגרמה על ידי מחייב נוקבים של DNA לחרוזים המגנטיים Ab /. ערכי ה- CT אלה יעלה על 30. הבדל בין ערכי ה- CT של לא-Ab ומדגם Ab צריך להיות גבוה מ -1.
| שלב 1 - התאם את הקלט | |||
| קלט מותאם = הגלם CT (קלט) - התחבר 2 (חלק של הכרומטין סך הכל) | |||
| הגלם Ct | קלט מהכרומטין הכולל | התחבר 2 10 | |
| קֶלֶט | 29.5 | 10% | 3.32 |
| קלט מותאם = 29.5-3.32 = 26.18 | |||
| שלב 2 -% מחישובי קלט | |||
| לִטעוֹם | הגלם Ct | CT (קלט מותאם) -Ct (לדוגמא) | 2 CT (קלט מותאם) -Ct (לדוגמא) * 100% |
| קֶלֶט | 26.18 | ||
| שבב Ab | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| לא-Ab | 34.5 | -8.32 | 0.31 |
דוגמא 3. שולחן של ניתוח נתונים שבב על ידי שיטה "% של קלט". תשומות מייצגות את הכרומטין צולבים הכולל מבודד מגרעינים, כך ערכי ה- CT צריכים להיות שווים לכל זוגות פריימר. כמקובל, 5% או 10% מהכרומטין הכולל נלקח כקלט. לא-Ab מייצג מדגם שליטה שלילי - חרוזים לא מצופים על ידי נוגדנים ספציפיים נגד החלבון או תג של interesלא. שבב Ab מייצג המדגם לאחר immunoprecipitation עם הנוגדנים נגד החלבון או התג של עניין.
| PBS 10x |
| 1.3 M NaCl |
| 30 מ"מ Na 2 HPO 4 |
| 30 מ"מ לאא 2 PO 4 |
| pH 7 |
| חיץ חילוץ 1 (ExB 1) |
| 0.4 מ 'סוכרוז |
| pH 10 מ"מ טריס-HCl 8 |
| 10 מ"מ MgCl |
| 5 β-mercaptoethanol מ"מ |
| מעכבי פרוטאז |
| חיץ חילוץ 2 (ExB 2) |
| 0.25 מ 'סוכרוז |
| pH 10 מ"מ טריס-HCl 8 |
| 10 מ"מ MgCl 2 |
| 1% Triton X-100 </ Td> |
| 5 β-mercaptoethanol מ"מ |
| מעכבי פרוטאז |
| חיץ חילוץ 3 (ExB 3) |
| 1.7 מ 'סוכרוז |
| pH 10 מ"מ טריס-HCl 8 |
| 0.15% Triton X-100 |
| 2 מ"מ MgCl 2 |
| 5 β-mercaptoethanol מ"מ |
| מעכבי פרוטאז |
| חיץ sonication |
| pH 50 מ"מ טריס-HCl 8 |
| 10 מ"מ EDTA |
| 1% SDS |
| מעכבי פרוטאז |
| מאגר דילול שבב |
| 1.1% Triton X-100 |
| 1.2 mM EDTA |
| pH 16.7 מ"מ טריס-HCl 8 |
| 167 מ"מ NaCl |
| מעכבי פרוטאז |
| חיץ מלח נמוך |
| 150 מ"מ NaCl |
| 0.1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 מ"מ EDTA |
| pH 20 מ"מ טריס-HCl 8 |
| חיץ כביסה מלח גבוה |
| 500 מ"מ NaCl |
| 0.1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 מ"מ EDTA |
| pH 20 מ"מ טריס-HCl 8 |
| חיץ LiCl לשטוף |
| 0.25 מ 'LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% deoxycholate נתרן |
| 1 mM EDTA |
| pH 10 מ"מ טריס-HCl 8 |
| pH 10 מ"מ טריס-HCl 8 |
| 1 mM EDTA |
הרכב מאגר לוח 4..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול השבב המתואר כאן הוא טכניקה לשחזור ורבה עוצמה כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA ספציפיים in vivo בצמחי ארבידופסיס. זיהוי מוצלח של אתרי קישור לחלבונים של עניין מחייב בחירה נאותה של איברי צמח או שלבי התפתחות שבו האינטראקציות הרלוונטיות למעשה מתרחשות. בנוסף, זה קריטי כדי להשיג קיבוע מתאים של החומר הצמחי וגז אופטימלי של הכרומטין ידי sonication. נוגדנים מאוד ספציפיים לimmunoprecipitation יעיל של החלבון / התג שנבחר גם הם חיוניים.
השימוש בגישות שבב בצמחים עומדים בפני כמה קשיים הקשורים לנוכחות של מטבוליטים שניוניים וקירות תא שעלולים להפריע לפעולות שונות בפרוטוקול. יתר על כן, את המורכבות של איברי צמח, לעתים קרובות המכילות סוגים רבים של תאים שבו החלבון קושר DNA של interest יכול להיות דיפרנציאלי הווה או פעיל, מנעו את השימוש במתודולוגיה זו. מסיבה זו, במידת האפשר היא כדאית ביותר להשתמש בשבב מתקרב רקמות הומוגני שבו הנוכחות ו / או הפעילות של החלבון של עניין כבר כבר הוכיחה. חומרי צמח מורכבים המכילים רקמות שונות נוטים לגרום לדילול של סוגי התאים שבו פונקציות החלבון למעשה. רקמת חתך 2 0 כבר בשימוש בצמחים ללימודים ברקמות אדם או סוגי תאים. עם זאת, במהלך השנים האחרונות, נהלים שונים פותחו עבור הבידוד של הכרומטין ספציפי תאים מהסוג בארבידופסיס 8 לטווח של שברים אופטימליים (ראה סעיף נציג תוצאות) 7. כאמור לעיל, התנאים להשגת התפלגות גודל זה מאוד תלוי בציוד אולטרסאונד הספציפי בשימוש. בכל מקרה, הכרומטין צריך להישמר בטמפרטורה נמוכה כדי למנוע היפוך של crosslinking המועדףעל ידי חום שנוצר במהלך sonication. מכשיר sonication של בחירה אמור לספק רמה טובה של שחזור, אשר יחד עם תנאי פיצול אופטימליים, היא חיונית לניתוח שבב (איור 3).
גורם מרכזי נוסף בניסויי שבב מוצלחים הוא הנוגדן שנבחר לimmunoprecipitation של החלבון של עניין. נוגדנים שהועלו נגד גורמי שעתוק צמח יכולים להיות שימושיים עבור ניתוח שבב, אבל סרה אלה צריכים להיבדק ביסודיות כי נוגדנים נבדקו בניסויי כתם מערביים אינם בהכרח תקפים לשבב. בנוסף, נוגדנים שהועלו נגד תגים שונים משמשים לעתים קרובות לפרוטוקול זה. נוגדני כיתה השבב במיוחד הכרת מגוון של תגים זמינים מסחרי, ויש את היתרון שהם נבדקו במספר מעבדות. החסרון לשימוש בנוגדנים המסחריים אלה הוא שהחלבון של עניין יש התמזג epitope המקבילובאתי לידי ביטוי בקווים מהונדסים (איור 4). במקרה זה, רצוי להבטיח כי חלבון chimeric הוא פונקציונלי על ידי יצירת ארבידופסיס קווים מהונדסים הנושאים את חלבון ההיתוך ברקע גנטי לקוי בגן קידוד החלבון של עניין שלנו. ההשלמה של החריגות פנוטיפי של קו המוטציה בצמחים מהונדסים תאשר שחלבון ההיתוך שומרת לעצמה את הפעילות הנורמלית של חלבון אנדוגני. כאשר קווים מהונדסים מיוצרים לזהות אתרי הקישור של רגולטורי תעתיק, עדיף להשתמש אמרגן אנדוגני לנהוג הביטוי של החלבון מתויג, מניעת בעיות הקשורות לשימוש במקדמים חזקים מכוננים (ראה לעיל). נוגדנים ספציפיים לשינויים posttranslational היסטון כגון מתילציה או acetylation של שאריות ספציפיות גם בשימוש תכוף בשבב מנתחים כדי לקבוע את נופי epigenomic של גני המעורבים ברגולציה של מספר התהליכים התפתחותיים, כוללים השליטה על זמן פריחה (איור 4C). באשר לנוגדנים נגד תגים, נוגדנים מסחריים כיתה השבב הם האופציה המועדפת במקרה של סימני היסטון.
גישות ניסיוניות השבב מצמידים את ביטוי גני ניתוחים כבר סייעו בהגדלת הידע שלנו על איך גורמי שעתוק, חלבוני הכרומטין שיפוץ, ושינויים קוולנטיים היסטון לווסת את הביטוי של גני המעורבים בויסות תהליכים ביולוגיים צמח ותגובות. בתחילה פותח כשיטת לנתח את האינטראקציה של חלבונים הנמצאים בהכרומטין עם אזורי לוקוסים או גן מסוימים, הפרץ של משאבים וטכנולוגיה גנומית NGS אפשר שבב להפוך לכלי רב עוצמה ליצירת פרופילי הגנום של חלבוני קושרי דנ"א כזה כגורמי שעתוק או ההיסטונים שונה וגרסאות היסטון. שבב שבב והשבב seq סיפק דימן העולמי חדששיאון לניתוחים של אינטראקציות בין חלבוני הכרומטין וDNA בארבידופסיס 2 5. גישות שבב seq נחשבות החלופה מועדפת לשבב שבב, המבוסס על מערכי הכלאה ומציג הטיה מסוימת, בהתחשב בכך שמערכים אלה מכילים מספר מוגבל של בדיקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
