Tuning en parallell segmentert Flow Column og Aktivere Multiplexed Detection

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Aktive Flow Technology Columns

Active flyt teknologi (AFT) kromatografikolonner ble nylig utviklet for å overvinne ineffektivitet i separasjoner forbundet med flyt heterogenitet ^1-6, og også for å muliggjøre multiplexed deteksjon. I denne spesielle kommunikasjonen vi detalj den operative fremgangsmåte for parallell segmentert strømmen (PSF) kolonne med multiplekset deteksjons. De viktigste funksjonelle fordelene med PSF kolonnen er: (1) strømmen fra den radiale midtområdet av kolonnelaget er isolert fra det perifere eller veggområdet av strøm, (2) volumet av mobil fase som må behandles av en deteksjons kilde er redusert, og (3) påvisning kilder kan bli multiplekset for å utvide utvalget informasjon uten instilling forsinkelser deteksjons over hver deteksjonsprosessen, eller etter nødvendiggjør splitting av et innlegg kolonne strømning ^7,8. Det sentrale trekk ved utformingen av PSF kolonnen som gjør det mulig for endvantage av multiplekset deteksjons er det nye uttaket montering og frit montering. Figur 1 er et fotografi av AFT kolonnen sammenlignet med en konvensjonell kolonne. Det er viktig å forstå at kløyving oppnådd ved anvendelse av parallelle segmenterte strømnings kolonner er ikke det samme som post-kolonne strømning splitting. I et innlegg kolonne strømmen splittes hele prøven båndet fra den ledende kanten til endene av halen blir samplet likt (dvs. aksialt), derved, er lik med hensyn til effektivitet og følsomhet hver strømningsstrøm; størrelsen av den følsomhet derved dividert med antall delinger. I PSF imidlertid kløyving prøvene bandet radialt, ikke aksialt. Som sådan, den sentrale port prøvene toppen apex – den mest konsentrerte delen av toppen. Således er den høyeste følsomhet her som toppen ikke er fortynnet med diffuse tailing regionen. Prøven eluering fra de perifere portene er ikke så effektiv som i central sone, men, ettersom båndet blir samplet radialt, i stedet for aksialt, er bredden av toppen smalere enn det som ville være tilfelle for en samplingsprosess som skiller toppen i aksial retning, dvs. en delt post-kolonne. Derav følsomhet med en konsentrasjonsavhengig detektoren ikke er redusert.

I PSF kolonnen, omfatter utløps montering av flere utløpsåpninger, og på innsiden av denne endefestet er det plassert en ringformet frit. Den indre del av dette ringformede kanaler frit strømme ut av søylen via den radiale sentrale utløpsporten, mens den ytre radiale del av utløpskanaler frit strømme ut av kolonnen gjennom det perifere eller veggregioner utlØps-strømningsåpninger. De indre og ytre partier av utløps fritten er atskilt med en ugjennomtrengelig barriere som hindrer cross flow mellom disse strømnings regionene ^2. Som en konsekvens av denne konstruksjon den sentrale radialstrømningsforløp gjennom kolonnelaget er adskilt fra veggområdet strømnings inside kolonnen. Den relative andel av strømningen fra disse to regionene kan varieres på nesten hvilken som helst ønsket forhold ved trykkstyring for å optimalisere ulike funksjonelle aspekter teknologi av kolonne, slik som separasjonseffektiviteten eller deteksjonsfølsomhet. I hovedsak dette designet som etablerer effektivt i større format kolonne et "virtuelt" kolonnen, som har en smalere innvendig diameter, og dermed fungerer kolonnen som en sann vegg mindre kolonnen, overvinne kolonne seng heterogenitet og vegg effekter ^9,10.

De største fordelene med PSF kolonner er forbedringer i kolonne effektivitet, minimering av løsningsmidlet behandling for påvisning kilden (e) og muliggjør multiplekset deteksjons. Det er imidlertid en fordel at siden tailing og fron regionene i alle bånd er fjernet fra den totale elueringsprofilen oppløst stoff ved eluering eller deteksjon er tilstede i en høyere konsentrasjon enn det som ellers ville bli observert for de samme sforankrede injeksjon og konsentrasjonen belastning på en konvensjonell kolonne, avhengig av segmenterforholdet som anvendes. Som en konsekvens er det ofte observeres en gevinst i signalintensitet for separasjoner utført på PSF ^kolonnene 2. Faktisk, hvis segmenter forholdet er justert slik at 25% av strømnings utganger fra hver av de fire utløpsåpninger, signalintensiteten som er observert ved bruk av ultrafiolett (UV) deteksjon viser praktisk talt den samme signalintensiteten som det fremgår ved hjelp av en konvensjonell kolonne hvor hele (100%) av den mobile fase analyseres ^7. Videre finjustering av utløps forholdet mellom de sentrale og veggstrømnings regioner kan effektiviteten av kolonnen som skal optimaliseres. Gevinsten i kolonne effektivitet observert ved anvendelse av AFT kolonner kan ikke angis til en enkelt verdi, siden disse effektivitetsgevinster er en funksjon av tre faktorer: (1) strømningshastigheten, (2) segmenterforhold, og (3) det oppløste retensjonsfaktor . Likevel, effektivitetsgevinster i forhold til conventional kolonner er nesten alltid overholdes, og noen ganger disse gevinstene er mer enn 100% i antall teoretiske plater ^1,2. Evnen til å justere forholdet segmentering kan analytikeren for effektivt å skreddersy diameteren av "virtuell" kolonne, og dette er en viktig faktor i forhold til deteksjonsprosessen. For eksempel er en virtuell 2,1 mm innvendig diameter (id) kolonne etablert fra en fysisk 4,6 mm id kolonne når segmenterforholdet er 21% av mobil fase eluering fra det sentrale radiale utløpsåpningen. Under disse betingelser, utfører den virtuelle 2,1 mm id kolonne med en effektivitet som kan være mer enn 70% større enn den konvensjonelle 2,1 mm id kolonne, avhengig av strømningshastigheten, og oppløst stoff retensjonsfaktor ^10.

Den nåværende PSF kolonne design som brukes for multiplekset deteksjon omfatter en fire-port utløpsfittings, men kan kolonnen være utstyrt med en to-port ende-fitting også begrenser imidlertid dette deteksjons to bare to detektorer. Den grunnleggende drift av disse kolonnene er imidlertid den samme, bortsett fra at fire detektorer kan kobles samtidig til de fire-port utløp PSF kolonne utvide omfanget for multiplekset deteksjon. Bortsett fra pre- og post-kolonne binde rør, er de eneste ytterligere krav for å drive en PSF kolonne rør som kan kobles til de perifere utløpsporter, og en anordning ved hjelp av hvilken mengden av mobil fase passerer gjennom hvert rør kan måles, vanligvis enten en massemåling eller en volumetrisk måling. For enkel justering, bør den innvendige diameter av alle utløpsstrømningsrøret være den samme. Strømningsforholdet mellom det perifere og radiale sentrale utgangsåpningene blir så varieres ved hjelp av trykkstyring, ganske enkelt ved å endre lengden av røret som ligger på den perifere utløps montering, eller lengden av slangen post detektor på den radiale sentrale utløpsporten.

Multiplex Detection Bruke PSF Columns </strong>

En viktig fordel med PSF søyler er at hver av utløpsutgangsåpningene kan kobles direkte til en deteksjonskilde, og dermed gjør multiplekset deteksjons. I en godt designet detection system en enkelt analyse med multiplex deteksjon kan gi betydelig informasjon i forhold til naturen av komponentene i prøven. Viktigere, kan destruktive og ikke-destruktive undersøkelser utføres på nøyaktig samme tid, uten påvisning forsinkelse. Dette tillater den absolutte tildelingen av, for eksempel, anti-oksidanter ved hjelp av DPPH ^• reagens, med komponenter observert å eluere med UV og / eller massespektrometri (MS) deteksjon responser ^7,11. Derfor kan fire uavhengige detektorer brukes samtidig med passende deler av strømmen som ledes til hver detektor via en hvilken som helst av de fire utløpsåpninger. Siden strømningen gjennom disse porter kan lett justeres mengden av oppløst stoff å nå en hvilken som helst av detektorene kan justeres for å passefølsomheten for en gitt kilde-detektor. Det bør imidlertid bemerkes, at den mest effektive oppløste stoffet migrasjon er observert gjennom den radielle sentrale utløpsporten. Hver av de perifere porter har tilsvarende separasjonseffektivitet, som når den er satt til 25% gjennom hver port, er bare litt mindre effektivt enn en konvensjonell kolonne. Som sådan, er det viktig at den kvantitative detektoren innstilles for å analysere prøven fra det sentrale radiale utløpsåpningen.

Ved å sette opp en PSF kolonne i den hensikt å multipleksing deteksjon er det en rekke hensyn som må gjøres for å oppnå en effektiv og høy kvalitet resultater; som er rørdimensjoner for hver port, valg av hvilken port for en type detektor og justering flyt.

Rørdimensjoner for hver port

I kromatografi lengden post kolonne rør av spiller en avgjørende rolle i effektiviteten og ytelsen til separasjon. Stor dead-volum som et resultat av langt eller bredt id slangen fra kolonne utløp til detektoren vil resultere i et tap av effektivitet, oppløsning og følsomhet. Dermed må passende slangedimensjoner benyttes når du setter opp PSF kolonne for å oppnå den maksimale potensial i å tilby effektiv separasjon samtidig gi fordelene av multipleksing.

Port til Detector

Figur 2 er en illustrasjon av et eksempel på oppsett av multiplekset deteksjons (Ultra-Violet Synlig (U-Vis), massespektrometer (MS) og 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ^•) deteksjon). Illustrasjonen viser den sentrale porten er festet til MS-detektor, mens DPPH ^• og UV-Vis-detektorene er koblet til de perifere porter. Siden MS er den mest følsomme detektor av de tre, flyte til denne detektoren var rettet fra den sentrale utløpsporten. Som DPPH ^• påvisning er selektiv til presence av antioksidanter, og den minst følsomme og mest tolerante overfor båndet utvidelse, flyte til denne detektoren ble rettet fra en perifer port. UV-Vis var et sekundært "generisk" detektor, så flyte til denne detektoren ble rettet fra en andre perifer port.

Flow Adjustment

Når den aktuelle produksjonsrøret har blitt koblet fra en havn til detektoren, kan den utgående strømning fra hver av detektorene bli justert til den nødvendige mengde. En enkel måte å måle mengden av strømning som kommer ut fra hver detektor er å veie mengden av mobil fase som elueres gjennom hver port over en gitt tidsperiode. Den prosentvise strømningen kan således bestemmes, og strømforhold kan justeres ved enten å forkorte eller forlenge slangen er festet til utløpsledningen på detektorene tilsvarende for å dekke kravene til detektorene valg. Forskjellige detektorer har forskjellige krav til strømning, for eksempel strømmen av celleer ikke en fluorescens-detektor (FLD) strømningshastighet begrenset, men forsiktighet må utvises for å unngå overtrykk i strømningscellen. Derav kontroll av strømningen gjennom FLD oppnås vanligvis ved å justere trykkfallet over de øvrige detektorer, og resten av strømmen går deretter gjennom den FLD. En detektor som er følsom for strømningsmengden som leveres er MS. Vanligvis kan dagens høye end massespektrometre lett behandle omkring 1 til 1,5 ml / min av moderat vandig mobil fase. Over denne strømningshastighet, kan oversvømmelse av kilden gjør MS ubrukelig. Imidlertid er følsomhet i de fleste massespektrometre dratt nytte av å bruke lavere strømningsrater; derav PSF strømnings splitting evner er svært nyttig for applikasjoner som involverer MS deteksjon. Høy kolonne volumetriske strømningshastigheter kan benyttes, men med lavt volum masse transportert til MS-detektoren. Justering av strømningen til MS detektoren, må imidlertid gjøres ved å justere trykkfallet førMS-detektor i stedet for post MS. Her, er bruken av smale utboring rør (0,1 mm ID) meget nyttig, ettersom trykket lett kan justeres uten å tilsette upassende dødvolum.

Avhengig av typen av detektor justering av segmenterforholdet kan gjøres enten før eller etter detektoren. Hvis en ikke-destruktiv detektor, slik som UV-Vis anvendes, vil strømningen måles i prosent og avstemt etter detektor. Hvis en enkelt destruktiv detektor benyttes i multipleks sette opp strømmen prosenten bestemmes ved beregning tilbake med hensyn til andre port strømnings prosenter. Hvis et reagens basert detektor blir brukt som DPPH ^• blir strømmen målt i prosent stolpe detektoren uten tilsetning av reagenset; og hvis to eller flere destruktive detektorer blir brukt, blir strømningsforholdet blir målt pre-detektor. Detection systemer som kan kreve ytterligere instrumentering, som DPPH ^• vil ha ekstra systemtrykk som kan endre strømningsprosent gang koblet til deteksjonssystemet. Derfor bør nøye overveielse bli utbetalt til systemtrykk på en destruktiv detektor, når du justerer flyt prosent pre-detektor. Uavhengig av strømningsforholdet som er definert ved en hvilken som helst av portene, bør kvantitativ informasjon innhentes gjennom passende standardisering. Når strømforhold er angitt, men de er robuste, og de ​​endrer ikke selv under gradienteluering betingelser ^7,

Den detaljerte video protokollen følger dette manuskriptet er ment å vise hvordan en fungerende PSF kolonne for å bruke og stille inn en multiplekset modus for gjenkjenning.

Protocol

Merk: Denne protokollen inneholder instruksjoner om hvordan du bruker en PSF kolonne på en HPLC system kombinert med flere detektorer for multiplexed deteksjon. Protokollen er skrevet forutsatt at leseren har grunnleggende kunnskap og erfaring i kromatografi og ulike HPLC deteksjonsmetoder. Forsiktig: Se sikkerhetsdatablad (HMS) for alle materialer og reagenser før bruk (dvs. datablad for metanol). Sørg for bruk av alle nødvendige sikkerhetsrutiner ved håndtering av løsemidler…

Representative Results

En multiplekset HPLC-analyse ble utført ved anvendelse av en AFT-kolonne i PSF modus (figur 1) og satt opp som vist i figur 2. Denne typen oppsett tillates en kaffe prøven som skal analyseres samtidig, ved hjelp av UV-Vis, DPPH • og MS i Total Ion Count (TIC) modus. Forbindelsene av kaffe prøven som svarte DPPH • kunne da være lett tilpasses til UV-Vis og MS – TIC responser basert på justeringen av retensjonstiden som illustrert i figur 3,…

Discussion

Denne studien omfatter karakterisering og profilering av kaffe ved bruk av HPLC med multiplekset deteksjon ansette en parallell segmentert flow (PSF) kolonnen. Multiplekset HPLC ved anvendelse av PSF kolonnene gjør det mulig for karakterisering og identifikasjon av viktige kjemiske entiteter ved å redusere data kompleksiteten av prøven samtidig å oppnå en større grad av molekyl-spesifikk informasjon innenfor en brøkdel av den tiden det tar å bruke konvensjonelle multi-deteksjonsprosesser. PSF kolonne gir ikke ba…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels