Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Summary

Se presenta aquí una descripción unificada de las técnicas que se pueden utilizar para desarrollar, transformar, administrar y poner a prueba la expresión de proteínas heterólogas de la levadura probiótica Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Los microorganismos probióticos son un medio potenciales interesantes de la entrega de manera eficiente y económica proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal. Estos organismos son capaces de sobrevivir el paso a través del tracto gastrointestinal sin embargo no colonizarlo ^1, lo que permite la dosificación controlada y limitar la exposición a la droga expresó. Además, la capacidad de diseñar fácilmente estos organismos para producir la proteína heteróloga a gran escala las hace una alternativa económica a las partículas de entrega sintéticos. Sin embargo, el desarrollo de un enfoque de este tipo, como se ha demostrado recientemente el uso de una cepa auxotrófica de la levadura Saccharomyces probióticas boulardii ^2, requiere el conocimiento de las técnicas de laboratorio sin combinar tradicionalmente en un estudio dado, que van desde la levadura y la biología molecular de las técnicas de manipulación de los animales y métodos inmunológicos. Así, aunque los procedimientos individuales descritos en este documento no son en sí mismos novelaprotocolos de laboratorio, el objetivo de este manuscrito es presentar una introducción a las técnicas unificada necesarios para las pruebas experimentales de la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos en el tracto gastrointestinal murino. Proporcionada es una compilación de los protocolos esenciales para: 1) la generación de cepas mutantes auxotróficos de levadura que pueden ser fácilmente manipulados genéticamente; 2) la transformación de cultivos de levaduras para expresar la proteína heteróloga; 3) la administración de levadura recombinante al intestino a través de una sonda nasogástrica; y 4) la recuperación de la levadura recombinante probiótico viable desde el intestino murino y evaluación de su expresión de la proteína heteróloga.

En primer lugar, si bien existen numerosos métodos de selección positivos y negativos para la manipulación de especies de levadura, selección negativa tal como mediante el uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto la eficiencia y la facilidad con la que la levadura puede ser transformada y seleccionado. La selección positiva de los transformantes usando antibióticos, en contrast, aumenta significativamente el coste de la manipulación de la levadura. Por otra parte, la selección de la levadura en medio sólido que contiene los antibióticos puede permitir un mayor crecimiento de las colonias transformadas fondo relativos a la selección de la levadura auxotrófico en caída sintética a cabo los medios sólidos (observaciones no publicadas). levadura auxotrófico es cepas que carecen de enzimas críticas para la síntesis de los aminoácidos esenciales o uracilo. Tal levadura puede crecer solamente si se complementa con el metabolito falta o genes metabólicos, lo que permite que la selección negativa cuando la levadura se cultivó en placas sobre gota sintética a cabo los medios de comunicación que carece del metabolito esencial. Muchos Saccharomyces comúnmente usados ​​son cepas de laboratorio cerevisiae, de hecho, ya mutantes auxotróficos ^3. Industrial, clínica, y las cepas de levadura probióticas, sin embargo, son típicamente prototrophic con la capacidad de sintetizar todos los nutrientes requeridos. Para permitir la manipulación genética más eficiente de tal levadura, genes auxotróficos pueden ser dirigidos selectivamentepara generar cepas que se pueden seleccionar sin antibióticos. La orientación específica de los genes marcadores auxotróficos se puede lograr a través de la interrupción de genes mediada por PCR basándose en la recombinación homóloga o más recientemente a través de CRISPR / Cas9 orientación ^4-6. Como alternativa, la mutagénesis UV puede generar rápidamente los mutantes auxotróficos incluso en cepas de levadura para las que la transformación con múltiples plásmidos es técnicamente difícil ^7. Si bien la orientación CRISPR PCR y / Cas9 han sido ampliamente descritos en otras partes, presentado en la primera parte de este manuscrito es un protocolo detallado que describe un enfoque de mutagénesis UV para crear cepas auxotróficas que permitan la selección negativa en lugar de los antibióticos de selección positiva de los transformantes de levadura.

El siguiente paso necesario en el uso de tales cepas auxotróficas para la administración oral de la proteína heteróloga es la transformación de levadura con ADN de plásmido. Desde la primera transformación con éxito de síest esferoplastos reportados para Saccharomyces cerevisiae en 1978 ^8, numerosas modificaciones se han caracterizado para aumentar la eficiencia y la facilidad con la que las especies de levadura se pueden modificar genéticamente. El uso de electroporación para la transformación exitosa de ADN en S. cerevisiae fue descrita por primera vez en 1985 ⁹ y desde entonces ha sido mejorada mediante la adición de incubación de 1 M de sorbitol al ¹⁰ osmóticamente células de apoyo. Eficiencia electroporación Además, se ha demostrado que dependen de la especie de levadura y cepa, el número de células y la fase de crecimiento, el volumen de la electroporación, la intensidad de campo, y tampones específicos ^11. La transformación de litio de etilo (LiOAc), originalmente descrita por Ito et al. ^12, es uno de los protocolos de transformación más comúnmente utilizados, ya que no requiere ningún equipo especial. Análisis adicionales mostraron que la eficiencia de transformación de levadura LiOAc aumenta en gran medida cuando las células se recogen en fase semilogarítmicade crecimiento y se sorprendió de calor en presencia de polietilenglicol (PEG) y el ADN a 42 ° C ^12. La incubación de la levadura intacta entera con PEG es esencial para la transformación eficiente, posiblemente a través de la mejora de la unión de ADN a la membrana celular, así como a través de otros efectos sobre la membrana ^13. Sí litio también aumenta la permeabilidad de las células intactas ^14. Aunque la mayor parte de laboratorio S. cepas cerevisiae pueden ser fácilmente transformado mediante LiOAc transformación ^3, otras especies de levaduras pueden ser transformadas de manera más eficiente a través de protocolos alternativos. Pichia pastoris, por ejemplo, es más eficiente transformado a través de la electroporación en lugar de transformación LiOAc ^13. Es crucial, por lo tanto, para probar múltiples métodos de transformación y para optimizar los periodos de incubación y las concentraciones de reactivos cuando se trata de modificar genéticamente una cepa de levadura sin caracterizar. Por tanto, este manuscrito describe tanto LiOAc transformation y electroporación como técnicas para la transformación del mutante auxotrófico y de tipo salvaje S. boulardii. Los lectores interesados ​​pueden dirigirse a las recientes revisiones para descripciones exhaustivas de la evolución de la transformación de levadura, protocolos alternativos, y más discusiones de posibles mecanismos de acción ^13,15. Transformación de levadura con el plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable es, además, esencial para las pruebas de aguas abajo con el fin de asegurar la expresión y función de la proteína heteróloga adecuada. proteínas Myriad diferentes pueden seleccionarse en función del objetivo final del estudio terapéutico y los anticuerpos disponibles para la detección de proteínas por inmunotransferencia, ELISA, y otras técnicas. Los protocolos para estas técnicas se han descrito a fondo en otra parte ^16,17, y se pueden utilizar para determinar los niveles de producción de proteínas heterólogas a partir de levadura transformada por comparación con las curvas de calibración. Para los propósitos de demostración y para mostrarproducción exitosa de una proteína muy utilizado comúnmente en la biología de la levadura, este manuscrito presenta transformación con plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), que permite la posterior detección mediante microscopía de fluorescencia.

Igualmente importante para la producción de organismos probióticos que expresan la proteína heteróloga es la adecuada administración y detección de estos microorganismos dentro de los tejidos gastrointestinales, como se describe en partes tres y cuatro. La administración de levadura recombinante a través de una sonda oral permite la entrega de cantidades controladas de levadura directamente en el estómago, de la que C57BL / 6 ratones son naturalmente incapaz de vómitos ^18. Sin embargo, el manejo de animales inadecuada y alimentación forzada puede conducir a daño esofágico y perforación, perforación gástrica, administración traqueal, y neumonía por aspiración ^19,20. Una técnica deficiente y la falta de experiencia, además, pueden aumentar la variabilidad en la respuesta inmune murina experimental y results, que han sido atribuidos a estrés de los animales sobre una sonda oral ^21,22. La práctica en la técnica apropiada de este modo no sólo puede atenuar las molestias animal, pero también puede aumentar la precisión de los resultados experimentales. Este manuscrito describe y demuestra la manipulación de animales y una sonda nasogástrica para la administración de dosis controladas de levadura recombinante.

Por último, es vital para confirmar la entrega exitosa de levadura recombinante mediante el análisis de tejidos linfoides para la presencia de la levadura y la proteína heteróloga. Los tejidos inmunes gastrointestinales que pueden más fácilmente y de manera previsible ser examinados para la presencia de la levadura son las placas de Peyer. Placas de Peyer son órganos linfoides secundarios a lo largo del intestino delgado que son sitios clave de la mucosa inducción respuesta inmune ^23. Antígenos de los lumen se transfieren transcelular a través de micropliegues células (M) en el epitelio y se liberan en las placas de Peyer, exponiendo así encerrard antígeno de células presentadoras de contenido luminal intestinal. Aunque la absorción de partículas a través del epitelio intestinal también se puede lograr por las células caliciformes, estas células se ha demostrado que sólo ocupan partículas de menos de 0,02 m de diámetro ^24. Dendritas transepiteliales extendieron a partir de células dendríticas CD103 ⁺ (DC) también ocupan pequeñas partículas desde el lumen intestinal ^25; Sin embargo, actualmente no existen informes que demuestran que CD103 ⁺ DC ocupan las partículas más grandes que las bacterias. Por lo tanto, la levadura probiótica intacto, de tamaño medio de entre 3 a 6 m de diámetro, son más propensos a ser absorbidos por las células M y se transfirió a las placas de Peyer. Descrito aquí es un protocolo de recogida y selección de las placas de Peyer para levadura recombinante viable, aunque este procedimiento también se puede adaptar fácilmente para la evaluación de la absorción de bacterias probióticas.

En resumen, la evaluación de la levadura recombinante probiótico para la entrega de larapeutic proteínas en el intestino requiere el dominio de las técnicas de laboratorio que abarcan la biología molecular para el manejo de animales e inmunología. Aquí se presentan son los protocolos para 1) la generación y selección de cepas de levadura auxotróficos que puede ser fácilmente seleccionado negativamente sin antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar la levadura y permiten la expresión de la proteína heteróloga, 3) demostraciones de técnicas de manejo de animales adecuados y sonda oral durante intragástrico la entrega de la levadura recombinante, y 4) protocolos para la disección de las placas de Peyer y la detección de levadura recombinante viable y funcional proteína heteróloga. Combinados, estos protocolos permitirán la generación y prueba de una cepa de levadura probiótico capaz de entregar proteína terapéutica heterólogo en el tracto gastrointestinal.

Protocol

1. Mutagénesis UV para generar cepas de levadura auxotroficos Generar curvas de supervivencia para determinar las dosis necesarias de la irradiación UV Preparar YPD (extracto de levadura de peptona dextrosa) medios de comunicación y otros reactivos enumerados en la Tabla 1 de acuerdo con procedimientos estándar 26 e inocular colonias individuales en 5 a 10 ml de medio YPD. Incubar culturas en un tambor de rodillo a 30 ° CO / N a la saturación por lo …

Representative Results

Generación de una curva de supervivencia después de la irradiación UV requiere placas de células de levadura diluidas de tal manera que unidades formadoras de colonias (CFU) distintos son capaces de formar. Cada muestra de 500 l recogida como se ha descrito anteriormente contiene aproximadamente 5 x 10 6 células; Sin embargo, más de 100 colonias por placa son difíciles de distinguir con precisión. Revestimiento de la muestra sin diluir así como de serie diluciones 1:1…

Discussion

Juntos, los protocolos en este documento se describen los pasos esenciales necesarios para el desarrollo y prueba de cepas de levadura auxotróficos probióticos para la entrega de la proteína terapéutica heteróloga al intestino. Esta manipulación y el ensayo de levadura viva recombinante requiere técnicas y recursos con los que cualquier laboratorio individuo puede no estar familiarizado actualmente. Por lo tanto, a pesar de numerosos estudios anteriores han descrito los protocolos anteriores para múltiples cepas…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053