Sintonizar um paralelo Coluna Segmentada fluxo e permitindo a detecção multiplexada

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Colunas Fluxo de Tecnologia ativos

Tecnologia de fluxo Ativa (AFT) colunas de cromatografia foram recentemente desenvolvidas para superar a ineficiência nas separações associados a heterogeneidade de fluxo de ^1-6 e também para permitir a detecção multiplexada. Nesse particular detalhe comunicação que o processo operacional do paralelo segmentado coluna de fluxo (PSF), com detecção multiplexada. As vantagens funcionais da coluna PSF são: (1) o fluxo a partir da região central radial do leito da coluna é isolado a partir da região periférica ou parede de fluxo, (2) o volume de fase móvel que devem ser processados ​​por uma detecção fonte é reduzida e as fontes (3) detecção podem ser multiplexados para expandir a informação da amostra sem atrasos de detecção de incutir em cada processo de detecção, ou posteriormente, necessitando a divisão de um fluxo de fluxo pós-coluna ^7,8. A característica essencial no desenho da coluna PSF que permite que o umdvantage de detecção é a saída multiplexada acessório de montagem e frita de novo. A Figura 1 é uma fotografia da coluna AFT comparada com uma coluna convencional. É importante compreender que o processo de separação obtido utilizando colunas de fluxo paralelas segmentado não é o mesmo que o fluxo de fluxo pós-coluna de divisão. Em uma corrente de fluxo pós-coluna dividir toda a banda de amostra a partir da borda para as extremidades da cauda é igualmente incluídos na amostra (isto é, axialmente), desse modo, cada corrente de escoamento é igual no que respeita à eficiência e sensibilidade; a magnitude da sensibilidade, assim, ser divididos pelas divisões numéricas. Em PSF, no entanto, as amostras do processo de divisão da banda radialmente, não axialmente. Como tal, as amostras de portas centrais vértice do pico – a região mais concentrada do pico. Assim, a sensibilidade mais elevada aqui é como o pico não é diluída pela região da cauda difusa. A amostra eluindo a partir das portas periféricas não é tão eficiente como no CentraL zona, mas, uma vez que a banda é amostrado radialmente, ao invés de axial, a largura do pico é mais estreito do que seria o caso para um processo de amostragem que divide o pico na direcção axial, isto é, uma separação pós-coluna. Por conseguinte, a sensibilidade do detector com uma concentração dependente não é reduzida.

Na coluna PSF, o acessório de saída compreende várias portas de saída e no interior desta extremidade encaixe ali está alojado um filtro poroso anelar. A porção interior de canais de frita anulares esta fluir para fora da coluna através da porta de saída central radial, enquanto que a porção radial exterior dos canais de tomada de frita de fluir para fora da coluna através das portas de fluxo de saída periférica ou zona da parede. As porções interior e exterior da frita de saída são separadas por uma barreira impermeável que impede o escoamento transversal entre estas regiões de fluxo ^2. Como consequência desta concepção da corrente central de fluxo radial através do leito da coluna está separado do fluxo de parede ins regiãoide a coluna. A parte relativa de fluxo a partir destas duas regiões pode ser variado para se quase qualquer proporção desejada através de uma gestão de pressão, a fim de optimizar vários aspectos funcionais da tecnologia de coluna, tais como a eficiência de separação ou a sensibilidade da detecção. Em essência, este projeto estabelece de forma eficaz dentro da grande coluna de formato de uma coluna de 'virtual', com um diâmetro interno estreito, e, portanto, as funções de coluna como uma coluna na parede menos verdadeiro, superando coluna de leito heterogeneidade e os efeitos de parede ^9,10.

Os principais benefícios do colunas PSF são melhorias na eficiência da coluna, a minimização do solvente de processamento para a detecção de fonte (s) e permite a detecção multiplexado. No entanto, uma vantagem é que uma vez que a cauda e as regiões de frente de qualquer banda são removidos a partir do perfil de eluição geral na eluição do soluto ou detecção está presente em uma concentração mais elevada do que de outro modo seriam observados para os mesmos solute injecção e a concentração de carga em uma coluna convencional, dependendo da relação de segmentação empregue. Como consequência, é muitas vezes observado um ganho na intensidade do sinal para separações conduzidas em colunas ² PSF. Na verdade, se o rácio de segmentação é ajustada de tal modo que 25% das saídas de fluxo de cada uma das quatro aberturas de saída, a intensidade do sinal que é observada usando violeta (UV) de detecção ultra mostra praticamente a mesma intensidade de sinal exacto como aparente, utilizando uma convencional coluna onde a totalidade (100%) da fase móvel é analisada ^7. Além disso, o ajuste fino da relação de saída de fluxo entre as regiões central e parede permite que a eficiência da coluna para ser optimizado. Os ganhos de eficiência da coluna observada usando colunas AFT não pode ser indicado como um único valor, uma vez que estes ganhos de eficiência são uma função de três factores: (1) a taxa de fluxo, (2) a relação de segmentação, e (3) o factor de retenção de soluto . No entanto, os ganhos de eficiência em comparação com conventional colunas são quase sempre observada, e por vezes, esses ganhos são mais do que 100% do número de pratos teóricos ^1,2. A capacidade de ajustar o rácio de segmentação permite que o analista para adaptar efectivamente o diâmetro da coluna "virtual", e este é um factor importante no que diz respeito ao processo de detecção. Por exemplo, uma coluna virtual de 2.1 mm de diâmetro interno (ID) é estabelecida a partir de uma coluna ID de 4.6 mm quando a relação física segmentação é de 21% de fase móvel eluindo a partir do orifício de saída central radial. Sob estas condições, a coluna id Virtual 2.1 mm realiza com uma eficiência que podem ser mais do que 70% maior do que a coluna convencional ID de 2.1 mm, dependendo da taxa de fluxo, e factor de retenção de soluto ^10.

O design de coluna PSF corrente que é utilizado para a detecção multiplexado incorpora uma porta de saída de 4-montagem, mas a coluna pode ser equipado com uma porta 2-Também-encaixe final, no entanto, esta limita a detecção tO apenas dois detectores. A operação básica destas colunas é, no entanto, o mesmo, excepto que os quatro detectores podem ser acopladas simultaneamente à saída da coluna PSF 4-porta alargar o âmbito de detecção multiplexado. Além da coluna de tubos conjuntivo pré e pós, os únicos requisitos adicionais para operar uma coluna PSF é tubos que podem ser ligados às portas de saída periférica, e um meio pelo qual a quantidade de fase móvel passa através de cada tubo pode ser medido, costuma ser uma medição de massa ou uma medição volumétrica. Para facilidade de ajuste, o diâmetro interno de toda a tubagem de fluxo de saída deve ser o mesmo. A razão de fluxo entre as aberturas de saída centrais periféricas e radiais é então variado através da utilização de gestão de pressão, simplesmente por alteração do comprimento do tubo localizado na saída periférica encaixe, ou o comprimento de pós tubo detector do orifício de saída central radial.

Detecção multiplexado Usando colunas do PSF </strong>

Uma vantagem importante das colunas PSF é que cada uma das aberturas de saída de saída pode ser ligado directamente a uma fonte de detecção, permitindo assim a detecção multiplexado. Em um sistema de detecção bem concebido com uma única análise de detecção multiplexada pode proporcionar informação substancial no que diz respeito à natureza dos componentes no interior da amostra. Importante, ensaios destrutivos e não destrutivos podem ser conduzidas exactamente ao mesmo tempo, sem atraso de detecção. Isto permite a atribuição absoluta de, por exemplo, anti-oxidantes, utilizando DPPH ^• reagente, com componentes para eluir observado com UV e / ou espectrometria de massa (MS) de detecção de respostas de ^7,11. Portanto, quatro detectores independentes pode ser operado simultaneamente com porções adequadas de fluxo dirigido para cada detector através de qualquer uma das quatro portas de saída. Uma vez que o fluxo através destas portas pode ser facilmente ajustado a quantidade de soluto, atingindo qualquer dos detectores pode ser ajustado para se adequara sensibilidade do detector dada fonte. Deve notar-se, no entanto, que a migração de soluto mais eficiente é observado através da porta de saída central radial. Cada uma das portas periféricos oferecem eficiência de separação equivalente, o qual quando ajustado para 25% através de cada porta, é apenas ligeiramente menos eficaz do que uma coluna convencional. Como tal, é importante que o detector quantitativa ser configurado para analisar amostras a partir da porta de saída central radial.

Ao definir-se uma coluna de PSF para a finalidade de detecção de multiplexação há uma série de considerações que necessitam ser feitas para alcançar resultados eficazes e de alta qualidade; que é dimensões de tubos para cada porta, escolha de qual porta para um tipo de detector e de regulação do fluxo.

Dimensões do tubo para cada porta

Na cromatografia a extensão de tubagem pós coluna desempenha um papel crucial na eficiência e o desempenho da separação. Dea Granded-volume como resultado da tubagem ID comprida ou larga de saída da coluna para detector irá resultar numa perda de eficiência, sensibilidade e resolução. Assim, as dimensões tubulação apropriada deve ser utilizado quando a configuração da coluna PSF para atingir o potencial máximo na prestação de separação eficiente e proporcionar os benefícios de multiplexação.

Porto de Detector

A Figura 2 é uma ilustração de uma configuração de detecção exemplo multiplexado (Ultra-Violeta Visível (L-VIS), espectrómetro de massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH ^•) de detecção). A ilustração mostra a porta central é ligado ao detector de MS, enquanto que o DPPH ^• e detectores de UV-vis estão ligados às portas periféricas. Uma vez que a MS é o detector mais sensível dos três, fluir para este detector foi dirigido a partir do orifício de saída central. Como DPPH ^• detecção é seletiva para o presence de antioxidantes, e a menos sensível e mais tolerante a banda de alargamento, fluir para este detector foi dirigida a partir de uma porta periférica. O UV-Vis era um detector secundário "genérico", por isso fluir para este detector foi dirigida a partir de uma segunda porta periférica.

Ajuste fluxo

Uma vez que a tubagem adequada foi ligada a partir de uma porta de detector, o fluxo de saída de cada um dos detectores pode ser ajustado para a quantidade necessária. Uma maneira simples para medir a quantidade de fluxo de saída a partir de cada detector é para pesar a quantidade de fase móvel que elui através de cada porta ao longo de um determinado período de tempo. A percentagem de fluxo pode assim ser determinada, e as razões de fluxo pode ser ajustado por qualquer encurtar ou alongar o tubo ligado à linha de saída de detectores de acordo com os requisitos que se adequa dos detectores de escolha. Diferentes detectores têm diferentes requisitos de fluxo, por exemplo, a célula de fluxo deum detector de fluorescência (FLD) não está caudal limitado, mas deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de pressurização da célula de fluxo. Por isso, o controlo de fluxo através do FCDP é normalmente alcançada ajustando a queda de pressão através dos outros detectores e o resto do fluxo, em seguida, passa através da FLD. Um detector que é sensível à quantidade de fluxo que é emitido é o MS. Geralmente, espectrómetros de massa de alta corrente finais podem processar facilmente a cerca de 1 a 1,5 ml / min de fase móvel aquosa moderadamente. Acima desta velocidade de fluxo, inundação da fonte pode fazer as MS inoperável. No entanto, a sensibilidade de detecção na maioria dos espectrômetros de massa é beneficiado usando taxas de fluxo inferiores; portanto, as capacidades de divisão de fluxo de PSF são extremamente úteis para aplicações que envolvem a detecção de MS. Caudais volumétricos alta coluna pode ser utilizada, mas com cargas baixas volume transportado para o detector de MS. Sintonização do fluxo para o detector de MS, contudo, deve ser feita ajustando a queda de pressão antes daDetector MS, em vez de pós-MS. Aqui, a utilização de tubos de diâmetro estreito (0,1 mm ID) é muito útil, como a pressão pode ser facilmente ajustado sem adicionar inadequado volume morto.

Dependendo do tipo de detector de o ajustamento da relação de segmentação pode ser feito, quer detector de pré ou pós. Se um detector não destrutivo, tal como é utilizado de UV-Vis, da percentagem de fluxo seria medido e ajustado pós detector. Se um único detector destrutivo é utilizado no multiplex configurar a percentagem de fluxo é determinada pelo cálculo para trás em relação a outras percentagens de fluxo de porta. Se um detector baseado reagente é utilizado, como DPPH ^•, a percentagem de fluxo é medido detector de pós, sem a adição de reagente; e se dois ou mais destrutivas detectores são usados, então a relação de fluxo é medido pré-detector. Sistemas que podem exigir instrumentação adicional, tal DPPH ^• Detecção, terá a pressão do sistema extra que pode alterar o fluxopercentagem uma vez ligado ao sistema de detecção. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser dada a pressão do sistema de um detector destrutiva, ao ajustar percentual fluxo pré-detector. Independentemente da razão de fluxo que está definido através de qualquer uma das portas, informação quantitativa deve ser obtida por meio da padronização adequada. Uma vez que as razões de fluxo são configurados, no entanto, eles são robustos, e não mudam mesmo sob condições de eluição em gradiente ^7,

O protocolo de vídeo detalhado que acompanha este manuscrito se destina a mostrar como usar e ajustar o funcionamento da coluna PSF em um modo multiplexado de detecção.

Protocol

Nota: Este protocolo contém instruções sobre como usar uma coluna de PSF em um sistema de HPLC associada a múltiplos detectores para detecção multiplexada. O protocolo foi escrito assumindo que o leitor tenha conhecimentos básicos e experiência em cromatografia e vários métodos de detecção de HPLC. Atenção: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para metanol). Garantir a ut…

Representative Results

Uma análise por HPLC multiplexada foi realizada utilizando uma coluna de TFA no modo de PSF (Figura 1) e configurado como ilustrado na Figura 2. Este tipo de configuração permitiu uma amostra de café para ser analisada simultaneamente usando UV-Vis, de DPPH • e MS No total Contagem Ion modo (TIC). Os compostos da amostra de café que responderam ao DPPH • poderia, então, ser facilmente compensada aos UV-Vis e MS – respostas de TIC com base…

Discussion

Este estudo envolve a caracterização e definição de perfis de café utilizando HPLC com detecção multiplexada empregando uma coluna paralela fluxo segmentado (PSF). Multiplexada HPLC utilizando colunas PSF permite a caracterização e identificação de entidades químicas chave reduzindo a complexidade de dados da amostra, enquanto a obtenção de um maior grau de informações específicas da molécula dentro de uma fracção do tempo que leva a utilização de processos de detecção de múltiplos convencionais…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels