Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
आउटडोर एयरोसोल अनुसंधान आमतौर पर बात कण फिल्टर पर जांचा उपयोग करता है। इस प्रक्रिया में सक्षम बनाता एकत्र कणों के विभिन्न अभिलक्षण समानांतर में प्रदर्शन किया जाएगा। यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य जैव एयरोसौल्ज़ फिल्टर से निकाले के endotoxin और डीएनए सामग्री की एक बेहद सटीक और विश्वसनीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए है। ऐसे lipopolysaccharides के रूप में उच्च आणविक भार कार्बनिक अणुओं, नमूना फिल्टर से, की निकासी एक pyrogen मुक्त पानी आधारित माध्यम में नमूना मिलाते शामिल है। बाद के विश्लेषण के एक enzymatic प्रतिक्रिया है कि एक turbidimetric माप का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है पर आधारित है। नमूना फिल्टर पर उच्च कार्बनिक सामग्री का एक परिणाम के रूप में, नमूनों से डीएनए की निकासी के लिए एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट है कि मूल रूप से मिट्टी के लिए बनाया गया है और डीएनए उपज में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया था का उपयोग किया जाता है। का पता लगाने और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन reacti का उपयोग कर विशिष्ट माइक्रोबियल प्रजातियों की मात्रा का ठहरावपर क्यू (पीसीआर) विश्लेषण वर्णित और अन्य उपलब्ध तरीकों के साथ तुलना कर रहे हैं।
फिल्टर पर एयर नमूना वायुमंडलीय एयरोसौल्ज़ अनुसंधान के क्षेत्र में एक बुनियादी उपकरण है। 1 नमूना फिल्टर विभिन्न रासायनिक, भौतिक और जैविक एकत्र परिवेश के कणों की अभिलक्षण के लिए प्रारंभिक बिंदु है। 2-11 इस दृष्टिकोण का लाभ विभिन्न विश्लेषण किया जा सकता है एक ही नमूना पर बंद लाइन प्रदर्शन किया। शोधकर्ता सक्षम बनाता है सभी अलग विश्लेषण से डेटा संकलन वायुमंडलीय विज्ञान में जटिल सवालों को हल करने में एकत्र कणों और एड्स की विशेषताओं में से एक अच्छी समझ प्राप्त करने के लिए। 12,13 उदाहरण के लिए, समुद्री और अंतर्देशीय एयर नमूने ही के दौरान लिया अवधि जांचा कण विषाक्तता और जैविक संरचना। इस अध्ययन के लिए 14 के लिए सम्मान के साथ तुलना की जा सकती है, lipopolysaccharides (एलपीएस), ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया कोशिका-दीवारों, भी रूप में जाना जाता endotoxins पर घटकों, पर किनारे पर जांचा और फिल्टर से निकाले गए थे एक अंतर्देशीय साइट है, और का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया थाLimulus amebocyte lysate (लाल) की परीक्षा। समानांतर में, बैक्टीरियल सामग्री की एक जीनोमिक मूल्यांकन (कुल बैक्टीरिया, नकारात्मक चना, और cyanobacteria) मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर क्यू) का उपयोग कर एक ही नमूना पर प्रदर्शन किया गया था। LAL परीक्षा में गंदगी की माप, घोड़े की नाल केकड़े, Limulus Polyphemus से amebocytes का एक जलीय निकालने के अलावा के बाद का गठन endotoxins युक्त एक जलीय समाधान के लिए पर आधारित है। उच्च नमूने में endotoxin एकाग्रता, तेजी से मैलापन विकसित करता है। 15 क्यू पीसीआर विश्लेषण एक प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में एक विशिष्ट डीएनए टुकड़ा परिलक्षित होता है उत्सर्जित पर आधारित है। 16 संकेत के वास्तविक समय की निगरानी के द्वारा पीसीआर का तेजी के चरण के दौरान प्रतिक्रिया और एक मानक की अवस्था के साथ औजार, प्रारंभिक डीएनए राशि मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इन दोनों का संयोजन अन्य लोगों के साथ एक साथ विश्लेषण करती है, के रूप में कहीं और विस्तृत, 14 और endotoxin के स्तर का एक अच्छा अनुमान प्रदान कर सकते हैंनमूने में बैक्टीरिया के स्रोत की राशि।
यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य जैव एयरोसौल्ज़ फिल्टर से निकाले के endotoxin और डीएनए सामग्री की एक बेहद सटीक और विश्वसनीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए है। जबकि एयरोसौल्ज़ के शारीरिक और अकार्बनिक रसायन विशेषताओं नमूना लेने के लिए तरीकों अच्छी तरह से जाना जाता है और हाल ही में, अपने तरीकों कार्बनिक पदार्थ घटक जांच करने के लिए विकसित किया गया है, वहाँ 17 एयरोसौल्ज़ के जैविक घटक पर अल्प अनुसंधान किया गया है। वर्तमान में 18 के लिए तर्क विधि विस्तार से निकालने का विश्लेषण, और हवाई एयरोसौल्ज़ के जैविक अंश की पहचान करने के लिए एक मजबूत विधि पेश करके इस अंतर को संबोधित करने के लिए है। 14
विधि यहाँ विस्तृत 20-24 जैविक इनडोर और आउटडोर एयरोसोल अनुसंधान फिल्टर विश्लेषण से संबंधित परियोजनाओं में व्यापक प्रसार उपयोग मिल जाने की उम्मीद है।
इस काम फिल्टर पर एकत्र एयरोसोल नमूनों में दोनों endotoxins और डीएनए वर्तमान बढ़ाता के लिए निष्कर्षण और तरीकों का पता लगाने का वर्णन है। तरीकों सटीक दिनचर्या की आवश्यकता होती है और जब तक experimentalist यहाँ पर चर्चा क?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Filter sampling | |||
HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
Aluminum foil | Opal | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Endotoxin | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DNA | |||
DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |