Ställa in en parallell segmenterat flöde Kolumn och Aktivera Multiplexed Detection

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Aktiva Flow Technology Kolumner

Aktiv flödesteknik (AFT) kromatografikolonner har nyligen utvecklats för att övervinna ineffektivitet i separationer i samband med flödes heterogenitet ^1-6 och även för att möjliggöra multiplex detektion. I denna kommunikation vi detalj operativa processen för parallellsegmenterade flödeskolonn (PSF) med multiplex detektion. De viktigaste funktionella fördelar av PSF kolumnen är: (1) flödet från radiella centrala delarna av kolonnbädden isoleras från det perifera eller väggområde flödes, (2) volymen av mobila fasen som måste behandlas av en detekterings källa minskas, och (3) detekteringskällor kan multiplexeras att utöka prov information utan att ingjuta förseningar detektions över varje identifieringsprocessen, eller senare kräver en uppdelning av en efterkolonn flöde ^7,8. Det viktigaste inslaget i utformningen av PSF-kolonnen som möjliggör endvantage av multiplexerad detektering är den nya utloppsanslutningen och fritta aggregatet. Figur 1 är ett fotografi av AFT-kolonnen jämfört med en konventionell kolonn. Det är viktigt att förstå att klyvningen erhållna med användning av parallella segmenterad flödes kolumner är inte samma sak som efterkolonnflödesströmmen klyvning. I en efterkolonn flöde dela hela provet bandet från framkanten till de yttre delarna av svansen samplas lika (dvs axiellt), vilket är varje flödet lika med avseende på effektivitet och känslighet; omfattningen av känsligheten därigenom dividerat med antalet splittringar. I PSF, dock dela processprover bandet radiellt, inte axiellt. Som sådan, den centrala hamn samplar toppens spets – det mest koncentrerade området av toppeffekten. Således är känsligheten här högsta som toppen inte späds av diffusa tailing regionen. Provet eluerades från de perifera portar är inte lika effektivt som i central zon, men, eftersom bandet samplas radiellt istället för axiellt, är bredden av toppen smalare än vad som skulle vara fallet för en samplingsprocess som delar toppen i den axiella riktningen, det vill säga, en efterkolonn split. Därför känsligheten med en beroende detektor koncentrationen inte minskas.

I PSF kolumnen innefattar utloppsanslutningen flera utgångsöppningar och på insidan av detta ändamål passar det ligger en ringformig frit. Den inre delen av denna ringformiga fritta kanaler strömma ut ur kolonnen via den radiella centrala utloppsporten, medan den yttre radiella delen av utlopps fritta kanalerna strömma ut ur kolonnen via de perifera eller väggområdet utloppsflödesportar. De inre och yttre delarna av utlopps frittan är separerade av en ogenomtränglig barriär som hindrar korsflödet mellan dessa flödesregioner ^2. Som en följd av denna konstruktion den centrala radiella flödesströmmen genom kolonnen bädden separeras från väggområdet flödes inside kolonnen. Den relativa delen av flödet från dessa två regioner kan varieras för att nästan vilket som helst önskat förhållande genom tryckstyrning för att optimera olika funktionella aspekter av kolonnen teknik, såsom separationseffektivitet eller detektionskänslighet. I huvudsak denna design etablerar effektivt inom större format kolumnen en "virtuell" kolumnen, har en smalare inre diameter, och därmed fungerar kolumnen som en riktig vägg mindre kolonn, övervinna kolonnbädden heterogenitet och väggeffekter ^9,10.

De stora fördelarna med PSF kolumner är förbättringar i kolumn effektivitet, minimering av lösningsmedels behandling för att upptäcka källan (s) och möjliggör multiplex detektion. Men det är en extra fördel att eftersom svans och fronting regioner av något band avlägsnas från den totala elueringsprofilen det lösta ämnet vid elueringen eller detektion förekommer i en högre koncentration än vad som annars skulle observeras för samma solute injektion och koncentration belastning på en konventionell kolonn, beroende på segmenteförhållandet användes. Som en konsekvens finns det ofta observeras en vinst i signalstyrka för separationer genomförda på PSF ^kolumn 2. I själva verket, om segmenteförhållandet justeras så att 25% av flödes utträder från var och en av de fyra utgångsportarna, signalintensiteten som observeras med användning av ultraviolett (UV) detektions visar praktiskt taget exakt samma signalintensiteten som framgår användning av en konventionell kolumn där hela (100%) av den mobila fasen analyseras ^7. Dessutom finjustering av utlopps förhållandet mellan de centrala och väggflödesområden gör kolumnen effektivitet optimeras. Vinsterna i kolonneffektivitet observeras med hjälp av AFT kolumner kan inte anges till ett enda värde, eftersom dessa effektivitetsvinster är en funktion av tre faktorer: (1) flödet, (2) segmente förhållandet, och (3) det lösta ämnet retentionsfaktor . Trots effektivitetsvinster jämfört med omventional kolumner nästan alltid iakttas, och ibland dessa vinster är mer än 100% av antalet teoretiska bottnar ^1,2. Förmågan att avstämma segmenteförhållandet tillåter analytikern att effektivt anpassa diametern på "virtuell" kolumnen, och detta är en viktig faktor i samband med upptäckt processen. Till exempel är en virtuell kolonn 2,1 mm innerdiameter (ID) som fastställts ur fysikalisk 4,6 mm ID-kolonn vid segmenteförhållandet är 21% av mobil fas eluerades från den radiella mittutgångsporten. Under dessa betingelser, utför den virtuella 2,1 mm ID-kolonn med en effektivitet som kan vara mer än 70% större än det konventionella id kolonn 2,1 mm, beroende på flödeshastigheten, och löst ämne retentionsfaktor ^10.

Den nuvarande PSF kolumn design som används för multiplexerad detektering innefattar en 4-port utlopps montering, men kolonnen kan vara försedd med en 2-ports ändinpassningen också begränsar emellertid denna detekterings to endast två detektorer. Den grundläggande hanteringen av dessa kolumner är dock densamma, förutom att fyra detektorer kan kopplas samtidigt till 4-portars utlopps PSF kolumnen bredda räckvidden för multiplex detektion. Bortsett från före och efter kolonnen bind slang, att de enda ytterligare krav driva en PSF kolonn slang som kan kopplas till de perifera utloppsöppningarna, och ett organ med vilket mängden av mobila fasen passerar genom varje rör kan mätas, typiskt antingen en massa mätningar eller en volymmätning. För att underlätta trimning, bör den inre diametern hos alla utloppsflödes slangar vara samma. Den flödesförhållande mellan det perifera och radiella centralutloppsöppningar sedan varieras genom användning av tryckförvaltnings, helt enkelt genom att ändra längden på slangen belägen på den perifera utloppskopplingen, eller rörlängden inlägget detektorn på den radiella mittutloppsöppningen.

Multiplexad Detection Använda PSF Kolumner </strong>

En viktig fördel med PSF kolumner är att var och en av utloppsutloppsportarna kan anslutas direkt till en detekteringskälla, vilket möjliggör multiplexerad detektering. I en väl utformad detektionssystem en enda analys med multiplex detektion kan ge omfattande information när det gäller vilken typ av komponenter i provet. Viktigt kan destruktiva och oförstörande provning utföras på exakt samma tid, utan dröjsmål upptäckt. Detta gör den absoluta tilldelning av, till exempel, antioxidanter med hjälp av DPPH ^• reagens, med komponenter observer eluera med UV- och / eller masspektrometri (MS) detekterings svar ^7,11. Därför kan fyra oberoende detektorer drivas samtidigt med lämpliga delar av flödet till varje detektor via någon av de fyra utloppsportar. Eftersom flödet genom dessa portar kan enkelt justeras mängden löst ämne når någon av detektorerna kan justeras för att passakänsligheten hos den givna detektorkällan. Det bör dock noteras, att det mest effektiva lösta ämnet migrering observeras genom den radiella mittutloppsöppningen. Var och en av de perifera hamnarna erbjuder motsvarande avskiljningsgrad, som när den satt till 25% genom varje port är endast något mindre effektiv än en konventionell kolonn. Som sådan, är det viktigt att den kvantitativa detektorn ställas in för att analysera prov från den radiella mittutgångsporten.

När du ställer in en PSF kolumn i syfte att multiplexering upptäckt finns ett antal överväganden som måste göras för att uppnå effektiva och höga resultat kvalitet; som är rördimensioner för varje port, val av vilken port för en typ av detektor och justering flöde.

Rördimensioner för varje hamn

I kromatografi längden på efterkolonnslangen spelar en avgörande roll i effektivitet och prestanda hos separationen. Stor dead-volym som en följd av lång eller bred id slang från kolumn utlopp till detektorn kommer att resultera i en förlust av effektivitet, upplösning och känslighet. Därför måste lämpliga slangdimensioner användas när du ställer in PSF kolumnen för att uppnå den maximala potential att ge effektiv separation samtidigt som fördelarna med multiplexering.

Hamnen till Detector

Figur 2 är en illustration av ett exempel installationen av multiplex detektion (Ultra Violet-Synlig (U-Vis), masspektrometer (MS) och 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ^•) detektion). Illustrationen visar den centrala porten är fäst till MS-detektor, medan DPPH ^• och UV-Vis-detektorer är fastade till de perifera portar. Eftersom MS är den känsligaste detektorn enligt tre, flöde till denna detektor riktades från den centrala utloppsöppningen. Som DPPH ^• upptäckt är selektiv till presence av antioxidanter, och den minst känsliga och mest toleranta till bandbreddning, strömma till denna detektor riktades från en perifer hamn. UV-Vis var en sekundär "generisk" detektor, så strömmar till denna detektor leddes från en andra perifer port.

Flödesjusterings

När lämplig slangen har fästs från en hamn till detektor, kan den utgående flödet från var och en av detektorerna justeras till den erforderliga mängden. Ett enkelt sätt att mäta mängden av flödet ut från varje detektor är att väga den mängd mobila fasen som eluerar genom varje port under en given tidsperiod. Den procentuella flödet kan sålunda bestämmas, och flödesförhållanden kan justeras genom antingen förkortning eller förlängning av slangen ansluten till utloppsledningen på detektorerna i enlighet därmed för att passa kraven i detektorerna av valet. Olika detektorer har olika krav på flöde, exempelvis flödescellen fluorescensdetektor (FLD) inte flödeshastighet begränsad, men man måste vara försiktig för att undvika övertryck av flödescellen. Därav styrning av flödet genom FLD uppnås vanligtvis genom justering av tryckfallet över de andra detektorerna och återstoden av flödet passerar sedan genom den FLD. En detektor som är känslig för den mängd flöde som avges är MS. Generellt kan nuvarande high end masspektrometrar lätt bearbeta ca 1 till 1,5 ml / min av måttligt vatten rörlig fas. Ovanför detta flöde kan översvämning av källan gör MS obrukbara. Dock är detektionskänsligheten i de flesta masspektrometrar gynnats genom användning av lägre flödeshastigheter; Därav PSF flödesdelning kapacitet är mycket användbart för applikationer med MS-detektion. Hög kolonn volymetriska flödeshastigheter kan utnyttjas, men med låg volym laster transporteras till MS-detektor. Tuning av flödet till MS-detektorn måste emellertid göras genom att justera tryckfallet föreMS-detektor, i stället för post MS. Här, är användningen av smala innerdiameter (0,1 mm ID) mycket användbar, eftersom trycket kan lätt regleras utan att lägga till olämpligt dödvolym.

Beroende på vilken typ av detektor justeringen av segmenteförhållandet kan göras antingen före eller efter detektor. Om en icke-förstörande detektor, såsom UV-Vis användes, skulle den procentuella flödet mätas och avstämmas efterdetektor. Om en enda destruktiv detektor används i multiplex ställa in procentflödet bestäms genom tillbaka räkna med avseende på andra procentsatser port flöde. Om en reagens baserad detektor användas, såsom DPPH ^•, är den procentuella flödet mätt efter detektor utan tillsats av reagens; och om två eller flera destruktiva detektorer används, då flödesförhållandet mäts för-detektor. Detection system som kan kräva ytterligare instrumentering, såsom DPPH ^•, kommer att ha extra systemtryck som kan ändra flödetprocentsats gång ansluten till detekteringssystemet. Därför bör noggrann hänsyn tas till systemtrycket av en destruktiv detektor, när du justerar flödes procentuella pre-detektor. Oberoende av flödesförhållandet som ställs genom någon av portarna, bör kvantitativa information erhållas genom lämplig standardisering. När flödeskvoter är inställda, men de är robusta, och att de inte förändras ens under gradienteluering förhållanden ^7,

Den detaljerade video protokollet åtföljer detta manuskript är avsett att visa hur man kan använda och ställa in en PSF kolonn fungerar i en multiplexering för upptäckt.

Protocol

Obs: Detta protokoll innehåller instruktioner om hur du använder en PSF kolumnen ett HPLC-system i kombination med flera detektorer för multiplex detektion. Protokollet har skrivits förutsatt att läsaren har grundläggande kunskaper och erfarenhet av kromatografi och olika HPLC detektionsmetoder. Varning: Se säkerhetsdatablad (SDB) för alla material och reagenser före användning (dvs. säkerhetsdatablad för metanol). Se till att använda alla lämpliga säkerhetsrutiner vi…

Representative Results

En multiplexerad HPLC-analys utfördes med hjälp av en AFT kolumn i PSF läge (Figur 1) och ställ in som visas i figur 2. Denna typ av installation får en kaffe prov som skall analyseras samtidigt med användning av UV-Vis, DPPH • och MS i Total Ion Count (TIC) läget. Föreningarna kaffe provet som svarade på DPPH • kunde sedan lätt matchas upp till UV-Vis och MS – TIC svar baserade på anpassningen av retentionstid som visas i figur <str…

Discussion

Denna studie innebär karakterisering och profilering av kaffe med användning av HPLC med multiplex detektion som utnyttjar en parallell kolonn segmenterat flöde (PSF). Multiplexad HPLC med användning av PSF kolumner möjliggör karakterisering och identifiering av de viktigaste kemiska enheter genom att minska datakomplexitet av provet samtidigt få en högre grad av molekyl-specifik information inom en bråkdel av den tid det tar med hjälp av konventionella flerdetekteringsprocesser. PSF kolumnen medger inte bara …

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels