التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

Summary

المقدمة هنا هو وصف موحد من التقنيات التي يمكن استخدامها لتطوير وتحويل وإدارة، واختبار بروتين تعبير مغاير للخميرة الخباز بروبيوتيك boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

الكائنات الحية الدقيقة بروبيوتيك وسيلة للفضول المحتملة للبكفاءة واقتصاديا تقديم البروتينات مغاير إلى الجهاز الهضمي. هذه الكائنات قادرة على قيد الحياة المرور عبر الجهاز الهضمي بعد لا استعمار ^{النتيجة} 1، مما الجرعات التي تسيطر عليها والحد من التعرض للدواء أعربت. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على مهندس بسهولة هذه الكائنات لإنتاج البروتين مغاير على نطاق واسع يجعل لهم بديل اقتصادي لجزيئات تسليم الاصطناعية. ومع ذلك، وضع مثل هذا النهج، كما ثبت مؤخرا باستخدام سلالة العوز الغذائي في خميرة بروبيوتيك boulardii ^2، يتطلب معرفة التقنيات المخبرية لا جنبا إلى جنب تقليديا ضمن دراسة معينة، بدءا من الخميرة وعلم الأحياء الجزيئي لتقنيات التعامل مع الحيوانات وأساليب المناعية. وهكذا على الرغم من أن الإجراءات الفردية صفها هنا ليست في حد ذاتها جديدةبروتوكولات المختبر، والهدف من هذا المخطوط هو تقديم مقدمة موحد لالتقنيات اللازمة للاختبار التجريبي من الخميرة بروبيوتيك بوصفها وسائل إيصال المخدرات إلى الجهاز الهضمي الفئران. تقدم هو عبارة عن تجميع من بروتوكولات أساسية ل: 1) توليد سلالات متحولة بعامل نمائي من الخميرة التي يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا. 2) التحول من الثقافات الخميرة للتعبير عن بروتين مغاير. 3) إدارة الخميرة المؤتلف إلى الأمعاء من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم. و4) استعادة قابلة للحياة الخميرة بروبيوتيك المؤتلف من الأمعاء الفئران وتقييم بروتين تعبير مغاير لها.

أولا، على الرغم من أن العديد من الأساليب الإيجابية والسلبية اختيار جود للتلاعب أنواع من الخميرة، واختيار السلبية مثل من خلال استخدام علامات بعامل نمائي يزيد كلا من الكفاءة والسهولة التي الخميرة يمكن أن تتحول ومختارة. اختيار الإيجابية للtransformants باستخدام المضادات الحيوية، بالتعاونntrast، ويزيد بشكل كبير من تكلفة الخميرة التلاعب. وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار من الخميرة على وسائل الاعلام الصلبة التي تحتوي على المضادات الحيوية تسمح لزيادة نمو المستعمرات الخلفية هو دون تغيير النسبية لاختيار من الخميرة بعامل نمائي على انخفاض الاصطناعية من وسائل الاعلام الصلبة (الملاحظات غير منشورة). الخميرة العوز الغذائي لسلالات التي تفتقر إلى الانزيمات الهامة لتركيب الأحماض الأمينية الأساسية أو اليوراسيل. هذه الخميرة يمكن أن تنمو إلا إذا استكملت مع الأيض في عداد المفقودين أو الجينات الأيض، مما يمكن اختيار السلبية عند مطلي الخميرة على انخفاض الاصطناعية من وسائل الإعلام التي تفتقر إلى التمثيل الأيضي الأساسي. العديد من خميرة تستخدم عادة سلالات مختبر الخباز هي في الواقع بالفعل طفرات العوز الغذائي ^3. الصناعية والسريرية، وسلالات الخميرة بروبيوتيك، ومع ذلك، وعادة ما تكون بدئية الاغتذاء مع القدرة على تجميع كل العناصر الغذائية اللازمة. لتمكين التلاعب الجيني أكثر كفاءة هذه الخميرة، الجينات بعامل نمائي يمكن استهداف انتقائيلتوليد سلالات التي يمكن اختيارها دون المضادات الحيوية. استهداف معين من الجينات علامة بعامل نمائي يمكن أن يتحقق من خلال تعطيل الجينات بوساطة PCR-الاعتماد على إعادة التركيب مثلي أو أكثر في الآونة الأخيرة من خلال كريسبر / Cas9 تستهدف ^4-6. بدلا من ذلك، يمكن أن الطفرات الأشعة فوق البنفسجية تولد بسرعة طفرات العوز الغذائي حتى في سلالات الخميرة التي تحول مع البلازميدات متعددة يصعب من الناحية الفنية ^7. في حين وصفت PCR استهداف وكريسبر / Cas9 على نطاق واسع في أماكن أخرى، قدم في جزء واحد من هذا المخطوط هو بروتوكول مفصلة وصف نهج الطفرات الأشعة فوق البنفسجية لخلق سلالات بعامل نمائي من شأنها أن تسمح لاختيار السلبية بدلا من اختيار المضادات الحيوية الإيجابية من transformants الخميرة.

الخطوة الضرورية التالية في استخدام هذه السلالات بعامل نمائي للتسليم عن طريق الفم من بروتين مغاير هي خميرة التحول مع البلازميد. منذ التحول الناجح الأول من عمريspheroplasts ر ذكرت لخميرة الخباز في عام 1978 ^8، تم التعرف على العديد من التعديلات لزيادة الكفاءة والسهولة التي أنواع من الخميرة يمكن تعديلها وراثيا. استخدام Electroporation للللتحول الناجح من الحمض النووي في س. ووصف الخباز لأول مرة في عام 1985 ^{(9) ومنذ} ذلك الحين تم تحسينها من خلال إضافة حضانة 1 M السوربيتول إلى خلايا الدعم osmotically ^10. وقد تبين كفاءة Electroporation للوعلاوة على ذلك تعتمد على أنواع من الخميرة والتوتر، عدد الخلايا ومرحلة النمو، وحجم Electroporation لل، والقوة الميدانية، ومخازن محددة ^11. الليثيوم خلات (LiOAc) التحول، ووصف في الأصل من قبل إيتو وآخرون ^12، من بين بروتوكولات التحول الأكثر شيوعا كما أنه لا يتطلب أي معدات خاصة. وأظهرت التحليلات الإضافية أن كفاءة LiOAc التحول الخميرة يزيد كثيرا عندما يتم جمع الخلايا في منتصف سجل مرحلةالنمو والحرارة صدمة في وجود البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والحمض النووي في 42 ° ^C 12. حضانة من الخميرة سليمة كاملة مع PEG أمر ضروري للتحول كفاءة، ربما من خلال تحسين مرفق من الحمض النووي لغشاء الخلية وكذلك عن طريق التأثيرات الأخرى على الغشاء ^13. كما الليثيوم نفسه يزيد من نفاذية خلايا سليمة ^(14). على الرغم من أن معظم المختبرات س. يمكن بسهولة سلالات الخباز أن تتحول باستخدام LiOAc التحول ^3، أنواع الخميرة الأخرى قد تحولت بشكل أكثر كفاءة باستخدام بروتوكولات بديلة. Pichia pastoris، على سبيل المثال، هو الأكثر حولت بكفاءة عن طريق Electroporation للبدلا من LiOAc تحول ^13. ومن الأهمية بمكان، بالتالي، لاختبار متعددة طرق التحول ولتحسين فترات الحضانة وتركيزات كاشف عند محاولة تعديل وراثيا سلالة الخميرة uncharacterized. وبالتالي هذا المخطوط يصف كل من LiOAc آرansformation و electroporation عن تقنيات لتحويل متحولة العوز الغذائي والنوع البري س. boulardii. وتوجه القراء المهتمين إلى الاستعراضات التي جرت مؤخرا لتوصيف دقيق لتطور خميرة التحول، بروتوكولات بديلة، وإجراء المزيد من المناقشات آليات العمل الممكنة ^13،15. التحول من الخميرة مع ترميز البلازميد بروتين كشفها بسهولة ضروري علاوة على ذلك لاختبار المصب من أجل ضمان التعبير السليم وظيفة البروتين مغاير. يمكن اختيار البروتينات المختلفة لا تعد ولا تحصى تبعا للغرض النهائي للدراسة العلاجية والأجسام المضادة المتاحة للكشف عن البروتين immunoblotting، ELISA، وغيرها من التقنيات. بروتوكولات لهذه التقنيات قد تم وصفها بدقة في أي مكان آخر ^16،17، ويمكن استخدامها لتحديد مستويات الإنتاج البروتين مغاير من الخميرة تتحول بالمقارنة مع منحنيات القياسية. لأغراض التظاهر ولاظهارإنتاج الناجح لبروتين يستخدم جدا عادة في الأحياء الخميرة، تقدم هذه المخطوطة التحول مع البروتين ترميز البلازميد فلوري الأخضر (GFP)، والذي يسمح للكشف لاحقا باستخدام المجهر مضان.

نفس القدر من الأهمية لإنتاج الكائنات الحية بروبيوتيك التي تعبر عن بروتين مغاير هو الإدارة السليمة والكشف عن هذه الكائنات الدقيقة داخل أنسجة الجهاز الهضمي، كما هو موضح في الأجزاء الثلاثة والأربعة. إدارة الخميرة المؤتلف من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم تسمح لتوريد كميات رقابة من الخميرة مباشرة إلى المعدة، والتي من C57BL / 6 الفئران غير قادرين على التقيؤ ¹⁸ بشكل طبيعي. ومع ذلك، غير لائق التعامل مع الحيوانات وأنبوب تغذية يمكن أن يؤدي إلى تلف المريء وثقب، انثقاب المعدة، وإدارة القصبة الهوائية، والالتهاب الرئوي التنفسي ^19،20. تقنية الفقراء والخبرة يمكن أن تزيد علاوة على ذلك التباين في الاستجابات المناعية الفئران ودورة الفتشوب التجريبيةLTS، التي نسبت إلى إجهاد الحيوان على أنبوب تغذية عن طريق الفم ^21،22. الممارسة في الأسلوب السليم يمكن أن يخفف بالتالي ليس فقط عدم الراحة الحيوان، ولكن يمكن أيضا زيادة دقة النتائج التجريبية. توضح هذه المخطوطة وتوضح التعامل مع الحيوانات وأنبوب تغذية عن طريق الفم لإعطاء جرعات تسيطر عليها من الخميرة المؤتلف.

وأخيرا، من المهم جدا لتأكيد التسليم الناجح الخميرة المؤتلف من خلال تحليل الأنسجة اللمفاوية وجود الخميرة والبروتينات مغاير. الأنسجة المناعية الجهاز الهضمي التي يمكن أن معظم بسهولة ومتوقع أن تدرس لوجود الخميرة هي البقع باير ل. بقع باير هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية على طول الأمعاء الدقيقة التي هي المواقع الرئيسية من الاستجابة المناعية المخاطية تحريض ^23. يتم نقل مولدات المضادات من التجويف transcellularly من خلال microfold (M) الخلايا في البشرة ويتم إطلاقها في البقع باير، وبالتالي فضح أرفقد مستضد الخلايا المعوية محتويات اللمعية. على الرغم من امتصاص الجسيمات عبر الظهارة المعوية يمكن أيضا أن يتحقق من الخلايا الكأسية، وقد ثبت أن هذه الخلايا أن تأخذ فقط حتى الجسيمات أقل من 0.02 ميكرون في القطر ^24. تمديد التشعبات بطريق الظهارة من CD103 ⁺ الخلايا الجذعية (DC) أيضا تناول جزيئات صغيرة من الأمعاء التجويف ^25. ومع ذلك، هناك حاليا أي تقارير التي تبين أن CD103 ⁺ البلدان النامية يستغرق جزيئات أكبر من البكتيريا. وهكذا، الخميرة بروبيوتيك سليمة، من الحجم المتوسط ​​بين 3-6 ميكرون في القطر، من المرجح أن يتم تناولها من قبل الخلايا M وتحويلها إلى بقع على باير ل. وصفت هنا هو بروتوكول لجمع وفحص بقع باير لالخميرة المؤتلف قابلة للحياة، على الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أيضا أن تتكيف بسهولة لتقييم امتصاص البكتيريا بروبيوتيك.

وباختصار، تقييم الخميرة بروبيوتيك المؤتلف للتسليمالبروتينات rapeutic إلى الأمعاء تتطلب إجادة في التقنيات المخبرية التي تمتد البيولوجيا الجزيئية إلى التعامل مع الحيوان وعلم المناعة. المقدمة هنا هي بروتوكولات ل1) توليد وفحص سلالات الخميرة بعامل نمائي والتي يمكن بسهولة اختيار سلبا بدون المضادات الحيوية، 2) بروتوكولات بديلة لتحويل الخميرة ويمكن التعبير عن بروتين مغاير، 3) مظاهرات تقنيات التعامل مع الحيوانات السليمة وأنبوب تغذية عن طريق الفم ل تسليم المعدي من الخميرة المؤتلف، و4) بروتوكولات لتشريح التصحيح باير والكشف عن الخميرة المؤتلف قابلة للحياة والبروتين مغاير وظيفية. جنبا إلى جنب، وهذه البروتوكولات يسمح لتوليد واختبار الخميرة سلالة الكائنات الحية المجهرية قادرة على تقديم البروتين العلاجي مغاير إلى الجهاز الهضمي.

Protocol

1. الأشعة فوق البنفسجية الطفرات لتوليد العوز الغذائي سلالات الخميرة توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الجرعات المطلوبة من الأشعة فوق البنفسجية إعداد YPD (خلاصة…

Representative Results

جيل من منحنى البقاء على قيد الحياة بعد اشعة فوق البنفسجية يتطلب الطلاء من خلايا الخميرة المخفف بحيث مستعمرة مميزة (كفو) قادرة على تشكيل. كل عينة 500 ميكرولتر التي تم جمعها على النحو المبين أعلاه يحتوي على حوالي 5 × 10 6 خلايا. ومع ذلك، أكثر من 100 الم?…

Discussion

معا، وبروتوكولات تصف الوثيقة الخطوات الأساسية اللازمة لتطوير واختبار بعامل نمائي سلالات الخميرة بروبيوتيك للتسليم من البروتين العلاجي مغاير إلى الأمعاء. هذا التلاعب واختبار الخميرة بروبيوتيك المؤتلف يتطلب تقنيات والموارد التي أي مختبر الفردية حاليا قد لا تكون مأ…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053