调优并行分段流动列和启用多重检测

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

主动流技术专栏

主动流技术（AFT）层析柱最近开发来克服低效率与流量异质^1-6相关联的分离并且还使多重检测。在这个特殊的沟通我们详细介绍了并行的操作过程分段流程（PSF）柱多重检测。 PSF中列的关键的功能的优点是：（1）从柱床的径向中心区域的流动被从流动的周边或壁区域分离，（2）流动相必须由一个检测要处理的体积源被还原，和（3）检测源可以复用，以未经灌输检测延迟在每个检测处理，或随后迫使一个柱后流动流^7,8的分束扩大样品信息。 PSF中柱设计中的关键功能，使一个多重检测的dvantage是小说出口配件和玻璃料组件，图1是在船尾柱的照片比现有柱。重要的是要明白，分裂过​​程使用并行分段流动列是不一样的柱后流流拆分获得是重要的。在后柱流动流分割整个样本频带从前缘到尾的均等取样的四肢（即，轴向地），从而，每一个流动流等于相对于效率和灵敏度;灵敏度的幅度由此被除以分割数。在PSF，然而，分割处理的样品带径向，轴向未。因此，中央口采样峰顶 – 高峰最集中的地区。因此，这里的灵敏度最高的峰不被漫拖尾区域稀释。将样品从外围端口洗脱是效率不如在CENTRA升区，但是，因为带被径向采样，而不是沿轴向，所述峰的宽度窄于将一个采样过程，其将上述峰在轴向上，也就是 ，一柱后分裂的情况。因此与浓度相关的检测器的灵敏度不会降低。

在PSF列，出口配件包括多个出口端口，并在此端部接头内部有坐落在一个环形的玻璃料。的该环形熔料通道的内部流出通过所述径向中心出口端口之列，而出口料通道的外径向部分经由外围或壁区域出口流动口流出的列。出口玻璃料的内，外部分由不可渗透的阻挡层，防止这些流^区 2之间横向流动分离。作为该设计的结果通过该柱床的中央径向流动物流从壁面区域流动插件分开IDE列。流来自这两个区域的相对部分可通过压力管理，以便优化所述柱技术的各种功能方面，例如分离效率或检测灵敏度变化以几乎任何期望的比例。从本质上说，这种设计有效地较大的格式列一个“虚拟”的列内建立，具有较窄内径，因此，列函数作为一个真正的无壁塔，克服柱床异质和壁效应^9,10。

PSF列的主要好处是提高柱效，尽量减少溶剂处理的检测源（S），使多路检测。然而，一个额外的优点是，由于任何带的拖尾和面向地区被从整体洗脱除去轮廓溶质在洗脱或检测存在于更高浓度比原本为相同的S观察到的olute注射和浓度负载在常规柱，根据所使用的分割比。其结果往往存在观察到的信号强度的增益对PSF列²进行分离。事实上，如果分割比率进行调整，使得从每四个出口的流出口的25％，即使用紫外线（UV）检测中观察到的信号强度几乎示出使用常规的完全相同的信号强度作为表观其中移动相的整个（100％），分析^7列 。此外，中央和壁流区域之间的出口比微调允许优化该列的效率。 （1）的流量，（2）的分割比率，以及（3）溶质保留因子：在柱效增益使用AFT列不能被说成一个单一的值，因为这些效率增益是三个因素的函数观察。然而，提高效率相比，CONVentional列几乎总是观察到，有时这些收益是在理论塔板^1,2的数量超过了100％。的能力来调整分割比允许分析者有效地定制“虚拟”塔的直径，这是相对于检测处理的一个重要因素。例如，一个虚拟2.1毫米内径（ID）列是从一个物理4.6毫米内径柱成立时的分割比是流动相从径向中央出口洗脱的21％。在这些条件下，虚拟2.1毫米内径柱执行与效率可能比以往的2.1毫米内径柱大于70％以上，这取决于流速，和溶质保留因子^10。

一个用于多路检测的当前的PSF柱设计集成了一个4端口出口配件，但该列可以配备2端口端配合也，然而，这限制了检测吨Ø只有两个探测器。这些列的基本操作是，然而，同样的，所不同的是四个探测器可以同时耦合到4端口出口的PSF列范围扩大为多重检测。除了前和后柱连接管，唯一的附加的要求进行操作PSF中列管可连接到外围出口端口，并通过该通过各管流动相的量可​​以被测量的装置，通常是一个质量测量或体积测量。为了便于调谐，所有出口流管的内径应该是相同的。圆周和径向中央出口端口之间的流量比，然后通过使用压力管理的变化，简单地通过改变位于所述外围出口配件，或管道交检测器上的径向中央出口孔的长度的管道的长度。

多重检测应用PSF列 </stroNG>

PSF列的一个重要优点是，每一个的出口退出端口可直接连接到检测源，从而使多路检测。在设计良好的检测系统具有多路检测的单个分析可以提供在问候样本内的组分的性质基本信息。重要的是，破坏性和非破坏性测试可以精确地在同一时间进行，而不检测延迟。这允许的绝对分配，例如使用^DPPH•试剂，与组件观察以洗脱用UV和/或质谱（MS）检测响应^7,11抗氧化剂。因此，四个独立检测器可同时与水流通过任何四个出口端口引导到每个检测器适当部分进行操作。因为通过这些端口的流动可以容易地调节溶质到达任意检测器中的量可被调节以适合给定的检测器源的灵敏度。应当指出，然而，最有效的溶质迁移通过径向中央出口端口观察。每个外围设备端口提供等同的分离效率，其中当通过每个端口设置为25％，仅比传统柱略有效率较低。因此，重要的是定量检测器被设置为从径向中央出口分析样品。

当设置用于多路复用检测目的一个PSF列有一些需要被制成以实现高效率和高品质的效果方面的考虑;选择哪个端口的一种类型的检测器和流量调节的是管的尺寸为每个端口，。

管外形尺寸为每个端口

在层析柱后的管道长度起着分离的效率和性能至关重要的作用。大DEA的d体积从柱出口到检测器长或宽的id管的结果，将导致效率，分辨率和灵敏度的损失。因此，设置在PSF柱以达到最大的潜力在提供有效的分离，同时提供多路复用的好处时适当管道尺寸必须被利用。

港探测器

图2是多重检测（紫外-可见（U -可见光），质谱（MS）和2,2-二苯基-1-苦基 ​​苯肼^{（DPPH•）}检测）的一个例子的设置的图示。该图显示了中央端口附连到质谱仪，而^DPPH•和紫外-可见检测器被附连到外设端口。由于MS是三种最敏感的检测器，流动到该检测器从中央出口端口被指挥。由于^DPPH•检测是选择性的presencË的抗氧化剂，和最不敏感和最耐受谱带增宽，流到这个检测器从一个外围端口被指挥。紫外 – 可见是次要的“通用”探测器，因此流向该探测器从第二外设端口的导演。

流量调节

一旦适当的管道已被附接到从一个端口到检测器，从各检测器的排出流量可调节到所需的量。测量流量从每个检测器排出的量的简单方法是称量流动相的洗脱通过每个端口上的给定时间段的量。的百分比流量因此可确定，并且通流比可通过缩短或延长附着于检测器的出口管线管据此以适合所选择的检测器的要求进行调整。不同的检测器具有流量不同的要求，例如，流动细胞荧光检测器（FLD）不流速的限制，但必须小心以避免过度加压流通池。因此流过FLD的控制通常是通过调整穿过其他检测器的压降和流量的剩余部分然后通过FLD传递实现。的检测器即流被递送的量敏感是MS。一般情况下，目前的高端质谱仪可以很容易地处理大约1〜1.5毫升/中度水流动相分。上述该流速，源的驱可能使该MS无法操作。然而，在大多数质谱仪检测灵敏度受益通过使用较低的流速;因此，PSF分流能力是涉及MS检测应用中非常有用。高柱体积流速可以利用，但随着运送到质谱仪低容量负载。流动到MS检测器的调谐，然而，必须通过调整前向压降制成质谱检测器，而不是后期的MS。这里，使用窄孔管（0.1毫米内径）是非常有用的，因为压力可以在不增加不适当的死体积容易地调节。

取决于检测器的类型的分割比的调整既可以做前或后检测器。如果一个非破坏性的检测器，如紫外可见时，流量百分比将被测量和调整交检测器。如果单个检测器破坏性被用在多重设置的流百分比通过回计算相对于其他端口流动百分比来确定。如果一个试剂基于检测器的使用，例如^DPPH•，流程百分比被测量不加入试剂后检测器;如果两个或更多的破坏性检测器被使用，则流量比被测量预检测器。检测系统可能需要额外的仪器仪表等^DPPH•，将有额外的系统压力可能改变流动百分比一旦附着到检测系统。因此，慎重考虑应支付给破坏性检测系统压力，调节流量百分比时，预先检测。不论是通过任何端口设定的流量比的，定量信息应通过适当的标准化而获得。一旦流量比设置，但是，它们是健壮的，他们甚至不下的梯度洗脱条件⁷改变，

详细的视频协议附带的这篇稿件的目的是展示如何在检测的复用方式，使用和调整PSF列运作。

Protocol

注：该协议包含有关如何使用PSF列上加上多个探测器多重检测高效液相色谱系统的说明。该协议已被写入假设读者已经在色谱仪及各种HPLC检测方法的基本知识和经验。 注意：请参阅材料安全数据表（MSDS）的所有材料和试剂使用前（ 即 MSDS甲醇）。确保使用一切适当的安全措施处理溶剂和高效液相色谱法（HPLC）洗脱时。确保适当使用高效液相色谱仪，分析天平和检测?…

Representative Results

一个复用HPLC分析进行了使用PSF模式（ 图1）的后列，并设置为如图 2所示。这种类型的设置允许的咖啡样品同时通过UV-Vis，DPPH•和MS的总分析离子计数（TIC）模式。咖啡样品作出答复DPPH•的化合物然后可以很容易地匹配到紫外可见和MS -基于保留时间对准的TIC响应，如图3中，由于同时记录色谱图。其中正响应来自MS-TIC检测器看到?…

Discussion

这项研究涉及的表征和使用高效液相色谱多重检测采用平行分段流动（PSF）列咖啡剖析。复使用的HPLC柱的PSF使关键化学实体的表征和鉴定通过减少而它需要使用常规的多检测处理的一小部分时间内获得更大程度的分子的特定信息的样品的数据的复杂性。该PSF列不仅可为多重检测平台，同时还兼具破坏性和非破坏性检测相结​​合，无需额外的死体积和管道。 ^{DPPH•，UV-Vis}和MS（TIC）进行多…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels