Paralel Segment Akış Sütun Tuning ve Multipleks Algılama etkinleştirme
Summary
Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.
Abstract
Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.
Introduction
Aktif Akış Teknoloji Sütunlar
Aktif akım teknolojisi (AFT) kromatografi kolonları son zamanlarda akış heterojenite 1-6 ile bağlantılı ayrımları verimsizliğe üstesinden gelmek için geliştirilmiş ve aynı zamanda mültipleksli algılamayı etkinleştirmek için. Bu özel iletişim ayrıntılarıyla paralel operasyonel süreç mültipleksli algılama ile akış (PSF) sütun bölümlenmiş. PSF kolonun temel fonksiyonel avantajlar şunlardır: (1) kolon yatak radyal merkezi bölgeden akışı, (2), bir tespit tarafından işlenen mobil faz hacim akışının çevre ya da duvar bölgesinden izole edilir Kaynak azalır, ve (3) algılama kaynakları her algılama süreci boyunca tespit gecikmeleri instilling veya sonradan yazılan sütun akışın 7,8 yarma gerektirmeden örnek bilgileri genişletmek için çoğaltılmış olabilir. A sağlayan PSF sütunun tasarımında anahtar özelliğibirden fazla mesaj saptama dvantage yeni çıkış bağlantı ve frit düzeneği olup. 1, geleneksel bir kolona kıyasla AFT kolonun bir fotoğrafıdır. Bu bölme işlemi sonrası kolon akış akış bölme aynı değildir paralel parçalı akış sütunlar kullanılarak elde anlamak için önemlidir. Bir post kolon akımdan (yani, eksenel), böylece her bir akış akışı verimliliği ve duyarlılık ile eşit derecede örneklenir kuyruk ekstremitelere lider kenarından tüm numune bandı bölünmüş; duyarlılık büyüklüğü dolayısıyla sayısı böler tarafından bölünmüş. PSF ise, bölme işlemi örnekleri bant radyal, eksenel değil. Bu nedenle, merkez liman örnekleri zirve apeks – tepe en konsantre bölgesi. Pik yaygın atık bölgeye göre seyreltilmiş değildir Böylece, burada hassasiyet yüksektir. Periferik bağlantı noktalarından elüsyon Örnek merkezindeki kadar etkili değildirbandı yerine eksenel olarak daha radyal olarak örneklenmiş olduğu için l bölgesi, ancak, tepe genişliği, örneğin, eksenel yönde bir Kolon sonrası bölünme tepe bölen bir numune alma işlemi için olacağından daha dardır. Bu nedenle, konsantrasyon bağımlı bir detektör ile hassasiyet azaltılmaz.
PSF sütununda, çıkış bağlantı çok sayıda çıkış ağızlarından oluşan ve montaj bu amaçla iç kısmında halka şeklinde bir cam hamuru vardır yer almaktadır. Çıkış hamuru kanallarının dış radyal kısmı çevresel veya duvar kısmı çıkış akış portları yoluyla kolondan dışarı akarlar ise, bu halka şeklindeki frit kanallarının iç kısım, radyal merkezi çıkış portu üzerinden kolondan dışarı akarlar. Çıkış frit iç ve dış kısımlar, bu akım bölgeleri 2 arasındaki çapraz akışını önleyen bir geçirmez bir bariyer ile ayrılır. Bu tasarımın bir sonucu olarak, kolon yatağı üzerinden merkezi radyal akış akımı duvar kısmı akış bileşenler ayrılırsütun ide. Bu iki bölgeden akışının ilgili kısım bu tür bir ayırma verimliliği veya algılama hassasiyeti sütun teknolojinin çeşitli fonksiyonel yönleri, optimize etmek için, basınç yönetimi hemen hemen herhangi bir arzu edilen orana değiştirilebilir. Özünde, bu tasarım etkili bir dar iç çapa sahip, geniş formatlı sütununda bir 'sanal' sütunu içinde kurar ve kolon yatak heterojenitesini ve duvar efektleri 9,10 üstesinden gerçek bir duvar daha az sütun olarak dolayısıyla kolon fonksiyonları.
PSF sütunların önemli faydaları kolon verimliliği, algılama kaynağı (lar) ve mültipleksli algılama etkinleştirmek için çözücü işlem minimize gelişmeler vardır. Bununla birlikte, ek bir avantajı, herhangi bir bandın atık ve önü bölgeleri genel elüsyon çıkarılır, çünkü elüsyon veya saptama de çözünmüş madde profili olmasıdır, aksi takdirde, aynı s gözlemlenen edilenden daha yüksek bir konsantrasyonda mevcut olduğuKullanılan bölütleme oranına bağlı olarak, geleneksel bir sütun üzerinde enjeksiyon ve konsantrasyon yük olute. Bunun bir sonucu olarak genellikle PSF sütun 2 üzerinde yapılan ayırımlar için sinyal yoğunluğundaki bir kazanç olduğu gözlemlendi. Aslında, bölütleme oranı, dört çıkış ağızlarının her biri akış çıkış% 25, mor ötesi (UV) algılama kullanılarak gözlenir sinyal yoğunluğu, geleneksel bir ile belirgin olarak aynı sinyal yoğunluğu pratik gösterir, öyle ki düzeltilmiş olup olmadığını Hareketli fazın tamamı (% 100) 7 incelendiğinde kolonu. Ayrıca, merkez ve çeper akış bölgeleri arasındaki çıkış oranı ince ayar kolon verimliliği optimize edilmesini sağlar. (1) debi, (2) segmentasyon oranı ve (3) çözünen tutma faktörü: Sütun verimliliği kazançlar bu verimlilik kazançları üç faktörün fonksiyonu olduğundan, tek bir değere ifade edilemez AFT sütunlarını kullanarak gözlenen . Bununla birlikte, verimlilik kazanımları conv göreentional sütunlar hemen hemen her zaman gözlenir ve bazen bu kazanımlar teorik plaka 1,2 sayısında% 100'den fazla bulunmaktadır. Ayarlamak için yeteneği segmentasyon oranı analisti etkin bir 'sanal' sütununun çapı terzi sağlar ve bu algılama sürecine ilişkin önemli bir faktördür. Bölütleme nispeti dairesel merkez çıkış portundan elüsyon mobil faz% 21 olduğu zaman, örneğin, bir sanal 2.1 mm iç çapı (id) kolonu, fiziksel bir 4.6 mm id kolonundan kurulur. Bu koşullar altında, 2.1 mm id, sanal sütun, akış hızına bağlı olarak, geleneksel bir 2.1 mm id sütun daha fazla% 70 daha büyük olabilir verimlilik ve çözünen tutma faktörü 10 ile gerçekleştirir.
Mültipleksli tespiti için kullanılan geçerli PSF kolon tasarımı 4-portlu uydurma çıkış içeriyor, ancak sütun takılabilir 2 port uç parçası da, ancak, bu algılama t sınırlarSadece iki dedektör o. Bu dört dedektörleri mültipleksli tespiti için kapsamının genişletilmesi 4-port çıkış PSF sütun aynı anda bağlanabilir dışında bu sütunlardan temel çalışma, ancak, aynıdır. Kenara öncesi ve sonrası kolon bağ borudan, sadece ek gereklilikleri PSF sütun periferal çıkış delikleri bağlanabilir boru ve her tüpe geçen mobil faz miktarı ölçülebilir hangi bir vasıta olup çalıştırmak için, tipik bir kitle ölçümü veya hacimsel ölçüm ya. Ayarlama kolaylığı açısından, bütün çıkış akış boru iç çapı ile aynı olmalıdır. Periferik ve santral radyal çıkış limanları arasında akış oranı daha sonra sadece uydurma periferal çıkışında, veya radyal merkezi çıkış noktası üzerinde tüp sonrası dedektör uzunluğu bulunan boru uzunluğunu değiştirerek, basınç yönetimi kullanımı yoluyla değiştirilir.
Multiplexed Algılama PSF sütunlar kullanma </strong>
PSF gruplarından önemli bir avantajı, çıkış çıkış ağızlarının her biri, böylece birden fazla mesaj saptama sağlayan bir algılama kaynağına doğrudan bağlanabilir olmasıdır. Iyi tasarlanmış bir tespit sistemi olarak birden fazla mesaj göndermiş algılama ile tek bir analiz numunesi içindeki bileşenlerin doğası ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir. Önemlisi, yıkıcı ve tahribatsız testler algılama gecikmeden, tam olarak aynı anda yapılabilir. Bu bileşenler UV ve / veya kütle spektrometrisi (MS) tespit yanıtları 7,11 ile elüte gözlenmiştir ile DPPH • reaktifi kullanılarak, örnek, bir anti-oksidan için, mutlak atanmasına olanak verir. Bu nedenle, dört bağımsız detektörler, dört çıkış portu üzerinden her bir detektöre yönlendirilir akış uygun oranlarda eşzamanlı olarak çalıştırılabilir. Bu bağlantı noktaları üzerinden akışı kolayca dedektörleri herhangi ulaşan çözünen miktarı ayarlanabilir beri takım elbise ayarlanabilirAyrıca dedektörün kaynağının hassasiyeti. Bu en etkili çözünen geçiş radyal merkezi çıkış deliğinden görülmektedir ki, not edilmelidir. Periferik limanların her her port üzerinden% 25 olarak ayarlandığında, sadece biraz daha az verimli geleneksel sütunda daha eşdeğer ayırma verimliliği, sunuyoruz. Bunun gibi, nicel dedektör radyal merkezi çıkış ağzının numunenin analiz etmek için ayarlanmış olması önemlidir.
Çoğullama tespiti amacıyla bir PSF sütun kurarken, verimli ve yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için yapılması gereken hususlar bir dizi vardır; her port için tüp boyutları olduğunu, seçim dedektörü ve akış ayarlaması türü için hangi port.
Her Limanı için Tüp Boyutları
Kromatografide Kolon sonrası boru uzunluğu ayırma verimliliği ve performansında önemli bir rol oynar. Büyük deadetektöre kolon çıkışında, uzun ve geniş id boru sonucu d hacimli verimliliği, çözünürlük ve hassasiyet kaybına neden olur. Çoğullama faydalarını sağlarken etkili ayırma sağlayan maksimum potansiyel ulaşmak için PSF sütun kurarken Böylece, uygun boru ölçüleri kullanılmalıdır.
Dedektör Port
Şekil 2, birden fazla mesaj saptama (Ultraviyole-Görünür (U-Vis), kütle spektrometresi (MS) ve 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) • tespiti) bir örnek kurulumun bir gösterimidir. Illüstrasyon, merkezi liman DPPH • oysa MS dedektör bağlı olduğu ve UV-Vis dedektörleri periferik limanlarına bağlı olduğunuzu gösterir. MS üç en hassas dedektör olduğundan, merkezi çıkış deliğinden yönettiği bu dedektöre akar. DPPH • algılama gibi presenc seçicidirantioksidanların e ve bu dedektöre akış, en az duyarlı ve bant genişlemesine en hoşgörülü bir çevresel limandan yönetilmiştir. UV-Vis ikincil 'genel' dedektör olduğunu, bu yüzden ikinci bir çevresel limandan yönettiği bu dedektöre akar.
Akış Ayarı
Uygun boru dedektöre bir limandan bir kere yerleştirildikten sonra, dedektörden her biri çıkan akım gerekli miktara ayarlanabilir. Her dedektör çıkan akış miktarını ölçmek için basit bir yolu zaman belirli bir süre boyunca her port üzerinden elutes mobil faz miktarını tartmak etmektir. Yüzde akışı böylece tespit edilebilir ve akış oranları kısaltılması veya buna uygun olarak tercih edilen detektör gereksinimlerine uygun detektör üzerindeki çıkış hattına bağlı boru uzatma biri tarafından ayarlanabilir. Farklı detektörler, örneğin, akış hücresi, akış farklı gereksinimleri vardırBir floresan dedektörü (FLD) oranı sınırlı akış değil, ama bakım akış hücresi aşırı basınçlandırma önlemek için alınmalıdır. Bu nedenle FLD boyunca akış kontrolü genellikle, diğer dedektör boyunca basınç düşüşünü ve akışın geri kalan daha sonra FLD geçer ayarlanmasıyla elde edilir. Teslim edilir akış miktarı duyarlı olan bir detektör, MS olup. Genellikle, mevcut yüksek uç kütle spektrometre kolayca yaklaşık 1 ila 1.5 ml / orta sulu mobil faz min işleyebilir. Bu akış hızının üzerinde, kaynağın sel MS çalışamaz hale getirebilir. Ancak, çoğu kitle spektrometrelerde algılama hassasiyeti düşük akış oranları kullanılarak yararlandı; dolayısıyla PSF akış bölme yetenekleri, MS algılama içeren uygulamalar için son derece faydalıdır. Yüksek kolon hacimsel debiler ancak MS dedektör taşınan düşük hacimli yükleri ile, kullanılabilir. MS detektöre akış ayarlama Bununla birlikte, önceki basınç düşüşü ayarlama yapılmalıdırMS dedektör yerine yazılan MS. Basınç kolayca uygunsuz ölü hacim eklemeden ayarlanabilir olarak Burada, dar delik boru (0.1 mm id) kullanımı çok yararlıdır.
Dedektör tipine segmentasyon oranının ayarlanması bağlı öncesi ya da sonrası her iki dedektör yapılabilir. UV-Vis kullanıldığı gibi bir tahribatsız dedektör, akış yüzdesi ölçülür ve sonrası dedektörü ayarlanmış olsaydı. Tek bir yıkıcı dedektör kurmak multipleks kullanılması durumunda akış yüzdesi geri diğer liman akış yüzdeleri bakımından hesaplanarak belirlenir. Reaktif detektör gibi DPPH • olarak kullanılır ise, akış oranı reajanı eklenmesi olmaksızın direk detektörü ölçülür; İki veya daha fazla yıkıcı dedektörleri kullanılırsa, o zaman akış oranı öncesi dedektör ölçülür. Algılama ek enstrümantasyon gibi DPPH • gerektirebilir sistemleri, akış değiştirebilir ekstra sistem basıncını olacakyüzde kez algılama sistemine bağlı. Bu nedenle, dikkatli bir değerlendirme yıkıcı bir dedektörün sistem basıncı, debi oranını ayarlayarak ön dedektöre dikkat edilmelidir. Bakılmaksızın port herhangi aracılığıyla ayarlanır akış oranı, kantitatif bilgiler uygun standardizasyon yoluyla elde edilmelidir. Akış oranları ayarlandıktan sonra, ancak, bunlar sağlam ve hatta gradient çıkma koşulları 7 altında değişmeyen,
Bu yazının eşlik ayrıntılı video protokolü algılama çoklanmış modda PSF sütun işleyişini kullanmak ve ayarlamak nasıl göstermek için tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma karakterizasyonu ve mültipleksli algılama paralel parçalı akış (PSF) sütunu istihdam ile HPLC kullanılarak kahve profilleme gerektirir. PSF sütunlarını kullanarak Multiplexed HPLC geleneksel multi-algılama süreçleri kullanarak alır zaman bir kısmını içinde molekül-özel bilgilerin daha yüksek derecede elde ederken örnek veri karmaşıklığını azaltarak önemli kimyasal kişilerin belirlenmesi ve tanımlanmasını sağlar. PSF sütun mültipleksli tespiti için bir platform sağlar,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
