एक समानांतर खंडों प्रवाह स्तंभ ट्यूनिंग और मल्टिप्लेक्स पता लगाने में सक्षम
Summary
Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.
Abstract
Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.
Introduction
सक्रिय फ्लो प्रौद्योगिकी कॉलम
सक्रिय प्रवाह प्रौद्योगिकी (पीछे) क्रोमैटोग्राफी कॉलम हाल ही में प्रवाह विविधता 1-6 से जुड़े विभाजन में अक्षमता पर काबू पाने के लिए विकसित किए गए हैं और यह भी मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए सक्षम है। यह विशेष रूप से संचार हम विस्तार से समानांतर के परिचालन की प्रक्रिया मल्टिप्लेक्स पता लगाने के साथ प्रवाह (पीएसएफ) स्तंभ खंडों। पीएसएफ स्तंभ की कुंजी कार्यात्मक लाभ कर रहे हैं: (1) स्तंभ बिस्तर के रेडियल मध्य क्षेत्र से प्रवाह, (2) एक का पता लगाने के द्वारा कार्रवाई की जानी चाहिए कि मोबाइल चरण की मात्रा प्रवाह के परिधीय या दीवार क्षेत्र से अलग है स्रोत कम हो जाता है, और (3) का पता लगाने के सूत्रों प्रत्येक पता लगाने की प्रक्रिया भर में पता लगाने में देरी instilling, या बाद में एक के बाद स्तंभ प्रवाह धारा 7.8 के बंटवारे की जरूरत महसूस बिना नमूना जानकारी विस्तार करने के लिए मल्टिप्लेक्स जा सकता है। एक सक्षम बनाता है कि पीएसएफ स्तंभ के डिजाइन में प्रमुख विशेषतामल्टिप्लेक्स का पता लगाने के dvantage उपन्यास आउटलेट फिटिंग और मिलाना विधानसभा है। एक एक पारंपरिक स्तंभ की तुलना पिछाड़ी स्तंभ की एक तस्वीर है चित्रा। यह बंटवारे की प्रक्रिया के बाद स्तंभ प्रवाह धारा बंटवारे के रूप में ही नहीं है समानांतर खंडों प्रवाह कॉलम का उपयोग कर प्राप्त समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक के बाद स्तंभ प्रवाह धारा में (यानी, अक्षीय रूप से), जिससे प्रत्येक प्रवाह धारा कार्यकुशलता और संवेदनशीलता के लिए सम्मान के साथ बराबर है उतना ही नमूना है पूंछ के हाथ पैरों के लिए अग्रणी धार से पूरे नमूना बैंड विभाजित; संवेदनशीलता की भयावहता जिससे नंबर विभाजन से बांटा जा रहा है। पीएसएफ में, हालांकि, विभाजन प्रक्रिया के नमूने बैंड त्रिज्यात, नहीं अक्षीय। जैसे, केंद्रीय बंदरगाह नमूने शिखर सुप्रीम – चोटी का सबसे केंद्रित क्षेत्र। शिखर फैलाना पीछा क्षेत्र से पतला नहीं है के रूप में इस प्रकार, यहाँ संवेदनशीलता सबसे अधिक है। परिधीय बंदरगाहों से eluting नमूना Centra में के रूप में कुशल नहीं हैबैंड बल्कि अक्षीय रूप से, त्रिज्यात जांचा जाता है के बाद से एल क्षेत्र है, लेकिन, शिखर की चौड़ाई, यानी, अक्षीय दिशा में एक के बाद स्तंभ विभाजन शिखर बांटता है कि एक नमूना प्रक्रिया के लिए मामले की जाएगी से संकरा है। इसलिए एक एकाग्रता निर्भर डिटेक्टर के साथ संवेदनशीलता कम नहीं है।
पीएसएफ कॉलम में, आउटलेट फिटिंग एकाधिक बाहर निकलें बंदरगाहों शामिल हैं और फिटिंग यह अंत के अंदर पर एक कुंडलाकार मिलाना वहाँ रखे है। आउटलेट मिलाना चैनलों के बाहरी रेडियल भाग परिधीय या दीवार क्षेत्र आउटलेट प्रवाह बंदरगाहों के माध्यम से स्तंभ के बाहर प्रवाह, जबकि इस कुंडलाकार मिलाना चैनलों के भीतरी भाग, रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह के माध्यम से स्तंभ के बाहर प्रवाह। आउटलेट मिलाना के भीतरी और बाहरी भागों इन प्रवाह क्षेत्रों 2 के बीच पार प्रवाह को रोकता है कि एक अभेद्य अवरोध से अलग हो रहे हैं। इस डिजाइन का एक परिणाम के रूप में स्तंभ बिस्तर के माध्यम से केंद्रीय रेडियल प्रवाह धारा दीवार क्षेत्र प्रवाह आईएनएस से अलग किया जाता हैस्तंभ आईडीई। इन दोनों क्षेत्रों से प्रवाह के रिश्तेदार भाग ऐसी जुदाई दक्षता या संवेदनशीलता का पता लगाने के रूप में स्तंभ प्रौद्योगिकी के विभिन्न कार्यात्मक पहलुओं का अनुकूलन करने के लिए दबाव प्रबंधन के माध्यम से लगभग किसी भी वांछित अनुपात को अलग किया जा सकता है। संक्षेप में, इस डिजाइन को प्रभावी ढंग से एक संकरा आंतरिक व्यास वाले, बड़े प्रारूप स्तंभ एक 'वर्चुअल' कॉलम के भीतर स्थापित करता है, और स्तंभ बिस्तर विविधता और दीवार प्रभाव 9,10 पर काबू पाने के लिए एक सच्चे दीवार-कम स्तंभ के रूप में इसलिए स्तंभ कार्य करता है।
पीएसएफ स्तंभों का प्रमुख लाभ स्तंभ दक्षता, का पता लगाने के स्रोत (एस) और मल्टिप्लेक्स पता लगाने में सक्षम के लिए विलायक प्रसंस्करण के न्यूनतम में सुधार कर रहे हैं। हालांकि, एक जोड़ा लाभ किसी भी बैंड का पीछा करने और अग्रिम क्षेत्रों समग्र क्षालन से हटा रहे हैं के बाद से क्षालन या पता लगाने में घुला हुआ पदार्थ प्रोफाइल है कि अन्यथा एक ही एस के लिए मनाया जाएगा तुलना में एक उच्च एकाग्रता में मौजूद हैनियोजित विभाजन अनुपात के आधार पर, एक पारंपरिक स्तंभ पर इंजेक्शन और एकाग्रता लोड olute। एक परिणाम के रूप में अक्सर पीएसएफ कॉलम 2 पर आयोजित विभाजन के लिए संकेत तीव्रता में लाभ देखते मनाया जाता है। वास्तव में, विभाजन अनुपात चार बाहर निकलने के बंदरगाहों में से प्रत्येक से प्रवाह से बाहर निकालता है की 25%, अल्ट्रा वायलेट (यूवी) का पता लगाने का उपयोग कर मनाया जाता है कि संकेत तीव्रता एक पारंपरिक का उपयोग करते हुए स्पष्ट रूप में ठीक उसी संकेत तीव्रता व्यावहारिक रूप से पता चलता है कि इस तरह से समायोजित किया जाता है तो मोबाइल चरण के पूरे (100%) 7 का विश्लेषण किया जाता है, जहां स्तंभ। इसके अलावा, केंद्रीय और दीवार प्रवाह क्षेत्रों के बीच आउटलेट अनुपात के ठीक ट्यूनिंग स्तंभ दक्षता अनुकूलित किया जाना अनुमति देता है। (1) प्रवाह की दर, (2) विभाजन अनुपात, और (3) घुला हुआ पदार्थ प्रतिधारण कारक: स्तंभ दक्षता में लाभ इन दक्षता लाभ एक तीन कारकों का कार्य कर रहे हैं के बाद से, एक ही मूल्य के लिए कहा नहीं जा सकता है पिछाड़ी कॉलम का उपयोग कर मनाया । फिर भी, दक्षता में लाभ कनव की तुलनाentional कॉलम लगभग हमेशा मनाया जाता है, और कभी कभी इन लाभ सैद्धांतिक प्लेटों 1,2 की संख्या में 100% से अधिक कर रहे हैं। धुन करने की क्षमता के विभाजन अनुपात विश्लेषक प्रभावी ढंग से 'वर्चुअल' कॉलम के व्यास से तैयार करने की अनुमति देता है, और यह पता लगाने की प्रक्रिया के संबंध में एक महत्वपूर्ण कारक है। विभाजन अनुपात रेडियल केंद्रीय बाहर निकलने के बंदरगाह से eluting मोबाइल चरण का 21% है जब उदाहरण के लिए, एक आभासी 2.1 मिमी आंतरिक व्यास (आईडी) स्तंभ एक भौतिक 4.6 मिमी आईडी स्तंभ से स्थापित है। इन शर्तों के तहत, आभासी 2.1 मिमी आईडी स्तंभ एक प्रवाह की दर पर निर्भर करता है, पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी स्तंभ से अधिक से अधिक 70% अधिक से अधिक हो सकता है कि दक्षता, और घुला हुआ पदार्थ प्रतिधारण कारक 10 के साथ करता है।
मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है कि वर्तमान पीएसएफ स्तंभ डिजाइन एक 4-बंदरगाह फिटिंग आउटलेट को शामिल किया गया है, लेकिन स्तंभ के साथ लगाया जा सकता है एक 2-बंदरगाह अंत ढाले भी, तथापि, यह पता लगाने के लिए टी की सीमाकेवल दो डिटेक्टरों ओ। कि चार डिटेक्टरों मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए दायरा व्यापक बनाने 4 पोर्ट आउटलेट पीएसएफ स्तंभ के लिए एक साथ मिलकर किया जा सकता सिवाय इन स्तंभों के बुनियादी आपरेशन, हालांकि, एक ही है। एक तरफ पूर्व और बाद स्तंभ संयोजी ट्यूबिंग से, केवल अतिरिक्त आवश्यकताओं को एक पीएसएफ स्तंभ परिधीय आउटलेट बंदरगाहों से जोड़ा जा सकता है कि ट्यूबिंग, और प्रत्येक ट्यूब के माध्यम से गुजर मोबाइल चरण की मात्रा को मापा जा सकता है जिसके द्वारा एक साधन है संचालित करने के लिए, आम तौर पर एक बड़े पैमाने पर माप या एक बड़ा माप सकते हैं या तो। ट्यूनिंग की आसानी के लिए, सभी आउटलेट प्रवाह ट्यूबिंग का आंतरिक व्यास ही होना चाहिए। परिधीय और रेडियल केंद्रीय बाहर निकलने के बंदरगाहों के बीच प्रवाह अनुपात तो बस ढाले परिधीय आउटलेट, या रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह पर ट्यूबिंग पद डिटेक्टर की लंबाई पर स्थित ट्यूबिंग की लंबाई को बदलने से, दबाव प्रबंधन के उपयोग के माध्यम से विविध है।
मल्टिप्लेक्स जांच पीएसएफ स्तंभों का उपयोग </stroएनजी>
पीएसएफ स्तंभों का एक महत्वपूर्ण लाभ आउटलेट बाहर निकलने के बंदरगाहों में से प्रत्येक इस प्रकार मल्टिप्लेक्स पता लगाने में सक्षम है, एक का पता लगाने के स्रोत को सीधे जोड़ा जा सकता है। एक अच्छी तरह से डिजाइन प्रणाली का पता लगाने में मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के साथ एक एकल विश्लेषण नमूना भीतर घटकों की प्रकृति के संबंध में पर्याप्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात है, विनाशकारी और गैर विनाशकारी परीक्षण पता लगाने में देरी के बिना, वास्तव में एक ही समय में आयोजित किया जा सकता है। इस घटक यूवी और / या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का पता लगाने के हिमायती 7,11 साथ elute करने के लिए मनाया के साथ DPPH • अभिकर्मक का उपयोग कर उदाहरण के लिए, विरोधी oxidants के लिए, का परम असाइनमेंट की अनुमति देता है। इसलिए, चार स्वतंत्र डिटेक्टरों चार आउटलेट बंदरगाहों में से किसी के माध्यम से प्रत्येक डिटेक्टर के लिए निर्देशित प्रवाह की उचित भागों के साथ एक साथ संचालित किया जा सकता है। इन बंदरगाहों के माध्यम से प्रवाह आसानी से डिटेक्टरों के किसी भी पहुँच रहा घुला हुआ पदार्थ की मात्रा को समायोजित किया जा सकता चूंकि अनुरूप समायोजित किया जा सकता हैदी डिटेक्टर स्रोत की संवेदनशीलता। यह सबसे कुशल घुला हुआ पलायन रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह के माध्यम से मनाया जाता है, तथापि, कि ध्यान दिया जाना चाहिए। परिधीय बंदरगाहों में से प्रत्येक एक बंदरगाह के माध्यम से 25% करने के लिए सेट करते हैं, केवल थोड़ा कम कुशल एक पारंपरिक स्तंभ से है जो बराबर जुदाई दक्षता, प्रदान करते हैं। जैसे, यह मात्रात्मक डिटेक्टर रेडियल केंद्रीय बाहर निकलने के बंदरगाह से नमूना विश्लेषण करने के लिए सेट किया जा है कि महत्वपूर्ण है।
बहुसंकेतन का पता लगाने के उद्देश्य के लिए एक पीएसएफ स्तंभ की स्थापना करते हैं, कुशल और उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को प्राप्त करने के लिए किए जाने की जरूरत है कि विचारों में से एक नंबर रहे हैं; कि एक बंदरगाह के लिए ट्यूब आयाम है, चुनाव डिटेक्टर और प्रवाह समायोजन का एक प्रकार के लिए जो बंदरगाह की।
प्रत्येक बंदरगाह के लिए ट्यूब आयाम
क्रोमैटोग्राफी में पोस्ट स्तंभ ट्यूबिंग की लंबाई जुदाई की दक्षता और प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। बड़े डीईएडिटेक्टर के लिए स्तंभ आउटलेट से लंबे या विस्तृत आईडी ट्यूबिंग का एक परिणाम के रूप में डी-मात्रा दक्षता, संकल्प और संवेदनशीलता का नुकसान में परिणाम होगा। बहुसंकेतन का लाभ प्रदान whilst कुशल जुदाई प्रदान करने में अधिकतम क्षमता प्राप्त करने के लिए पीएसएफ स्तंभ की स्थापना इस प्रकार, जब उचित ट्यूबिंग आयाम उपयोग किया जाना चाहिए।
डिटेक्टर के लिए पोर्ट
चित्रा 2 मल्टिप्लेक्स का पता लगाने (अल्ट्रा वायलेट-दिखाई (यू विज़), मास स्पेक्ट्रोमीटर (एमएस) और 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) का पता लगाने) का एक उदाहरण सेटअप का एक उदाहरण है। उदाहरण केंद्रीय बंदरगाह DPPH • जबकि, एमएस डिटेक्टर से जुड़ा हुआ है और यूवी विज़ डिटेक्टरों परिधीय बंदरगाहों से जुड़े होते हैं दर्शाता है। एमएस तीन के सबसे संवेदनशील डिटेक्टर है के बाद से, केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह से निर्देशित किया गया यह डिटेक्टर के लिए प्रवाह। DPPH • पता लगाने के रूप presenc को चयनात्मक हैएंटीऑक्सीडेंट की ई, और यह डिटेक्टर के लिए प्रवाह, कम से कम संवेदनशील और बैंड विस्तार करने के लिए सबसे सहिष्णु एक परिधीय बंदरगाह से निर्देशित किया गया था। यूवी विज़ एक माध्यमिक 'सामान्य' डिटेक्टर था, इसलिए एक दूसरे परिधीय बंदरगाह से निर्देशित किया गया यह डिटेक्टर के लिए प्रवाह।
प्रवाह समायोजन
उचित ट्यूबिंग डिटेक्टर के लिए एक बंदरगाह से जुड़ी किया गया है, डिटेक्टरों में से प्रत्येक से बाहर निकलने के प्रवाह के लिए आवश्यक राशि को समायोजित किया जा सकता है। प्रत्येक डिटेक्टर से बाहर निकलने के प्रवाह की मात्रा को मापने के लिए एक आसान तरीका है समय का एक दिया अवधि में प्रत्येक बंदरगाह के माध्यम से elutes कि मोबाइल चरण की राशि वजन करने के लिए है। प्रतिशत के प्रवाह को इस प्रकार निर्धारित किया जा सकता है, और प्रवाह अनुपात को छोटा या तदनुसार पसंद का डिटेक्टरों की आवश्यकताओं के अनुरूप डिटेक्टरों पर आउटलेट लाइन से जुड़ी ट्यूबिंग लंबी या तो द्वारा समायोजित किया जा सकता है। विभिन्न डिटेक्टरों के उदाहरण के लिए, प्रवाह सेल, प्रवाह की अलग अलग आवश्यकताओं हैएक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर (FLD) दर सीमित प्रवाह नहीं है, लेकिन देखभाल प्रवाह सेल की अधिक दबाव से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। इसलिए FLD के माध्यम से प्रवाह के नियंत्रण आमतौर पर अन्य डिटेक्टरों भर में दबाव ड्रॉप और प्रवाह के शेष तो FLD से होकर गुजरता है समायोजन करके प्राप्त कर ली है। वितरित किया जाता है कि प्रवाह की मात्रा के प्रति संवेदनशील है कि एक डिटेक्टर एमएस है। आम तौर पर, वर्तमान उच्च अंत मास स्पेक्ट्रोमीटर आसानी से चारों ओर 1 से 1.5 मिलीग्राम / मध्यम जलीय मोबाइल चरण की न्यूनतम प्रक्रिया कर सकते हैं। इस प्रवाह की दर से ऊपर, स्रोत की बाढ़ एमएस निष्क्रिय कर सकता है। हालांकि, ज्यादातर मास स्पेक्ट्रोमीटर में संवेदनशीलता का पता लगाने के निचले प्रवाह दरों का उपयोग करके लाभ हुआ है; इसलिए पीएसएफ प्रवाह बंटवारे क्षमताओं एमएस का पता लगाने से जुड़े अनुप्रयोगों के लिए अत्यंत उपयोगी होते हैं। उच्च स्तंभ बड़ा प्रवाह दरों लेकिन एमएस डिटेक्टर के लिए ले जाया कम मात्रा भार के साथ, उपयोग किया जा सकता है। एमएस डिटेक्टर के लिए प्रवाह की ट्यूनिंग, तथापि, करने से पहले दबाव ड्रॉप का समायोजन करके किया जाना चाहिएएमएस डिटेक्टर, बजाय पद एमएस। दबाव आसानी से अनुचित मृत मात्रा जोड़ने के बिना समायोजित किया जा सकता के रूप में यहाँ, संकीर्ण बोर ट्यूबिंग (0.1 मिमी आईडी) का उपयोग करते हैं, बहुत उपयोगी है।
डिटेक्टर के प्रकार पर विभाजन अनुपात के समायोजन के आधार पर पूर्व या बाद या तो डिटेक्टर किया जा सकता है। ऐसे यूवी विज़ प्रयोग किया जाता है के रूप में एक गैर विनाशकारी डिटेक्टर, प्रवाह प्रतिशत मापा और पोस्ट डिटेक्टर देखते जाएगी। एक भी विनाशकारी डिटेक्टर की स्थापना मल्टीप्लेक्स में प्रयोग किया जाता है, तो प्रवाह प्रतिशत वापस अन्य बंदरगाह प्रवाह प्रतिशत करने के लिए सम्मान के साथ की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है। एक अभिकर्मक आधारित डिटेक्टर ऐसे DPPH • के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, प्रवाह प्रतिशत अभिकर्मक के अलावा बिना पद डिटेक्टर मापा जाता है; दो या दो से अधिक विनाशकारी डिटेक्टरों का इस्तेमाल किया जाता है, तो प्रवाह अनुपात पूर्व डिटेक्टर मापा जाता है। डिटेक्शन अतिरिक्त उपकरण, ऐसे DPPH • पड़ सकता है जो सिस्टम, प्रवाह को बदल सकता है कि अतिरिक्त प्रणाली दबाव होगाप्रतिशत एक बार पहचान प्रणाली से जुड़ी। इसलिए, सावधानी से विचार करने के लिए एक विनाशकारी डिटेक्टर की व्यवस्था के दबाव, प्रवाह प्रतिशत का समायोजन जब पूर्व डिटेक्टर के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। चाहे वे किसी भी बंदरगाहों में से किसी के माध्यम से निर्धारित किया जाता है कि प्रवाह अनुपात की, मात्रात्मक जानकारी उचित मानकीकरण के माध्यम से प्राप्त किया जाना चाहिए। प्रवाह अनुपात निर्धारित कर रहे हैं, हालांकि, वे मजबूत कर रहे हैं, और वे भी ढाल क्षालन शर्तों 7 के तहत बदल नहीं है,
इस पांडुलिपि के साथ विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल पता लगाने के एक मल्टिप्लेक्स मोड में एक पीएसएफ स्तंभ कामकाज का उपयोग करें और धुन के लिए कैसे दिखाने का इरादा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन के लक्षण और मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए एक समानांतर खंडों प्रवाह (पीएसएफ) स्तंभ को रोजगार के साथ HPLC का उपयोग कॉफी की रूपरेखा शामिल है। पीएसएफ स्तंभों का उपयोग मल्टिप्लेक्स एचपीएलसी यह पा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
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