Summary
Cromatina immunoprecipitazione è una tecnica potente per l'identificazione di DNA siti di Arabidopsis proteine in vivo vincolante. Questa procedura include cromatina reticolazione e frammentazione, immunoprecipitazione con anticorpi selettivi contro la proteina di interesse, e l'analisi qPCR di DNA legato. Descriviamo un semplice saggio di ChIP ottimizzato per piante di Arabidopsis.
Introduction
Negli ultimi anni una vasta gamma di strumenti genetici, molecolari e genomici sono stati sviluppati nella specie modello Arabidopsis thaliana. Questa tecnologia ha facilitato enormemente il progresso nella comprensione di come lo sviluppo della pianta è regolamentata. Tra i processi di sviluppo studiati utilizzando Arabidopsis come modello, il controllo genetico del tempo di fioritura è stata ampiamente analizzata. Questi studi hanno dimostrato che le piante modulano estrema precisione il tempo di fioritura in risposta a stimoli endogeni come ormoni e l'età della pianta, e anche a segnali ambientali come fotoperiodo e temperatura che sincronizzano tempo di fioritura con il ciclo naturale delle stagioni 1, 2. L'isolamento e la caratterizzazione di mutanti di Arabidopsis con alterazioni nel tempo della fioritura è stato determinante nello svelare una complessa rete di geni che regolano il tempo di fioritura in risposta a fattori endogeni ed ambientali. Questi circuiti sono geneticheintegrato a livello di alcuni geni master che agiscono come interruttori di fioritura, e l'esatta tempistica di apertura floreale dipende dall'equilibrio della fioritura e promuovere attività che lavorano a monte dei geni integratore floreali 1,3 reprimere.
La caratterizzazione funzionale dei geni identificati per il loro ruolo nel controllo di iniziazione fioritura, complice il recente uso di approcci genomici, hanno rivelato il ruolo centrale della regolazione trascrizionale nella modulazione del tempo di fioritura. In effetti, molti dei geni maestri codificano fattori di trascrizione fioritura 4. Inoltre, un certo numero di cromatina complessi proteici rimodellamento influenzano l'espressione dei geni maestri di fioritura. Un certo numero di mutanti di Arabidopsis isolati per il loro tempo di fioritura alterato rivelato trasportare mutazioni nei geni che codificano per una varietà di modificatori della cromatina. Diversi rimodellatori cromatina che introducono modificazioni post-a Histone code, riposizionare nucleosomi relativi al DNA o scambiano istoni canoniche da varianti istoni sono necessarie per la corretta regolazione della fioritura in Arabidopsis 5,6. Alcune di queste attività di rimodellamento della cromatina catalizzano la deposizione o la rimozione di modifiche covalenti quali acetilazione o metilazione in specifici residui istoni. Questi segni istoni sono specificamente riconosciuti da effettori specializzate che reclutano altri complessi di rimodellamento della cromatina, fattori di trascrizione o componenti del macchinario trascrizionale per regolare l'attività trascrizionale di geni fioritura.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) permette di individuare in vivo DNA-binding siti per le proteine di interesse (Figura 1). Questa procedura sfrutta la capacità di alcune sostanze chimiche per reticolare le proteine al DNA. I risultanti complessi DNA-proteina possono essere poi immunoprecipitati utilizzando anticorpi specifici agafattori di trascrizione, proteine inst-cromatina legame, o particolari modifiche e epitopi eterologhe (comunemente indicato come "tag") attaccati alla proteina di scelta. Il DNA purificato da queste immunoprecipitati può essere utilizzato come modello in PCR (qPCR) reazioni quantitativa per valutare per l'arricchimento di particolari sequenze di interesse. In questo modo, i siti di legame di fattori di trascrizione o la distribuzione dei voti istone in particolari geni possono essere stabiliti 7,8. Inoltre, in combinazione con Next Generation Sequencing (NGS), che permette il sequenziamento massivo parallelo, tecnologia dei chip ha reso possibile l'identificazione a livello di genoma dei siti di legame di fattori di trascrizione e svelando i paesaggi epigenomiche di modificazioni degli istoni. Inoltre, l'analisi simultanea dell'espressione genica consente il monitoraggio come il legame di regolatori trascrizionali o deposizione di particolari segni istone correlare con trascrizionale activity di geni 9.
L'utilizzo di protocolli chip Arabidopsis ha permesso di valutare l'impatto che una varietà di regolatori trascrizionali hanno sull'organizzazione della cromatina di geni master di fioritura e di come questi cambiamenti strutturali influenzano l'espressione genica 5,6. Risultati precedenti hanno mostrato che la Arabidopsis locus VITE IN ANTICIPO IN GIORNI SHORT (EBS) agisce come repressore della fioritura e mutanti in questo gene mostrano un'accelerazione della fioritura e aumenta del gene maestro di FT fioritura. Inoltre, la perdita di funzione mutazioni in FT sopprimere completamente il fenotipo fioritura precoce delle piante EBS mutanti, indicando che FT è necessaria per la fioritura precoce di mutanti EBS e che EBS è necessaria per la rimozione di questo maestro gene della fioritura 10 , 11. EBS codifica per una proteina che contiene PHD che possono specificatamente legare dell'istone H3 di- e Trimethylated in the lisina 4 residuo (H3K4me2 / 3), suggerendo un ruolo per EBS nella repressione cromatina mediata di FT 12. L'uso del metodo ChIP dimostrato che l'Arabidopsis-PHD contenenti proteine EBS 10,11 lega regioni regolatorie del gene floreale integratore FT per reprimere la sua espressione 12. Ulteriori dati ottenuti tramite l'uso della tecnologia ChIP hanno dimostrato che questa proteina è necessario per mantenere bassi livelli di acetilazione degli istoni, un segno distintivo della trascrizione attiva, nella cromatina di questo maestro gene della fioritura durante le fasi iniziali dello sviluppo Arabidopsis. Queste osservazioni, insieme con i dati di espressione genetica e genica, dimostrare che questo Arabidopsis PHD-contenente proteina ha un ruolo centrale nella messa a punto di tempo di fioritura modulando l'espressione del gene integratore floreale FT 12. Il lavoro qui presentato fornisce un metodo ottimizzato utile non solo per l'analisi degli istoni ma anche per altricromatina proteine associate, e con una maggiore efficienza e riduzione dei tempi di sperimentale. Inoltre, la presente relazione illustra come l'uso di protocolli di chip ha fornito nuove informazioni sul rapporto tra cambiamenti nelle modificazioni della cromatina e stati trascrizionali di geni vegetali, e di come questi meccanismi cromatina mediata di impatto controllo dell'espressione genica sull'insorgenza della fioritura in Arabidopsis.
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Protocol
1. La reticolazione del materiale vegetale (1 ora)
- Crescere le linee di Arabidopsis usati nell'esperimento (wild type - WT - contro i mutanti, e / o le linee che esprimono la versione tag del proteina di interesse contro linee che esprimono il tag non fuse a qualsiasi proteina) per 12-18 giorni in grandi piastre di Petri (150 mm) con terreno MS-agar (1 L: 1x Murashige e Skoog sali, 10 g di saccarosio, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). In alternativa, le piante crescono su vasi contenenti 3: 1 miscela di suolo e vermiculite.
ATTENZIONE! Formaldeide è tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione, e deve essere maneggiato in una cappa chimica di indossare dispositivi di protezione individuale idonei. I passaggi 1,2-1,6 deve essere effettuata sotto la cappa. - Effettuare piccoli fori del coperchio dei 50 ml tubi con un ago bruciatore riscaldata laboratorio. Aggiungere 40 ml di PBS 1x tampone e 1,08 ml di formaldeide ad una concentrazione finale di 1% (magazzino 37% solution). Raccogliere 1,5 g di materiale vegetale in queste provette da 50 ml. Tenere le provette su ghiaccio durante reticolazione.
- Chiudere le provette da 50 ml con il coperchio. Porre i tubi in un essiccatore e applicare il vuoto. Vacuum infiltrare il tessuto per 10 min, quindi rilasciare attentamente il vuoto, per evitare smuovono la soluzione. Mescolare il campione. Ripetere due volte. Dopo infiltrazione, osservare il materiale vegetale e confermare che diventa leggermente traslucido e tendono a depositarsi sul fondo della provetta (figura 2).
- Aggiungere 2,5 ml di 2 M glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 M. Applicare il vuoto per 5 min. Glycine agisce come un inibitore competitivo di formaldeide reticolazione.
- Eliminare la soluzione di formaldeide-glicina PBS invertendo la provetta chiusa 50 ml con fori del coperchio.
- Sciacquare le piantine due volte con PBS 1x e una volta con acqua scartando la soluzione di lavaggio come descritto al punto 1.5. Li asciugare su un tovagliolo di carta e congelare in nitroge liquidon.
NOTA: tessuto congelato può essere conservato a -80 ° C per settimane.
2. Preparazione degli anticorpi (1 giorno)
NOTA: Per immunoprecipitazione, si consiglia l'uso di biglie magnetiche coniugate con anticorpi tramite una proteina G o proteina A linker con alta affinità per il dominio costante della catena pesante dell'anticorpo. I complessi DNA-proteina possono collegare aspecifico alla superficie dei coniugati perline-anticorpo. Per questo motivo, è necessario effettuare controlli senza anticorpi specifici per quantificare il legame di fondo non specifico.
- Per ogni immunoprecipitazione, preparare 15 ml di sfere magnetiche in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. La quantità di perle dipende dalla quantità di cromatina utilizzato per immunoprecipitazione e anche sulle anticorpi.
- Per lavare, aggiungere 1 ml di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) tampone di diluizione ai talloni, mescolare a rotazione e posizionare il microcentrifuga 1,5 ml tuessere in un rack magnetica. Attendere circa 1 minuto per lasciare le perline attribuiscono al magnete. Con i tubi da 1,5 ml microcentrifuga ancora nel rack, rimuovere il surnatante pipettando. Ripetere due volte.
NOTA: Per ogni linea impianto sono necessari due set immunoprecipitazione: uno con le perline e anticorpi (Ab) e un secondo no anticorpo di controllo (n-Ab) con solo sfere magnetiche. - Risospendere le sfere in 200 ml di tampone di diluizione chip. Aggiungere la quantità richiesta della specifica Ab ad una delle due provette preparate per ciascuna linea di piante (diluizione esatto differisce per ciascuna Ab e deve essere ottimizzato sperimentalmente o, in caso di anticorpi commerciali, seguire le istruzioni del produttore). Utilizzare questo esempio per immunoprecipitazione. Aggiungere la stessa quantità di IgG non specifica per l'altro tubo, che sarà utilizzato come controllo negativo.
- Incubare O / N su una ruota girevole a 4 ° C per consentire l'anticorpo allegare ai talloni.
3. cromatina Estrazione (4 ore)
NOTA: In questa fase, i nuclei e di tutti gli organi saranno pellet. ExB 1 contiene abbastanza saccarosio per fornire alta densità e impedire l'interruzione della struttura organello.
NOTA: ExB 2 contiene 1% Triton X-100 per aiutare scoppiare cloroplasti aperto e togliere clorofilla.
NOTA: Questo passaggio consente di rimuovere il detersivo dal campione.
NOTA: Questobuffer contiene SDS, per lisare i nuclei e rilasciare la cromatina.
ATTENZIONE! Assicuratevi di indossare dispositivi di protezione dell'udito durante la fase di sonicazione nel caso in cui il dispositivo ad ultrasuoni non è contenuto in un armadio insonorizzato.
Passo fondamentale! La frammentazione della cromatina dipende in gran parte delle apparecchiature ultrasuoni. Le condizioni sonicazione devono essere regolati per ottenere l'arricchimento nelle dimensioni DNA appropriate. VedereFigura 3 per un esempio di come ottimizzare cromatina frammentazione.
Nota: I campioni possono essere congelati e conservati a -20 ° C per diverse settimane.
4. immunoprecipitazione della proteina di interesse e salvataggio del DNA (1 giorno, 3 ore)
- Lavare le perle rivestite con Ab dal punto 2.4 a tre volte con 1 ml di tampone di diluizione chip per rimuovere l'eccesso di anticorpi come descritto al punto 2.2. Risospendere in 200 ml di tampone di diluizione chip. Aggiungere 50 ml di isolato cromatina. Incubare O / N su una ruota girevole a 4 ° C.
NOTA: Controllare i Concentratisulla della cromatina in microvolumi UV-Vis spettrofotometro. 50 ml di isolato cromatina dovrebbero contenere più di 10 mg di DNA. - Per la procedura di lavoro 4,2-4,5 a 4 ° C. Lavare le perle due volte in 1 ml di sale basso tampone di lavaggio come descritto al punto 2.2.
- Lavare le perline una volta in 1 ml di High Salt tampone di lavaggio.
- Lavare le perline una volta in 1 ml di LiCl tampone di lavaggio.
- Lavare le perle due volte in 1 ml di tampone TE. Dopo l'ultimo lavaggio, assicurarsi di rimuovere completamente il buffer TE sinistra nel tubo per aspirazione con una pipetta.
- Togliere i campioni di ingresso (passo 3,9). Transfer 5 ml di INPUT in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e proseguire con i campioni di chip. Reverse reticolazione aggiungendo 200 ml di 5% resina a scambio ionico chelante, e incubare per 10 min a 95 ° C agitando ogni 2-3 min. Spin down a 16.000 xg per 30 secondi e trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta pipettando.
NOTA: Durante TRAMetodo dizionale per reticolazione inversione comporta un / N incubazione O con NaCl, l'incubazione con una resina chelante ione a 95 ° C consente decrosslinking e eluizione del DNA in 10 min efficiente, rendendo il protocollo uno giorno più corto. - Aggiungere 2 ml di proteinasi K (10 mg / ml) e incubare a 37 ° C per 30 minuti per digerire le proteine e rilasciare DNA.
- Arrestare la reazione mediante incubazione a 95 ° C per 10 min.
- Girare subito a 16.000 xg per 30 secondi e trasferire il surnatante in una nuova provetta pipettando.
- Pulire il DNA isolato utilizzando un kit di purificazione frammenti di DNA standard.
NOTA: Procedere in base alle istruzioni del produttore. - Trasferire la colonna di legame al DNA dal kit in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Eluire il DNA purificato aggiungendo 20 ml di acqua priva di DNasi al centro della colonna e centrifugazione a 16.000 xg per 60 sec. Punto di arresto: I campioni possono essere conservati a -80 ° C per diverse settimane. 5. Abbondanza di siti di legame nel DNA immunoprecipitato di qPCR di misura (4 ore)
- Primers progettazione per le regioni genomiche di interesse con una temperatura di fusione (Tm) di 60 ° C e un contenuto di GC del 30% -80%. Come cromatina è frammentata mediante sonicazione, la lunghezza della sequenza amplificata non deve essere superiore a 150-200 nucleotidi (Tabella 1).
NOTA: uno strumento utile per la progettazione primer è Primer 3 Programma (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Ulteriori linee guida per la progettazione di fondo sono disponibili in precedenti relazioni 8, 14,15. - Utilizzare un programma BLAST per assicurarsi che i primer sono specifici (in particolare i promotori possono condividere sequenze vincolante TF simile) e testare l'efficienza usin fondog 1:10 diluizioni in acqua del DNA di ingresso (passo 4.9). Alcune regioni del genoma saranno purificate meglio di altri. È quindi importante progettare primer PCR e controllare il DNA di ingresso diluito.
- Diluire il DNA purificato 1:10 con acqua e pipettare 5 ml di DNA diluito in un tubo di PCR per ciascuna reazione.
NOTA: diluire solo la quantità necessaria, come il DNA può attaccare alle pareti delle provette da microcentrifuga 1,5 ml. Molteplici cicli-disgelo congelamento aumentare il numero di molecole di DNA allegate. Per ogni coppia di primer, l'amplificazione in ingresso, Ab-chip e No-Ab chip ha da analizzare. - Per completare la miscela PCR, aggiungere SYBR Green PCR master mix ad una concentrazione finale di 1x, e 0,5 mM di ciascun primer. Riempire fino a 20 ml con acqua priva di DNasi.
- Eseguire la reazione qPCR seguendo le istruzioni del produttore master mix Sybr Verde PCR.
- Analisi dei dati con il metodo di arricchimento volte.
- Creare un foglio di calcolo con campioni nomi ei valori Ct grezzi che sono stati ottenuti dopo la reazione qPCR.
- Per ogni campione, sottrarre dal suo valore Ct grezzo il valore grezzo Ct ottenuto per il relativo controllo della No-Ab. NOTA: Dopo questa operazione matematica, valore Ct per il campione No-Ab sarà uguale a 0.
- Calcolare arricchimento piega dall'operazione elevamento con base 2 e esponente (potenza) corrisponde al periodo residuo negativo ottenuto nel passaggio 6.1.2 (Tabella 2).
piegare arricchimento = 2 - (Ct (campione) - Ct (No-Ab))
NOTA: In questo metod l'abbondanza di un frammento di DNA specifico del campione ChIP-ed è confrontato con l'abbondanza di questo frammento in controllo No-Ab. L'assunzione di questo metodo è che il livello di segnale di fondo è riproducibile tra diversi set di primer, esempi e replicare esperimenti. Tuttavia, questo'noise' livelli di segnale variano tra i set di primer, campioni, ed esperimenti.
- L'analisi dei dati da% di metodo di input.
- Creare un foglio di calcolo con campioni nomi e valori grezzi Ct che sono stati ottenuti per loro, dopo la reazione qPCR.
- Regolare valori grezzi Ct per campioni di ingresso sottraendo un valore di logaritmo in base 2 dalla frazione di estratto totale cromatina che è stata presa come input.
NOTA: In questo protocollo il valore sottratto uguale a 3,32, come il 10% della cromatina totale è stato preso come un ingresso in questo protocollo. Log 2 (10) è uguale a 3.32. - Calcola% dell'input moltiplicando per 100 il valore di funzionamento elevamento con base 2 e esponente (potenza) pari al restante valori di ingresso impostati sottratti valori grezzi Ct del campione (Tabella 3).
% Di input = 100 * 2 (ingresso regolato - Ct (campione))
NOTA: Con questa procedura, la relazione tra la specifica abbondanza di DNA del campione ChIP-ed al isolata cromatina (campione di ingresso) totale viene calcolato. Ulteriori dettagli sulla analisi dei dati chip può essere trovato in Haring et al. 8.
NOTA: DNA isolato da cromatina precipitato deve essere analizzato per determinare quale DNA frammenti sono stati ChIP-ed dalla cromatina totale, grazie al suo legame con la proteina di interesse.
Analisi 6. Dati
NOTA: Tra gli existing modi di analizzare ChIP-dati, due sono più comunemente utilizzati. Il primo di questi è metodo di arricchimento piega, anche chiamata come 'arricchimento relativa', 'segnale su sfondo' o 'rispetto al controllo non-anticorpo'. Il secondo metodo è chiamato come "% di input".
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Representative Results
Otto passi principali possono essere individuati in questo protocollo ChIP per identificare in vivo interazioni proteina-DNA, tra cui coltura del materiale vegetale, reticolazione di cromatina, isolamento cromatina, cromatina frammentazione, isolamento selettivo dei complessi tra DNA e la proteina di interesse mediante immunoprecipitazione, la digestione delle proteine, la purificazione del DNA, e qPCR analisi (Figura 1). Un passo cruciale nel protocollo chip è la fissazione delle interazioni DNA-proteina in una reazione di cross-linking. Tipicamente, formaldeide reticolazione viene utilizzata negli impianti chip. Formaldeide penetra il tessuto e crea ponti metilenici fra NH 2 gruppi di proteine o proteine e nucleotidi nel DNA 1 6. Un fissaggio efficace di complessi nucleoproteina in vivo richiede che la formaldeide raggiunge la cromatina all'interno nuclei vegetali, ed è essenziale che il tessuto impianto è completamente sommerso in tegli tampone formaldeide per garantire che durante immunoprecipitazione i complessi proteina-DNA sono effettivamente abbattute. Foglie di Arabidopsis sono coperti in strati di cera così difficile la penetranza dell'agente reticolante nelle cellule. Inoltre, tricomi favoriscono la formazione di bolle d'aria sulla superficie delle foglie, impedendo la soluzione di formaldeide penetrino all'interno del tessuto vegetale. Per superare questa limitazione, in questo passo vuoto viene applicato ai campioni, evitando la formazione di bolle nella soluzione di fissaggio e di migliorare la penetrazione di formaldeide nei nuclei di tutte le cellule. Piantine dopo il trattamento di reticolazione efficiente sono mostrati nella Figura 2.
Un altro passo fondamentale nel protocollo ChIP è cromatina tosatura. Grandi frammenti cromatina possono portare ad una risoluzione bassa mappatura dei siti di legame della proteina di interesse nella sequenza di DNA. Al contrario, molto piccoli frammenti possono impedire l'amplificazione efficienteil DNA legato da qPCR. Secondo l'esperienza empirica, la gamma di dimensioni cromatina ottimale per l'analisi ChIP deve essere compresa tra 200 e 600 bp, e le condizioni per ottenere la frammentazione appropriata della cromatina devono essere impostati a seconda del dispositivo sonicazione disponibili in laboratorio. Figura 3 illustra il Procedura per ottimizzare cromatina taglio per ottenere l'arricchimento massima nell'intervallo desiderato di dimensioni DNA. Prima sonicazione, la cromatina consiste principalmente di grandi frammenti. Un aumento del numero di cicli di sonicazione riduce progressivamente la dimensione media del DNA in campioni di chip, raggiungendo l'arricchimento ottimale nell'intervallo 200-600 bp dopo 20-30 cicli (sezione 3.8 del protocollo e Figura 3).
Qui, l'identificazione dei siti da regioni regolatorie dell'integratore floreale FT legame alle proteine EBS è mostrato come un esempio dell'utilità della tecnica ChIP. Il legame di EBS a tegli FT locus è stato svelato attraverso saggi di chip con linee di Arabidopsis che esprimono una proteina di fusione cMyc-EBS sotto il controllo del promotore EBS nativo (PEBS :: cMyc-EBS). Questa versione tagged di EBS è perfettamente funzionante, come dimostrato dal fenotipo selvatico di EBS piante mutanti che esprimono questo costrutto. Quattro regioni all'interno del locus genomico FT sono stati testati per EBS vincolante; uno nella regione del promotore del gene (FTII), due intorno al sito di inizio della trascrizione (FTIV, FTVI), e un altro nel primo introne del FT (FTVII) (Figura 4A). Come mostrato in Figura 4B, risultati ChIP dimostrano che la proteina EBS può associare una sequenza regolatrice vicino al sito di inizio della trascrizione del gene maestro della fioritura FT 12. Inoltre, la proteina EBS può interagire sia in vitro che in vivo con istone deacetilasi quali hda6, un'altra proteina cromatina correlata coinvolta nella regolazionedi tempo fioritura in Arabidopsis 1 7. Al fine di valutare la possibile influenza di EBS sui livelli di acetilazione degli istoni nella regione genomica di FT, saggi ChIP sono stati eseguiti utilizzando un anticorpo diretto contro l'istone H3 acetilato in lisine 9 e 14, un marchio istone correlato con trascrizionalmente cromatina attiva 1 2 . Inoltre, questi dati illustrano come approcci chip può contribuire a far luce sui meccanismi molecolari che modulano la regolazione trascrizionale dei processi di sviluppo della pianta.
Figura 1. Schema della cromatina immunoprecipitazione protocollo. Chip è una tecnica comunemente usata per studiare le interazioni tra proteine e DNA, fissati da un composto chimico. La cromatina con interazioni conservati è isolata dai nuclei e frammentato. Utilizzando anticorpi contro la proteina di interesse,possiamo selezionare frammenti di DNA ad esso collegato. L'anticorpo è coniugato a sfere magnetiche che permettono l'isolamento rapido e semplice utilizzando un sostegno magnetico. Nella fase successiva, le proteine vengono rimossi mediante trattamento proteinasi e DNA viene rilasciato. Frammenti di DNA purificato vengono poi utilizzati come modelli nelle reazioni qPCR per misurare la loro relativa abbondanza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esempio di un tessuto dopo reticolazione con formaldeide. Per studiare le interazioni tra DNA e proteine, in complessi vivo devono essere fissati per renderli stabile e durevole attraverso le molteplici fasi del protocollo. In questa versione del protocollo, fissaggio avviene tramite trattamento con formaldeide. La penetrazione efficace di formaldeide through il tessuto è cruciale per il successo del metodo chip. (A) prima della fase di reticolazione del materiale vegetale galleggia sulla superficie della soluzione ed è ricoperta da piccole bolle d'aria; le superfici abaxial e adaxial delle foglie differiscono nel colore. (B) Dopo la fissazione, piantine deve essere visibilmente imbevuto nella soluzione, leggermente trasparente, e in modo uniforme immerso nella soluzione di reticolazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Ottimizzazione delle condizioni sonicazione per l'analisi ChIP. Cromatina isolata dal materiale fisso costituito da un'ampia gamma di lunghezze frammenti con una forte banda alla superficie del gel che rappresenta le dimensioni cromatina estremamente lunghi (seconda riga a sinistra). Con Increacantare numero di cicli di sonicazione, il picco della cromatina frammenti formati si sposta verso frammenti più piccoli. Nell'esperimento mostrato, numero di cicli ottimali variano tra 20 e 30, dopo di che i frammenti di cromatina ottimali che vanno 200-600 bp sono più abbondanti nel campione ChIP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. ChIP le analisi mostrano che EBS lega FT ed EBS mutazioni alterano il livello di acetilazione dell'istone H3 in questo gene integratore floreale. (A) regione genomica del FT con scatole nere che rappresentano esoni. Quattro frammenti spanning regioni regolatorie di questo gene integratore floreale sono stati testati (grigioscatole) per la progettazione di specifici primer qPCR. (B) EBS si lega la regione FT IV, situato vicino al sito di inizio della trascrizione. Myc-EBS corrisponde a EBS piante mutanti che esprimono la versione cMyc-tag di EBS; Myc denota piante transgeniche esprimenti la cMyc non epitopo fuse a qualsiasi gene Arabidopsis. (C) EBS piante mutanti mostrano maggiore abbondanza di H3K9,14Ac di tipo selvaggio Landsberg erecta (L er) in tutte e quattro le regioni FT valutati. Le barre di errore indicano la deviazione standard (B e C). Modificato da dati precedentemente pubblicati in The Plant Cell 1 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Inoltrare | Inverso | 100px"> Regione testato |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabella 1. Primer utilizzati in questo studio.
| Campione | Valori grezzi Ct | Ct-Ct (No-Ab) | Arricchimento Fold 2 - (Ct (campione) - Ct (No-Ab)) |
| No-Ab | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5.3 | 39.4 |
Tabella 2. Esempio di analisi dei dati chip "Fold arricchimento" metodo. I valori Ct per No-Ab campioni rappresentano il segnale di fondo causato dal legame aspecifico del DNA per le sfere magnetiche Ab /. Questi valori Ct dovrebbero superare 30. Differenza tra valori Ct di No-Ab e campione Ab dovrebbe essere superiore a 1.
| Fase 1 - Regolare l'ingresso | |||
| Ingresso rettificato = Raw Ct (ingresso) - Log 2 (frazione di cromatina totale) | |||
| Raw Ct | Ingresso da cromatina totale | Log 2 10 | |
| Ingresso | 29.5 | 10% | 3.32 |
| Ingresso rettificato = 29,5-3,32 = 26.18 | |||
| Fase 2 -% di calcoli di input | |||
| Campione | Raw Ct | Ct (ingresso rettificato) -Ct (campione) | 2 Ct (ingresso rettificato) -Ct (campione) * 100% |
| Ingresso | 26.18 | ||
| ChIP-Ab | 31.45 | -5,27 | 2.59 |
| No-Ab | 34.5 | -8,32 | 0.31 |
Tabella 3. Esempio di analisi dei dati chip "% di input" metodo. Ingressi rappresentano il totale cromatina reticolato isolato da nuclei, quindi i valori Ct deve essere uguale per tutte le coppie di primer. Convenzionalmente, 5% o 10% del totale cromatina è presa come input. No-Ab rappresenta un campione di controllo negativo - le perline non ricoperto da anticorpi specifici contro la proteina o tag di interest. ChIP-Ab significa campione dopo l'immunoprecipitazione con anticorpi contro la proteina o tag di interesse.
| PBS 10x |
| 1.3 M di NaCl |
| 30 mM Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Tampone di estrazione 1 (ExB 1) |
| 0.4 M saccarosio |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| MgCl 10 mM |
| 5 β-mercaptoethanol mM |
| Inibitori della proteasi |
| Tampone di estrazione 2 (ExB 2) |
| 0,25 M di saccarosio |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl 2 |
| 1% Triton X-100 </ td> |
| 5 β-mercaptoethanol mM |
| Inibitori della proteasi |
| Tampone di estrazione 3 (ExB 3) |
| 1.7 M saccarosio |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 0,15% Triton X-100 |
| 2 mM MgCl 2 |
| 5 β-mercaptoethanol mM |
| Inibitori della proteasi |
| Buffer Sonicazione |
| 50 mM Tris-HCl pH 8 |
| EDTA 10 mM |
| 1% SDS |
| Inibitori della proteasi |
| Tampone di diluizione ChIP |
| 1,1% Triton X-100 |
| 1.2 mM EDTA |
| 16.7 mM Tris-HCl pH 8 |
| 167 mM NaCl |
| Inibitori della proteasi |
| Buffer di basso contenuto di sale |
| 150 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| Alta tampone di lavaggio Salt |
| NaCl 500 mm |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| Buffer LiCl Wash |
| 0.25 M LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% sodio desossicolato |
| 1 mM EDTA |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 1 mM EDTA |
Tabella 4. Composizione Buffer.
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Discussion
Il protocollo ChIP qui descritto è una tecnica riproducibile e potente per analizzare le interazioni tra proteine e specifiche sequenze di DNA in vivo in piante di Arabidopsis. Una individuazione di siti di legame per le proteine di interesse richiede un'adeguata selezione di organi vegetali o stadi di sviluppo in cui le interazioni rilevanti sono effettivamente avvenendo. Inoltre, è fondamentale per ottenere un fissaggio adeguato del materiale vegetale e un taglio ottimale della cromatina mediante sonicazione. Anticorpi altamente specifici per la immunoprecipitazione efficiente della proteina / tag selezionato sono inoltre essenziali.
L'uso di approcci chip piante affronta alcune difficoltà legate alla presenza di metaboliti secondari e pareti cellulari che possono potenzialmente interferire con varie fasi del protocollo. Inoltre, la complessità di organi vegetali, spesso contenenti più tipi di cellule in cui la proteina di legame al DNA di interest può essere differenzialmente presente o attiva, hanno impedito l'uso di questa metodologia. Per questo motivo, quando possibile è più vantaggioso utilizzare in ChIP approcci tessuti omogenei dove la presenza e / o l'attività della proteina di interesse sono stati già dimostrati. Materiali vegetali complessi contenenti diversi tessuti tendono a provocare una diluizione dei tipi cellulari in cui le funzioni della proteina effettivamente. Tissue sezionamento 2 0 sono stati utilizzati in impianti per studi in singoli tessuti o tipi cellulari. Tuttavia, negli ultimi anni, sono state sviluppate diverse procedure per l'isolamento di tipo cellulare cromatina specifico in Arabidopsis 8 ad una serie di frammenti ottimali (vedi sezione risultati rappresentativi) 7. Come discusso in precedenza, le condizioni per raggiungere questo obiettivo la distribuzione delle dimensioni notevolmente dipendono dalla apparecchiature ad ultrasuoni specifico utilizzato. In ogni caso, cromatina deve essere tenuto a bassa temperatura per impedire l'inversione della reticolazione favoritadal calore generato durante sonicazione. Il dispositivo sonicazione di scelta dovrebbe fornire un buon livello di riproducibilità, che insieme con condizioni ottimali di frammentazione, è essenziale per l'analisi ChIP (Figura 3).
Un altro fattore chiave in esperimenti ChIP successo è l'anticorpo per immunoprecipitazione della scelta della proteina di interesse. Anticorpi sollevate contro i fattori di trascrizione impianto possono essere utili per l'analisi ChIP, ma questi sieri devono essere accuratamente testato perché gli anticorpi controllato in esperimenti Western Blot non sono necessariamente valide per il chip. Inoltre, gli anticorpi sollevate contro diversi tag sono frequentemente utilizzate per questo protocollo. Anticorpi ChIP-grade specificamente riconoscendo vari tag sono disponibili in commercio, e hanno il vantaggio che essi sono stati testati in diversi laboratori. Lo svantaggio per l'uso di questi anticorpi commerciali è che la proteina di interesse deve essere fusa al corrispondente epitopoed espressa in linee transgeniche (Figura 4B). In questo caso, è opportuno garantire che la proteina chimerica è funzionale generando Arabidopsis transgeniche portanti linee proteina di fusione in un background genetico carente nel gene codificante la nostra proteina di interesse. La complementazione delle anomalie fenotipiche della linea mutante nelle piante transgeniche confermerà che la proteina di fusione mantiene la normale attività della proteina endogena. Quando linee transgeniche sono prodotte per identificare i siti di legame di regolatori trascrizionali, è preferibile utilizzare il promotore endogeno per guidare l'espressione della proteina marcata, impedendo i problemi connessi con l'utilizzo di promotori costitutivi forti (vedi sopra). Anticorpi specifici per istoni modificazioni post-come la metilazione e l'acetilazione di residui specifici sono anche frequentemente utilizzate per ChIP analisi per determinare i paesaggi epigenomiche di geni coinvolti nelregolazione di un numero di processi di sviluppo, compreso il controllo del tempo di fioritura (Figura 4C). Per quanto riguarda gli anticorpi contro tag, anticorpi commerciali ChIP grado sono l'opzione preferita nel caso di marchi istoni.
Approcci sperimentali ChIP accoppiati a genica analisi sono state fondamentali per aumentare la nostra conoscenza su come fattori di trascrizione, proteine rimodellamento della cromatina, e modifiche istone covalenti modulano l'espressione di geni coinvolti nella regolazione di processi biologici di piante e le risposte. Inizialmente sviluppato come un metodo per analizzare l'interazione delle proteine presenti nella cromatina con particolari regioni loci o geni, lo scoppio delle risorse genomiche e tecnologia NGS ha permesso di chip per diventare un potente strumento per la profilazione genoma a livello di DNA-binding proteine tali come fattori di trascrizione o istoni modificati e varianti istoni. ChIP-chip e ChIP-Seq hanno fornito una nuova dimensione globalesione alle analisi di interazioni tra le proteine della cromatina e DNA in Arabidopsis 2 5. Approcci ChIP-seq sono considerati l'alternativa di scelta per ChIP-chip, che è basato su array ibridazione e introduce alcuni pregiudizi, dato che queste matrici contengono un numero limitato di sonde.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
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