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Developmental Biology

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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L'imagerie in vivo fournit une visualisation directe des comportements cellulaires dans le contexte le plus physiologique. La transparence des embryons de poisson zèbre, leur développement rapide et externe et un riche éventail d'outils génétiques qui permettent l' étiquetage fluorescent ont tous contribué à l'utilisation croissante de la microscopie in vivo pour élucider la dynamique des événements clés du développement. Les études d'imagerie de développement du système nerveux chez le poisson zèbre ont par exemple considérablement élargi notre connaissance du comportement des cellules progénitrices neurales et le sort de leur progéniture , y compris leur migration ultérieure, la différenciation et l' intégration du circuit 1-8.

Le décor est désormais planté pour étudier la dynamique subcellulaire qui sous-tendent ces comportements cellulaires. En effet, le poisson zèbre sont déjà exploitées comme des outils pour in vivo la biologie cellulaire. Il est maintenant possible de visualiser les mitochondries 9-11, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15Le cytosquelette d' actine et microtubules 4 16, 17 endosomes et les composants de la membrane apicale complexe 1,18, entre autres structures sous - cellulaires dans les embryons de poisson zèbre in vivo. Jusqu'à présent, une grande partie de ce qui est connu sur la fonction de ces organites vient d'étudier leur comportement dans les cellules cultivées. Bien que des études in vitro ont donné un remarquable aperçu de la biologie cellulaire, les cellules en culture ne représentent pas pleinement la complexité de la situation in vivo et ne reflètent donc pas nécessairement la fonction et la dynamique des organites intracellulaires in vivo. Embryons de poisson zèbre offrent une solution viable en alternative vivo d'étudier la dynamique subcellulaire.

Comme les vertébrés, le poisson - zèbre possède de nombreux systèmes d'organes (par exemple, la rétine neurale) qui sont homologues à celles trouvées chez les espèces de mammifères. En outre, les embryons de poisson zèbre sont de plus en plus utilisés pour modéliser les maladies humaines 19,20 (par exemple, microcéphalie 21 et amaurose 22 congénitale de Leber) et de la fonction mitochondriale (par exemple, la maladie de Parkinson 23, tauopathies 10,24 et le syndrome de Barth 25). imagerie in vivo au niveau cellulaire et subcellulaire dans ces cas, permettra une meilleure compréhension de la biologie des cellules sous-jacentes de ces états pathologiques.

L'objectif général des méthodes décrites ici est de fournir un guide complet pour enquêter sur les organites et d' autres structures subcellulaires dans les embryons de poisson zèbre en utilisant la microscopie optique in vivo. L'ensemble du flux de travail impliqués dans la visualisation et le suivi des structures intracellulaires in vivo est décrit - des approches d'étiquetage génétiques, de générer transitoirement exprimer et de poissons transgéniques stables, et enfin à l' imagerie utilisant grand champ et la microscopie confocale. Bien que chacun de ces procedures est utilisé par de nombreux laboratoires de poisson zèbre, les protocoles décrits sont optimisés et rationalisés pour étudier la dynamique des structures subcellulaires. Deux aspects spécifiques des travaux décrits ici méritent mention: Tout d'abord, l'utilisation du système d'expression Gal4-UAS dans de multiples configurations pour génétiquement organites d'étiquettes dans types cellulaires spécifiques. Deuxièmement, une comparaison directe de grand champ et la microscopie confocale à des structures subcellulaires d'image in vivo.

Les stratégies actuelles pour modifier génétiquement des organites d'étiquettes et autres structures sous - cellulaires chez le poisson zèbre , soit utiliser des ARNm coiffés 1,4,8 ou des constructions d'ADN sur la base , où les éléments promoteurs entraînent directement l'expression des protéines de fusion 9,14,15 transcrit in vitro coiffé résultats d'ARN in. rapide et large expression, ce n'est pas spécifique du tissu cependant. En outre, les niveaux d'expression diminuent au fil du temps que l'ARN coiffé est dilué ou dégradé. Ainsi, l'utilisation d'ARN à base deconstruit pour examiner la dynamique des organites à des stades ultérieurs de développement est limitée (généralement jusqu'à 3 jours après la fécondation).

Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant des constructions d'ADN, où le contrôle spatial et temporel d'expression est déterminé par des éléments spécifiques du promoteur. Quand les constructions d'ADN sur la base sont utilisés dans le contexte du système Gal4-UAS des améliorations significatives des niveaux d'expression du transgène sont observées 26,27. Dans ce système d'expression bipartite éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l'expression d'un activateur de transcription de Gal4, tandis que les gènes rapporteurs sont clonés en aval de la séquence d'activation en amont Gal4 de liaison (UAS). En combinant UAS journalistes avec les pilotes Gal4 appropriés, l'expression peut être limitée aux types cellulaires spécifiques, contourner la nécessité de cloner des gènes rapporteurs derrière des promoteurs différents à chaque fois un motif d'expression spécifique est souhaitée. En outre, l'expression de multiples gènes rapporteurs UAS peut êtreentraînés par un seul activateur de Gal4. Le système Gal4-UAS fournit donc une approche génétique polyvalent et flexible pour l'étiquetage subcellulaire.

Grand champ et microscopes confocaux sont les chevaux de bataille de la plupart des laboratoires. Les systèmes à grand champ utilisent généralement une lampe à arc en tant que source de lumière et détecter la lumière émise par une caméra sensible qui est placé à l'extrémité du trajet lumineux. Cette modalité d'imagerie est généralement limitée à des échantillons minces comme hors de la lumière de mise au point obscurcit les informations de mise au point dans des échantillons plus épais. Microscopes confocale diffèrent des systèmes à champ large en ce qu'ils sont construits pour favoriser les signaux qui proviennent du plan focal par rapport à ceux qui sont originaires de mise au point ( par exemple, «sectionnement optique») 28. Pour réaliser un sectionnement optique à sténopé est placée dans le chemin d'émission dans une position conjuguée à la source de lumière ponctuelle. Les lasers sont utilisés en tant que sources de lumière et les signaux sont détectés avec des tubes photomultiplicateurs (PMT). Pratiquement, un laserfaisceau est glissée sur l'échantillon point par point et l'émission de fluorescence à chaque point (pixel) est détecté par le PMT.

Ici, nous l'image les mêmes structures subcellulaires dans la vie des embryons de poisson zèbre utilisant à la fois grand champ et la microscopie confocale pour fournir une comparaison directe des deux modalités de microscopie. L'objectif sous-jacent de fournir de telles comparaisons est d'offrir des lignes directrices pour le choix technique de microscopie la plus appropriée pour la question spécifique à portée de main.

En utilisant les approches décrites ici, nous démontrons Gal4-UAS étiquetage génétique basée des mitochondries et centrosomes. Ces organites sont imagés dans différents types de cellules du système nerveux et dans les cellules musculaires en utilisant grand champ et la microscopie confocale à démontrer la pertinence de chaque modalité d'imagerie. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour enquêter sur d'autres organites et des structures subcellulaires dans l'embryon de poisson zèbre vivant.

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Protocol

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Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux réglementations locales du gouvernement de Haute-Bavière (Munich, Allemagne).

1. Étiquetage Organelles et autres structures subcellulaires

NOTE: Ici journaliste génétique construit cette balise centrosomes fluorescence, les mitochondries et les membranes cellulaires sont décrites.

  1. Utiliser des méthodes classiques de clonage 29 pour générer des protéines de fusion qui étiquettent fluorescence centrosomes et les mitochondries. Cloner la séquence codante de centrin4 poisson zèbre (de cetn4) dans le cadre avec une protéine fluorescente 2 (FP) , tels que la protéine fluorescente jaune pour générer cetn4-YFP. Cloner la séquence d'adressage mitochondrial de la sous - unité VIII de la cytochrome c oxydase dans le cadre avec un FP comme la protéine fluorescente cyan pour générer mitoCFP 11/09.
  2. Pour limiter l'expression des protéines de fusion (cetn4-YFP ou mitoCFP) à des cellules spécifiques du zebrafish embryon (par exemple , les neurones ou des cellules musculaires) utilisent le système d'expression Gal4-UAS bipartites 26,27. Tout d'abord générer une construction rapporteur UAS. Utiliser des méthodes classiques pour cloner la protéine de fusion dans un vecteur d'expression de la SAMU, en aval de la cassette UAS Gal4 de liaison (variantes vont de 1x à 14x UAS, voir Discussion) 26,27,30 et un promoteur minimal (E1b promoteur basale de la carpe βactin gène), et générer des UAS: cetn4-YFP et UAS: mitoCFP.
    NOTE: Pour préparer UAS reporter construit pour la génération de la lignée transgénique stable éléments supplémentaires doivent être clonée (voir 3 ci - dessous)
  3. Pour visualiser le contexte cellulaire dans lequel les centrosomes ou mitochondries sont marquées, de générer UAS produits de construction rapporteurs dans lequel les membranes cellulaires sont marquées par PCR. Cloner les vingt premiers acides aminés de poisson - zèbre GAP43 (contenant des sites de palmitoylation) dans le cadre avec un PF de cibler que FP sur la membrane cellulaire (memFP) 31,32.
  4. obten constructions de conducteur ou de lignes transgéniques dans lesquels des éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l'expression de l'activateur de transcription de Gal4-VP16 27, 33 ou Gal4FF KalTA4 30.
  5. Combinez le journaliste UAS construit avec une construction de pilote approprié pour restreindre l' expression du type de cellule d'intérêt souhaité (par exemple, dans les neurones ou des cellules musculaires). Pour ce faire , co-injection pilote Gal4 et UAS journaliste construit au stade d' une cellule d'œufs fécondés (pour obtenir des instructions détaillées , voir 2 ci - dessous) pour générer transitoirement exprimer poissons. Vous pouvez également générer un UAS reporter lignée transgénique stable (pour obtenir des instructions détaillées , voir 3 ci - dessous) et traverser à un pilote Gal4 lignée transgénique stable pour générer la progéniture portant deux transgènes.
    NOTE: Il est également possible d'injecter UAS construction rapporteur / s dans des œufs fécondés à partir d' un pilote Gal4 lignée transgénique stable ou un pilote Gal4 construire en fertilizoeufs ed d'un UAS reporter lignée transgénique stable.
  6. Pour co-exprimer plusieurs protéines de fusion distinctes utilisant le système Gal4-UAS, utilisez un pilote Gal4 et UAS reporter / s dans l' une des configurations suivantes: A. Multiple, constructions UAS rapporteurs distincts (par exemple, UAS: mitoCFP et UAS: memYFP co -injected avec un pilote Gal4 construction) 10, B. Plusieurs cassettes UAS sur un seul journaliste (par exemple, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Journaliste bidirectionnel UAS (par exemple UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figure 1).

Figure 1
Figure 1. Stratégies pour co-exprimer des protéines de fusion en utilisant le système Gal4-UAS.
La co-expression de protéines de fusion multiples peut être réalisé en utilisant UAS cassettes rapporteurs dans différentes configurations: (A) multiple, const entraînée UAS séparéeructs, (B) plusieurs cassettes UAS sur une construction unique ou (C) une cassette UAS bidirectionnel sur une seule construction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Générer transitoirement Exprimer poisson

NOTE: Ce qui suit est une adaptation des protocoles déjà publiés 34,35. Une configuration de base d'injection devrait inclure un stéréomicroscope avec une gamme de grossissement jusqu'à 12x, un micromanipulateur avec un porte-micropipette et une source de pression d'air. Préparer 2,1-2,5 à l'avance:

  1. Pour préparer des œufs chambres de microinjection, de préparer une solution de 1,5% (p / v) d'agarose dans de l'eau. Ajouter la poudre d'agarose à l'eau et micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous. Remplir une boîte de Petri (100 x 15 mm) avec cette solution.
    1. Laisser la solution d'agarose refroidir à APPRoximately 45 o C avant de placer un moule en plastique de microinjection (40 mm x 66 mm, avec 6x 50 mm de long des crêtes qui sont de 1,5 mm de large, 1 mm de profondeur et espacées de 3 mm d' écart) sur la surface de l'agarose fondu, en prenant soin de ne pas introduire des bulles à l'interface.
    2. Après les ensembles d'agarose, conserver à 4 o CO / N. Retirez délicatement le moule à l'aide d'une spatule. Préparer plusieurs chambres de microinjection à la fois, conserver à 4 o C et utiliser de façon répétée sur plusieurs semaines.
  2. Utiliser un extracteur pour générer des micro - pipette d'injection capillaires en verre avec une longue tige 36.
    REMARQUE: Les paramètres spécifiques utilisés pour générer des capillaires d'injection doit être déterminée de manière empirique. capillaires d'injection peut être tiré à l'avance et stockés avant leur utilisation.
  3. Mesurer la concentration d'ADN plasmidique (pilote Gal4 et UAS constructions rapporteurs) pour microinjection en utilisant un spectrophotomètre selon le manuel du fabricant. Mesure60, le rapport de l'absorbance à 260 nm et 280 nm (A260 / 280). Diluer l'ADN jusqu'à une concentration finale de 100 ng / ul dans de l'eau sans nucléase.
    REMARQUE: Un A260 / 280 rapport de 1,8 ~ signifie l' ADN pur. Envisager l'utilisation d'un kit commercial (basé sur une matrice de liaison à base de silice) pour purifier l'ADN plasmidique à être utilisé pour l'injection. L'ADN plasmidique devrait être de haute qualité pour éviter la toxicité.
  4. Préparer 10 ul injection-mix en combinant l'ADN (0,5 à 2,5 pi de 100 ng / stock ul pour une concentration finale de 5 à 20 ng / ul), la solution de Danieau (0,33 pi de 30x stock), Phenol Red (0,25 pi, eau en option) et sans nucléase à un volume total de 10 pi.
    REMARQUE: déterminer empiriquement la concentration d'ADN qui donne l' expression appropriée. GAL4 UAS conducteur et plasmides rapporteurs ont besoin d'être co-injecté. Aucune expression résultera lorsque seul le pilote Gal4 ou UAS plasmide rapporteur est injecté dans de type sauvage œufs fécondés. Si, toutefois, til fécondé les œufs sont à partir d'une ligne de pilote Gal4 puis injection d'un ou plusieurs plasmides UAS rapporteurs suffit. Inversement, si microinjection en une ligne de journaliste UAS, seul le pilote plasmide Gal4 doit être injecté. Enfin, alors que Phénol Red peut grandement aider à visualiser les injections, il est également un composé fluorescent lui-même. Par conséquent, Phénol Red pourrait obscurcir MF visualisation si l'imagerie est prévue avant 24 heures après la fécondation (HPF), car il ne peut pas être suffisamment dilué par ce temps.
  5. Le soir, avant les injections sont prévues, mis en place plusieurs paires (typiquement de 5 à 10) mâle et femelle pour la reproduction du poisson zèbre. Utilisez bassins d'élevage avec un insert contenant un fond grillagé et un séparateur amovible pour séparer les poissons mâles et femelles.
    NOTE: Mâle et femelle zebrafish se distinguent généralement par leur forme du corps. Les mâles ont tendance à être minces alors que les femelles ont tendance à présenter une saillie de l'abdomen ventral. Les mâles ont tendance en outre d'avoir un col rouge-jaunâtreoring sur leur région abdominale ventrale.
  6. Immédiatement avant les injections d'ADN, retirer les diviseurs pour permettre le mâle et la femelle s'accoupler. Environ 15 à 30 minutes après avoir enlevé le diviseur, vérifier les oeufs au fond de la cuve. Transférez le poisson adulte en utilisant un filet de pêche à un nouveau réservoir d'élevage.
  7. Versez l'eau, contenant les œufs fécondés nouvellement établies, sur le réservoir d'élevage dans un tamis (par exemple, une passoire à thé en plastique). Lavez les oeufs dans le tamis à l'aide d'un flacon pulvérisateur contenant la solution de Danieau. Inversez le tamis sur une boîte de Pétri et utiliser un flacon pulvérisateur avec la solution de Danieau pour récupérer tous les oeufs (typiquement 50 à 200 œufs par reproduction paire de poissons adultes).
  8. En utilisant une pipette de microloader, back-remplir un capillaire d'injection tiré avec l'injection-mélange d'ADN. Monter le capillaire d'injection dans le support d'un micromanipulateur et couper la pointe, sous le contrôle visuel d'un stéréomicroscope, en utilisant une pince pour créer une micropipette qui peut penetrate le chorion et le cytoplasme des cellules tout en étant en mesure de livrer un volume approprié de l'ADN.
    NOTE: La mesure dans laquelle la pointe du capillaire d'injection est coupé doit être déterminée empiriquement et peuvent le mieux être jugé lors de l' injection des œufs.
  9. Pour déterminer le volume de l'ADN pour injection, décharger une goutte de la solution d'injection dans l'huile minérale. Mesurer le rayon (r) de la goutte à l' aide d' un micromètre d'étalonnage et de calculer le volume (03/04 π r 3). Moduler le volume en réglant la pression d'injection et / ou la durée de chaque impulsion d'injection.
  10. En utilisant une pipette en plastique, transférer tous les œufs collectés (typiquement 50-200, de 2.7 ci - dessus) dans les tranchées d'une chambre de microinjection. Sous le contrôle visuel d'un stéréomicroscope, utilisez une pince pour orienter les œufs de telle sorte que le cytoplasme cellulaire (transparent) et jaune (dense, non-transparent) peuvent être facilement identifiés.
  11. Sous le contrôle visuel d'une chaîne hi-fimicroscope, injecter de l'ADN dans le cytoplasme de la cellule de l'œuf fécondé, en prenant soin de faire en sorte que le volume injecté (1 à 2 nl) correspond à environ 10% du volume de la cellule.
    REMARQUE: Phénol rouge dans les aides à la solution d'ADN dans la visualisation du volume injecté.
  12. Après l'injection, desserrez les œufs des tranchées du moule d'injection en les rinçant avec un flacon pulvérisateur contenant la solution de Danieau. Transférer ensuite les oeufs dans une boîte de Pétri frais à l' aide d' une pipette de transfert en plastique et maintenir dans un 28,5 o C incubateur.
  13. Maintenir les oeufs un-injecté en tant que témoins pour déterminer si les injections contribuent à des taux élevés de mortalité, soit à la suite de dommages physiques subis lors de la pénétration de micropipette ou le mélange d'ADN.
    NOTE: Les taux élevés de mortalité après les injections pourraient être dues à de nombreux facteurs, y compris la concentration ou injection volumes excessivement élevé d' ADN et / ou plasmides avec contaminants. Afin d'éviter la toxicité de préparations d'ADN de faible qualité, des kits commerciaux (basés sur une matrice de liaison à base de silice) peuvent être utilisés.
  14. A intervalles réguliers suivants injections, utilisez un stéréomicroscope pour dépister les œufs non fécondés et les embryons morts ou malformés et jeter ceux-ci.
    NOTE: Deem les œufs qui semblent être au stade d' une cellule plusieurs heures après la fécondation, comme non fécondé. Identifier les embryons malformés par des défauts anatomiques bruts tels qu'un compromis axes du corps antérieur-postérieur. matériau amorphe dans un chorion suggère que l'embryon n'a pas eu lieu à travers les étapes de développement et il est mort. Pour déterminer si les embryons qui ont été microinjecté suivent un cours normal du développement consulter atlas anatomiques 37.
  15. Transférer les embryons à l'aide d'une pipette de transfert en plastique à la solution contenant Danieau 1x 1-phényl 2-thiourée (1xPTU) entre 10 et 24 hpf pour empêcher la formation de pigments. Maintenir les embryons en solution la suite de Danieauaining PTU pendant toute la durée de l'expérience.
    NOTE: En plus de mélanophores, iridophores sur la surface de la peau peut être problématique pour l' imagerie. Alors que PTU n'inhibe pas la formation iridophore, les lignées mutantes avec un nombre réduit de iridophores tels que orbison roy (roy) existent et peuvent être utilisés 38.
  16. Après les embryons éclosent (généralement sur le post-fécondation deuxième ou troisième jour, 2 ou 3 dpf), jeter les chorions et échanger la solution du Danieau contenant PTU.
    REMARQUE: Ces étapes sont importantes pour garantir la qualité du milieu d'embryon et de la viabilité des embryons sains.

3. Générer des lignées transgéniques stables

NOTE: Les lignées transgéniques stables peuvent être produites de manière efficace en utilisant le système de transposon Tol2. Un vecteur de transposon Tol2 contenant le transgène d'intérêt est co-injecté avec l'ARNm codant pour l'enzyme transposase dans fertiliserd oeufs au stade une cellule. Protéine transposase dérivé de l'ARNm injecté catalyse l'excision de la cassette de transgène à partir du vecteur de transposon et son intégration dans le génome 39.

  1. Cloner la cassette rapporteur du transgène (par exemple, UAS: mitoCFP) entre Tol2 répétitions terminales inversées dans l' un des vecteurs Tol2 actuellement utilisés dans la communauté zebrafish comme décrit 40.
    REMARQUE: Les vecteurs Tol2 contenant une cassette de sélection dans laquelle les éléments promoteurs dirigent l' expression de la PF dans les systèmes d'organes non reliés à la zone d'intérêt (par exemple, le coeur 41 ou de la lentille 42) sont utiles pour le criblage de lignées transgéniques UAS rapporteurs en l'absence de Gal4 transactivation.
  2. À l'aide d'un kit commercial (basé sur une matrice de liaison à base de silice), de purifier l'ADN plasmidique à être utilisé pour l'injection. Assurez-vous que l'ADN plasmidique est de haute qualité pour éviter la toxicité.
  3. Transcrire Tol2 ARNm transposase codant pour l'aide d'unvecteur de transcription approprié tel que PCS-TP 43. En bref, linéariser PCS-TP et d'utiliser un kit commercial pour générer plafonné ARNm et suivre le protocole du fabricant. Prenez soin d'éviter la contamination par des RNases (par exemple, utiliser RNase conseils et tubes pipettes). Aliquoter l'ARN, à une concentration de 100 ng / pl, à usage unique et conserver à -80 o C.
  4. Le matin des injections, dégeler une aliquote de transposase ARNm sur la glace. Mélanger le vecteur d'ADN de transposon (2 ul de 100 ng / ul) et transposase ARNm (2 ul de 100 ng / ul) dans un rapport 1: 1, et d'ajouter 6 ul d'eau sans RNase pour porter le volume total à 10 ul.
    Remarque: Une concentration de 20 ng / pl est recommandée pour chacun , mais la concentration optimale doit être déterminée de manière empirique. Utiliser de l'eau libre RNAse pour la dilution. Utiliser des gants lors de la manipulation du mélange d'injection ADN-ARN et le garder sur la glace pendant toute la période des injections pour prévenir la dégradation de la mL'ARN.
  5. En suivant les instructions détaillées dans la section 2 ci - dessus, injecter le mélange d'injection ADN-ARN dans des œufs fécondés au stade d' une cellule. Sous contrôle visuel d'un stéréomicroscope cibler le cytoplasme des cellules au stade une cellule pour les taux d'efficacité de la transgenèse les plus élevées. Maintenir les embryons injectés à 28,5 o C jusqu'au moment de l' écran pour l' expression du transgène.
    NOTE: PCR peut être fait pour vérifier l' efficacité de la transposase Tol2 comme décrit précédemment 44.
  6. embryons d'écran dans une boîte de Pétri pour la transgenèse utilisant les oculaires d'un microscope de fluorescence de dissection.
    REMARQUE: Utilisez les filtres appropriés du microscope pour visualiser FP expression de la cassette sélectionnable (ie, la fluorescence dans le coeur ou la lentille) à 2 ou 3 dpf. Identifier les embryons transgéniques potentiels par l' expression (dans le cœur ou la lentille) et soulever ces embryons à l' âge adulte (F 0 génération) en utilisant la normeprotocoles 45. Vous pouvez également identifier les embryons transgéniques potentiels par PCR comme décrit dans 46.
  7. Une fois que la SAMU journaliste F 0 poissons sont 2,5 - 3 mois d'âge, les traverser (voir 2.5 pour plus de détails) à la non-transgénique de type sauvage du poisson pour acquérir des œufs pour établir une génération F 1. Vous pouvez également traverser la SAMU journaliste F 0 poissons à une ligne de pilote Gal4 pour établir une génération F 1. Dans ce dernier cas, le transgène conduit UAS-peut être directement contrôlée dans les embryons obtenus à partir de la croix.
  8. Utiliser une fluorescence microscope à dissection pour cribler F 1 embryons pour l' expression du transgène ou d'une cassette sélectionnée.
    REMARQUE: Lorsque l' expression est confirmée alors le transgène peut être dit être germinale transmis. La transgenèse est non-mendélienne au stade F 0. Le nombre d'embryons exprimant le transgène peut varier d'un petit nombre à la grande majorité de Embrayages individuelles. L' intégration de transposon dans différents F 0 poissons peut varier considérablement, ce qui entraîne différents profils d'expression. Par conséquent , maintenir la F 1 des poissons de différentes F 0 fondateurs comme des sous-lignes séparées. Intégrations de transposons dans F 1 poissons sont stables et sont répercutés sur les générations suivantes de façon mendélienne.
  9. Maintenir chaque F 0 poissons dans des réservoirs séparés de ré-identifier les porteurs du transgène.

4. Préparer Embryons for Imaging sur un microscope droit

NOTE: Les procédures décrites ici ont été optimisés pour l' imagerie sur les microscopes verticaux avec des objectifs à long distance de travail d' eau par immersion-cône.

  1. Utilisez une fluorescence microscope de dissection pour dépister les embryons pour l'expression du transgène.
    NOTE: L' expression d'un journaliste transgène UAS dépendra de la ligne de pilote Gal4 spécifique utilisé. Sélectionnez embryons pour des expériences d'imagerie basées sur exp souhaitéemotif de ression.
  2. Transférer les embryons sélectionnés à l'aide d'une pipette en plastique pour une boîte de Pétri séparé contenant le tampon de Danieau avec 1x PTU et 1x Tricaine.
    REMARQUE: Lorsque l' étiquetage est rare (seulement quelques cellules dans un système d'organes) monter les embryons en agarose (voir 04.03 à 04.07 ci - dessous) et de l' écran pour l' expression du transgène à l' aide d' un microscope à champ large avec des objectifs à fort grossissement (voir 5.1 ci - dessous). Tricaine anesthetizes le poisson et devrait être effective en quelques secondes. Si les poissons ne sont pas immobilisés, il est probable que la tricaïne est dégradée. Les raisons possibles de cette dégradation comprennent un mauvais stockage des Tricaine, qui est sensible à la lumière 47.
  3. Préparer l'agarose à incorporer le poisson en dissolvant la poudre d'agarose à bas point de fusion dans le tampon de Danieau à une concentration finale de 0,7%. Aliquote (1 ml) et conserver dans un bloc thermique à 40 ° C jusqu'à utilisation.
    NOTE: concentrat supérieurions d'agarose (jusqu'à 1,5%) peut également être utilisé pour intégrer le poisson.
  4. Ajouter 50 pl d'un 20x stock d'Tricaine et 20 ul d'une solution 50x stock de PTU à l'aliquote de 1 ml d'agarose bas point de fusion et bien mélanger en appuyant sur le côté du tube. Remettre le tube au bloc thermique. En utilisant une pipette de transfert en plastique, pipette doucement quelques (1-10) embryons anesthésiés dans l'agarose, transfert aussi peu de liquide que possible afin d'éviter la dilution de l'agarose.
  5. Au moyen d'un transfert de pipette en plastique tous les embryons avec une petite quantité d'agarose dans un fond de verre boîte de Pétri.
  6. Travail relativement rapide, l'utilisation de pinces pour positionner les embryons dans l'orientation souhaitée, en fonction de la structure à imager.
    NOTE: les embryons Orient , de leur côté , si la rétine ou Rohon-Beard (RB) neurones sensoriels devraient être imagés.
  7. Permettre à l'agarose se solidifie pendant au moins 15 minutes. Ajouter le tampon de Danieau contenant 1xPTU et 1xTricaine pour couvrir les embryons intégrés dans agaroproprement parler. Placer le plat contenant des embryons d'agarose-intégré dans un incubateur à 28,5 o C jusqu'au moment de l' image.

5. Imagerie cellulaire et subcellulaire Structures utilisant grand champ ou microscopie confocale

REMARQUE: grand champ microscopique et point microscopie confocale à balayage sont les modalités les plus largement utilisés à l' image embryons de poisson zèbre marquées par fluorescence Le tableau 1 résume les principaux avantages et inconvénients des deux systèmes.. Pour les deux formes de microscopie, les embryons sont montés dans l' agarose , comme décrit dans 4 ci - dessus, et maintenue à 28,5 ° C pendant toute l'expérience d'imagerie en utilisant une chambre de chauffage sur la platine du microscope. Fait important, le plat avec des embryons d'agarose-intégré est autorisé à équilibrer à 28,5 o C avant l' imagerie commence que les fluctuations de température provoquent la dérive dans la dimension z. Lors de la réalisation des expériences d'imagerie à long terme (plus de several heures), placer un couvercle en plexiglas sur la boîte de Pétri pour réduire l'évaporation du tampon.

Grand champ Point de balayage confocal
Coût Relativement peu coûteux Cher (env. 5 fois plus)
Photo-blanchiment Faible Haute. L'échantillon est exposé à une lumière laser au-dessus et au-dessous du plan focal.
Photo-toxicité Faible High (voir la photo-blanchiment ci-dessus)
la vitesse d' acquisition Vite Lent
Résolution xy La loi de l'abbé La loi de Abbe (peut être améliorée par l'application de 40% en utilisant un très petit trou d'épingle;. Cependant,la plupart des paramètres cela a peu d'application pratique)
sectionnement optique Pauvre Oui (peut être ajustée selon la taille sténopé)
La pénétration tissulaire Limité à des structures superficielles (par exemple, Rohon-Beard cellules ou fibres musculaires) Limitée à <100 mm à partir de la surface de l'embryon

Tableau 1. Comparaison générale du grand champ et le point-microscopie confocale à balayage

  1. La microscopie à grand champ
    NOTE: Voici les lignes directrices sont fournies pour l' imagerie embryons de poisson zèbre en utilisant un microscope droit à grand champ avec des objectifs à long distance de travail d' eau par immersion-cône. Le microscope est équipé d'une caméra CCD refroidie, et des jeux de filtres pour visualiser des fluorophores différents monté sur une roue de filtres automatisé pour l'acquisition rapide de multiples canaux.L' acquisition des images est contrôlée par μManager, un progiciel de microscopie open source 48. Un exemple spécifique pour l'imagerie des mitochondries dans les neurones sensoriels RB est fourni. RB cellules sont génétiquement marquées à l' aide membrane YFP ciblée et leurs mitochondries sont CFP-marqués (voir 1.1 ci - dessus).
    1. Embryons de montage de leur côté à bas point de fusion d' agarose comme décrit dans 4 ci - dessus.
    2. Laisser le plat avec du poisson monté à équilibrer à 28,5 o C dans une chambre de chauffage sur la scène du microscope avant de commencer l' imagerie.
    3. Utilisez un objectif eau-trempage-cône faible grossissement et regarder à travers les oculaires du microscope pour choisir une zone sur la surface de l'embryon à l'image.
      NOTE: Si le transgénique ligne MitoFish rapporteur stable, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, est utilisé en conjonction avec une ligne de pilote tels que HuC: Gal4 alors les neurones les plus RB sont marqués, et apparaissent comme un mes densesh-travail de tonnelles de neurites sur la surface de l'embryon. Si la micro - injection de constructions d' ADN est utilisée pour réaliser l' étiquetage clairsemé (par exemple sensorielle: Gal4-VP16 avec SAMU: mitoCFP et SAMU: MA-YFP), les embryons d'écran afin d' identifier les cellules doublement marquées.
    4. Ouvrez le logiciel de microscope (μManager 1.4) et cliquez sur "Illumination '' sous la rubrique« Paramètres de configuration »pour définir les jeux de filtres appropriés pour la longueur d'onde d'intérêt (YFP ou CFP pour l'exemple actuel). Sous la rubrique« Réglages de l'appareil ", entrez le temps d'exposition requis pour acquérir une image appropriée.
      NOTE: Les "Réglages éclairage" est pré-réglée par l'utilisateur lors de l' installation du logiciel et est chargé lors de l' ouverture μManager. Si le logiciel est pas configuré pour contrôler la roue de filtre, déplacer manuellement la roue de filtre dans la tourelle à la position appropriée.
    5. Changer pour un objectif d'eau par immersion cône longue distance-travail allant de 40-100x grossissement. Choisirl'objectif qui a la plus haute ouverture numérique (NA) et est corrigé chromatiquement (apochromatique).
    6. Cliquez sur "Live" pour choisir le champ de vision: Dans le cas du neurone RB, l'image du transport mitochondrial à l'axone souches, émanant du corps cellulaire, ou sous la tonnelle périphérique.
      NOTE: Les tonnelles périphériques des neurones RB dans le pli de la nageoire caudale de l'embryon fournissent une occasion idéale pour l' image d' un grand champ de vision qui est plat et peut donc être capturé sur une seule image avec un microscope à champ large. Il est donc important de monter l'embryon à plat que possible, sur son côté, de sorte que le pli caudale est parallèle au fond de la boîte de Pétri.
    7. Après avoir choisi un champ de vue, cliquez sur le bouton "sélection rectangulaire" dans le menu ImageJ, définir une région d'intérêt (ROI) et cliquez sur "ROI" dans la fenêtre μManager. Après avoir sélectionné le retour sur investissement pour l'imagerie, cliquez sur "Stop" et "Enregistrer" pour take une image du canal YFP pour enregistrer la morphologie locale des neurites / s.
    8. Pour l'image du transport mitochondrial cliquez sur le "Multi-D Acq." bouton. Observer une fenêtre supplémentaire ( «Multi-dimensionnelle Acquisition") et sélectionner le nombre de points de temps, ainsi que l'intervalle entre les points de temps sur cette fenêtre. Utiliser des taux de trame de 0,3-1 Hz. Effectuer des enregistrements pendant au moins 10 min pour recueillir autant de points de données que possible.
    9. Dans la fenêtre "multi-dimensionnelle Acquisition", cliquez sur "Canaux", d'ajouter et de définir la longueur d'onde pour l'imagerie (PCP pour les mitochondries dans cet exemple) et le temps d'exposition. Gardez les temps d'exposition à moins de 400 msec pour l'imagerie du transport mitochondrial.
    10. Cliquez sur l'option "Enregistrer les images" dans la fenêtre "multi-dimensionnelle d'acquisition», pour sauvegarder automatiquement les fichiers dans un dossier spécifique décrit dans la «racine Directory». Cliquez sur "Acquire" dans le coin supérieur droit de commencer timimagerie e-lapse.
    11. réajuster manuellement la mise au point pendant l'enregistrement time-lapse pour compenser toute dérive dans la dimension z.
      NOTE: L'utilisation de ces paramètres de transport mitochondrial dans les neurones RB peut être imagée aussi longtemps que 4 heures.
  2. Microscopie confocale
    NOTE: Voici les lignes directrices sont fournies pour l' imagerie avec un Olympus FV1000 microscope confocal verticale et les objectifs de l' eau-trempage-cône distances long travail. Le microscope est équipé de plusieurs lignes laser, et plusieurs détecteurs (photomultiplicateurs conventionnels et des détecteurs les plus sensibles en arséniure de gallium de phosphure) qui permettent une imagerie à canaux multiples. il est fait référence spécifique au logiciel Olympus Fluoview. Toutefois, les paramètres d'imagerie décrits ici doivent être facilement transférables à d'autres systèmes confocaux.
    1. Embryons de montage dans l' agarose bas point de fusion dans une orientation appropriée pour l'organe / structure imager, tels que décrits dans les 4 ci - dessus.
    2. o C dans une chambre de chauffage sur la scène du microscope avant de commencer l' imagerie.
    3. Utilisez la distance objectifs d'eau par immersion à cône long travail pour microscopes confocaux dans une configuration verticale. Choisir des objectifs avec le plus haut possible NA pour maximiser la quantité des signaux fluorescents qui peuvent être collectées et ont le meilleur pouvoir de résolution. Lorsque la collecte des images à partir de plusieurs canaux choisissent objectifs chromatiquement corrigées (apochromatiques).
    4. Ouvrez le logiciel de microscope et cliquez sur "Trans Lamp" ou "Epi lampe" à utiliser respectivement soit la lumière transmise ou de la fluorescence pour identifier la région d'intérêt par les oculaires du microscope.
    5. Utilisez le logiciel pour configurer les paramètres d'analyse suivants pour acquérir des piles d'images:
      1. Dans la fenêtre "Réglage Acquisition" vérifier que l'objectif choisi pour l'imagerie correspond à l'objectif qui apparaît sur le menu down Menu des objectifs disponibles.
        NOTE: Ceci est d'assurer que tous les paramètres pré-calculées pour un objectif particulier (résolution par exemple, latérale et axiale, la taille de l'ouverture confocale etc.) sont valables et peuvent être utilisés de manière fiable.
      2. Sélectionnez la ligne laser / s, et d'excitation et d'émission dichroïques filtres appropriés à l'image protéine fluorescente spécifique (s). Pour ce faire, en cliquant sur la "liste Dye" dans la fenêtre "Image Acquisition Control" et choisissez le fluorophore / s approprié. Vous pouvez également cliquer sur le bouton «chemin de lumière et colorants" pour régler manuellement ces paramètres.
        NOTE: Lorsque la "Liste Dye" option de bouton est choisi, le logiciel sélectionne automatiquement les filtres dichroïques lignes laser, d' excitation et d' émission appropriés et ajuste la taille de l'ouverture confocale de manière appropriée.
      3. Dans la fenêtre "Acquisition Réglage", régler le facteur "Zoom" et "asp Tailleect rapport "(ie, 512x512, 1024x1024 , etc.) de l'image numérisée pour obtenir la taille de pixel nécessaire pour résoudre au mieux les structures imagées. Définissez la taille de pixel à environ la moitié de la résolution théorique de l'objectif, ce qui suit Nyquist critères d'échantillonnage . pour déterminer la taille de pixel de l'image acquise, cliquez sur le bouton avec le symbole de l'information ( "i") dans la fenêtre "image Acquisition Control".
      4. Réglez la vitesse de balayage la plus rapide possible (2 us / pixel) dans la fenêtre "Réglage Acquisition".
      5. Dans le "Image Acquisition Control" fenêtre, cliquez sur Kalman ligne moyenne pour réduire le facteur bruit.Procédé de 2 à 3 suffit habituellement.
      6. Sélectionnez un mode de balayage séquentiel lors de l'imagerie fluorophores avec chevauchement des spectres. Pour ce faire, cliquez sur "séquentielle" et "Line" dans la fenêtre "Image Acquisition Control".
      7. Réglez la puissance de sortie de la ligne laser / s pertinents (généralementinférieure à 5%). Les valeurs spécifiques doivent être déterminées empiriquement.
      8. Cliquez sur le bouton "XY Repeat" ou "x2 Focus" ou "Focus x4" pour analyser en continu la région sélectionnée tout en ajustant les réglages du détecteur pour chaque canal. Réglez "HV", "Gain" et "Offset" pour chaque canal d'acquérir des images qui ont la gamme dynamique la plus élevée des valeurs de gris.
        NOTE: Les valeurs spécifiques de ces paramètres doivent être déterminées empiriquement. «HV» permet de régler la tension sur le détecteur pour changer sa sensibilité, "Offset" ajuste le signal de sortie du détecteur et «gain» multiplie le signal de sortie du détecteur par un facteur constant.
      9. Appuyez sur Ctrl + H pour visualiser les images acquises par le biais d'une table de consultation (HiLo) qui identifie la sous-saturée (apparaissent en bleu) et plus saturée pixels (apparaissent en rouge), qui tous deux devraient généralement être évités. Re-évaluer la puissance du laser pertinente line / s et les paramètres de détection.
        REMARQUE: L' utilisation de puissance laser élevée et des niveaux élevés de la "HV" du détecteur conduira à plus de signal. puissance du laser supérieur sera toutefois conduire à une augmentation de blanchiment et de photo-toxicité. L'augmentation de la "HV" conduira à une augmentation du bruit. Par conséquent, un compromis doit être trouvé lors de la mise puissance du laser et "HV" pour acquérir des images avec des niveaux acceptables de bruit tout en empêchant la photo-dommages (voir également le tableau 1).
      10. Collecter des images à partir d'un volume défini en se concentrant sur les limites supérieure et inférieure de la zone d'intérêt. Dans le "Réglage Acquisition" fenêtre, cliquez sur le "End Set" et "Start Set" set boutons de la fenêtre z-stack à la limite supérieure et inférieure du volume à imager. Sélectionnez une taille de pas qui est la moitié de la résolution z pour l'objectif donné (par exemple., Si z la résolution est de 2 pm choisir 1 pm). Pour déterminer le z-résolution de l'objectie cliquez sur le bouton avec le symbole de l'information ( "i") dans la fenêtre "Image Acquisition Control".
      11. Mettre en place une série de temps pour recueillir z-piles à une fréquence temporelle qui est approprié pour la dynamique de la structure subcellulaire imagée. Dans le "TimeScan" sous-fenêtre entrer la fréquence à laquelle z-piles devraient être acquises ( "Interval" ') et le nombre de fois les images doivent être acquises ( «Num»).
      12. Cliquez sur la "profondeur" et boutons "Time" dans la fenêtre "Image Acquisition Control" pour confirmer que z-stack et le temps de la série seront acquises. Enfin, cliquez sur le bouton "XYZT" pour commencer l'acquisition d'images en accéléré.
      13. Après l'achèvement de l'acquisition d'images, d'observer "Série Fait" sur l'interface du logiciel. Cliquez dessus et enregistrer les images en format "OIB" pour enregistrer les images et les métadonnées qui leur sont associées.
        NOTE: Les images obtenues sur lemicroscope à champ large et microscope confocal peuvent être visualisées et analysées à l'aide de logiciels tels que FIDJI, un domaine public programme de traitement d'image libre.

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Representative Results

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Ici, l'utilisation du grand champ et la microscopie confocale à la mitochondrie et centrosomes dans la vie des embryons de poisson zèbre image est directement comparé et contrasté. En fonction de la localisation des cellules dans lesquelles la dynamique des organites doivent être examinés et que la fréquence inhérente des événements subcellulaires spécifiques, en général, soit à grand champ ou la microscopie confocale est le meilleur choix. Nous imagé organites dans les neurones RB situés sur la surface de l'embryon et dans les cellules de la rétine situés en profondeur. La localisation superficielle des neurones RB ainsi que leur géométrie à deux dimensions en font de bons candidats pour être imagé par les deux à grand champ et par microscopie confocale (figure 2). L' acquisition d' images à l' aide de la microscopie confocale est cependant nettement plus lente et peut conduire à une sous - estimation de la dynamique des événements intracellulaires spécifiques (par exemple, le mouvement des mitochondries, la figure 2C, D (figure 3).

Pour permettre la visualisation simultanée des organelles et des membranes cellulaires, nous avons utilisé le système Gal4-UAS dans trois configurations différentes. Tout d' abord, la ligne de journaliste UAS MitoFish Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6 a été utilisé. Ici, un UAS bidirectionnel permet l'expression concomitante de PCP mitochondries ciblée et de la membrane YFP ciblée. En combinaison avec les lignes d'excitateurs Gal4 appropriés MitoFish étiqueter les mitochondries et les membranes cellulaires des neurones sensoriels RB (figure 2A-C) ou des cellules de la rétine (figure 3A, B) avec CFP et YFP r espectively. Deuxièmement, deux UAS construit (UAS: mitoCFP et UAS: MA-YFP) ont été combinés avec un pilote construction Gal4 (Sensory: Gal4-VP16, éléments sensoriels spécifiques des neurones activatrices du gène islet-1) 7 en injections transitoires. L'expression mosaïque qui résulte généralement de ces injections a permis le suivi des cellules individuelles au fil des jours (figure 2E). Une troisième approche employée l'utilisation de deux cassettes UAS, entraînant chacun l'expression d'une protéine de fusion différente, sur une construction unique contiguë. Cette stratégie a été utilisée pour générer CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) tum1, dans lequel une fusion centrin4-YFP étiquettes centrosomes et Cerulean est ciblée sur les membranes cellulaires. En combinaison avec des lignes spécifiques du pilote Gal4 centrosomes et les membranes cellulaires des cellules de la rétine (figure 3C, D) ou les fibres musculaires (figure 4) sont marqués.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 2
Figure 2: Imagerie mitochondries in vivo dans les neurones sensoriels RB de zebrafish embryonnaire.
Neurones sensoriels RB dans la partie caudale du pli fin de 2 dpf MitoFish ont été imagés au moyen d' un objectif 40x apochromat eau-trempage-cône avec un NA de 0,80, soit par grand champ (A) ou confocal (B) la microscopie. Panneaux au détail montrent droit de la région décrite. C Large champ images time-lapse d'une petite région d'intérêt dans l'axe périphérique d'un neurone RB dans 2 dpf MitoFish. Le mouvement d'une seule mitochondrie (flèche dans 0 '') a été suivi de plus de 100 sec; six points de temps sont affichés. La position de la mitochondrie dans le temps point précédent est décrit en magenta. D La position de la mitochondrie se déplaçant dans C E images confocale d'un neurone sensoriel RB à 2 et 3 dpf. Étiquetage des cellules RB individuelles et leurs mitochondries a été réalisée par co-injection d'un pilote Gal4 spécifique des neurones sensoriels construire ensemble avec deux constructions UAS rapporteurs, UAS: mitoCFP et UAS: MA-YFP, au stade d'une cellule et le dépistage des isolés doubles cellules. marqués au L'image est inversée contraste et les mitochondries individuels sont représentés schématiquement sous forme de points magenta. Barre d' échelle A, B 20 pm, C 2 pm,E 50 um. Mitochondrie ciblée CFP (mitoCFP), membrane ciblée YFP (MA-YFP). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Comparaison de grand champ et la microscopie confocale à des organites d'image in vivo de la rétine du poisson zèbre embryonnaire.
Otx2 éléments promoteurs conduisent l'expression de la PCP dans les mitochondries et YFP dans les membranes cellulaires (A et B) ou YFP dans centrosomes et Cerulean dans les membranes cellulaires (C et D) dans la rétine de 2 dpf embryons de poisson zèbre. Pour ce motif d'étiquetage, Otx2: poissons transgéniques Gal4 ont été soit croisés pour MitoFish (A et B) or CentrinFish (C et D). Un objectif de apochromat 40x eau-trempage-cône (NA 0,80) a été utilisé pour acquérir des images de la même région dans chaque rétine à l' aide de grand champ (A, C) et confocal (B, D) la microscopie. Insets en A et B montrent le détail d'une région de la couche nucléaire interne, d' insertions en C et D montrent une cellule dans M-phase. Barre d'échelle 20 um. Mitochondrie ciblée CFP (mitoCFP), membrane ciblée YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), membrane ciblée Cerulean (MA-Cerulean). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Comparaison de grand champ et Microsc confocalopier à centrosomes d'image in vivo.
Une seule fibre musculaire avec fluorescence marqué les membranes cellulaires et centrosomes (Otx2: Gal4; CentrinFish) a été imagées en utilisant grand champ (A) et confocal (B) microscopie. Dans les deux cas, un objectif de apochromat 40x eau-trempage-cône (NA 0,80) a été utilisé. Barre d'échelle 10 um. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), la membrane cible Cerulean (MA-Cerulean) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Ici, nous démontrons la polyvalence du système d'expression Gal4-UAS aux mitochondries tag fluorescence, centrosomes et les membranes cellulaires de types cellulaires spécifiques in vivo dans des embryons de poisson zèbre. De nombreuses protéines de fusion fluorescentes qui marquent les autres organites ou structures sous - cellulaires peuvent être trouvés dans la littérature et peuvent être obtenus auprès du laboratoire respectif, les sources commerciales ou des dépôts de plasmides non commerciaux (par exemple, Addgene). Pour concevoir une nouvelle protéine de fusion fluorescente, plusieurs paramètres doivent être pris en considération, y compris ce qui FP à utiliser et si pour faire fondre la FP à l'extrémité amino ou carboxy-terminale de la protéine d'intérêt. Pour une discussion plus approfondie sur la génération de protéines de fusion fluorescentes, les lecteurs sont appelés articles en profondeur sur le sujet 49-51.

Nous mettons en évidence trois stratégies pour réaliser la co-expression de protéines de fusion à l'aide de la SAMU axée sur les transgènes. Multiple, separate UAS constructions rapporteurs permettent de combiner différents journaliste existant construit sans la nécessité pour le clonage supplémentaire. les niveaux d'expression de rapporteur peuvent également être titrés de façon indépendante. Cependant, des niveaux plus élevés de co-expression sont obtenus lorsque soit plusieurs cassettes UAS ou une cassette UAS bidirectionnel sur une seule construction sont utilisés. Depuis MF sont utilisées comme balises, il est relativement facile de vérifier la co-expression. Il convient de noter que d' autres procédés pour l' expression de plusieurs cistronique existent également, notamment l'utilisation de sites d'entrée ribosomiques internes 40 et les peptides viraux 2A 52,53. En guise d'alternative à des constructions à base d' ADN, transcrit in vitro coiffé ARNm peut être utilisé pour exprimer des protéines de fusion fluorescente pour marquer des structures subcellulaires 1,4,8. La mise en garde de cette approche est cependant que l'expression est limitée aux premiers jours de développement et ne sont pas cellule ou un tissu spécifique. Quelle que soit la méthode choisie pour exprimer des protéines de fusion, il est essentielveiller à ce que les niveaux d'expression ne conduisent pas à l'étiquetage non spécifique et compromettent l'état physiologique des cellules. A cet égard, l'amplification de l' expression du gène rapporteur inhérent au système Gal4-UAS 27 peut être problématique, se manifestant par exemple que le marquage cytosolique même lorsque le FP est destiné à un organite spécifique. Lorsqu'ils sont disponibles, les anticorps doivent être utilisés pour vérifier que les motifs d'expression obtenus par des protéines de fusion correspondent à la situation endogène. Dans certains cas, l'injection de faibles concentrations (ER) d'ADN pourrait atténuer le problème de la mauvaise localisation de la protéine de fusion. Alternativement, les vecteurs avec un faible nombre de répétitions UAS pourraient aider à titrez bas niveaux d'expression du transgène 30. De même, pour l'activateur Gal4-VP16, des versions modifiées existent, qui sont signalés à conduire l' expression relativement faible et sont donc moins toxiques 30,33. Si une mauvaise localisation de la protéine de fusion persiste en dépit des efforts pour titrer down niveaux d'expression du transgène, il peut être nécessaire de renoncer au système Gal4-UAS et conduire l'expression par des éléments de promoteur directement.

Les lignées transgéniques stables, MitoFish 10 et 12 CentrinFish, nous décrivons dans ce manuscrit ont été faites en utilisant des cassettes 14xUAS. Nous maintenons ces lignes dans l'arrière - plan des lignes de pilote Gal4 pour détecter des altérations de l'expression au fil des générations, puisque les lignes de journaliste avec de multiples répétitions de la SAMU ont été signalés à être enclin à faire taire 54. On n'a pas vu la preuve de silence au cours des 3 générations , nous propagés le CentrinFish. Cependant , nous avons vu l' expression variée dans MitoFish et donc sélectionner rigoureusement les embryons avec de solides niveaux «pleins», d'expression de se propager pour les générations futures. La littérature actuelle suggère que les vecteurs d'expression avec des répétitions 5xUAS pourraient être une alternative pour générer des lignées transgéniques stables - le journaliste estconduit à des niveaux suffisamment élevés 30 et le nombre relativement faible de UAS répète peut le rendre moins enclins à transgène silencieux, bien que les répétitions UAS non répétitives sont censément encore moins sensibles 54.

La palette des MF actuellement disponibles pour organites tag ou d' autres structures subcellulaires est très large 55. Lors du choix d'un FP particulier comme une étiquette, il faut tenir compte des paramètres suivants: Premièrement, l'excitation et l'émission des spectres de la FP pour déterminer la ligne de laser spécifique ainsi que les filtres d'excitation et d'émission nécessaires à sa visualisation. Deuxièmement, la luminosité et la photo-stabilité de la FP. Troisièmement, la rapidité avec laquelle le FP mûrit la traduction suivante. Quatrièmement, si le FP a une tendance à l'agrégation de fusions. En ce qui concerne le dernier paramètre, il faut faire attention et des expériences de contrôle doit être fait pour tester la pertinence de chaque FP pour des expériences spécifiques. Par exemple, alors que la red MF mCherry et DsRed sont largement utilisés, ils forment des agrégats auraient dans certains fusions 56. Nous avons trouvé TagRFP-T 57, une variante plus de photo-stable de TagRFP, de bien performer lorsqu'il est ciblé vers les mitochondries et les membranes cellulaires (observations non publiées). Lorsque plusieurs organelles ont besoin d'être visualisé de manière concomitante, PCR avec des spectres sans chevauchement doit être utilisé. Nous avons utilisé avec succès des combinaisons de cyan vps (PCP et Cerulean) et YFP (figures 2-4). En exploitant toute la gamme spectrale du bleu à l' infrarouge proche, on peut élargir considérablement le nombre de structures intracellulaires qui peuvent être simultanément visualisées 2. Outre les PC conventionnels, MF photo-activable sont particulièrement utiles pour sonder la dynamique des organites, par exemple, l'utilisation de la FP Kaede pour suivre le sort des mitochondries individuelle 58.

Quelle microscopie technique - grand champ ou confocale - est le plusappropriée pour l'imagerie dépend d'un certain nombre de facteurs, y compris l'emplacement des cellules à imager et la rapidité avec laquelle sont attendus des événements intracellulaires ou cellulaires spécifiques de se produire. La microscopie à champ large est la modalité préférée dans des endroits superficiels et des échantillons faiblement marqués. Il offre une faible photo-toxicité et l'imagerie à grande vitesse à un prix raisonnable. Cependant, si l'imagerie doit être effectuée dans des parties non superficielles du poisson zèbre dans des échantillons fortement marqués ou pour obtenir des informations en trois dimensions, confocale ou d'une autre forme de microscopie optique devient le sectionnement méthode de choix.

Quelle que soit la structure cellulaire ou subcellulaire est surveillé, il y a souvent un compromis entre l'acquisition de la meilleure image possible et de garder l'échantillon vivant et en bon état physiologique pour répéter l'imagerie time-lapse. Photo-toxicité peut se manifester par des changements dans le comportement des organites, la morphologie aberrante de cellules ou même celluledécès. La clé de la réduction de photo-blanchiment et photo-toxicité pour les deux grand champ et la microscopie confocale est d'utiliser les plus bas niveaux possibles de lumière pour acquérir des images. À cet égard, les objectifs avec le plus haut possible NA sont essentiels pour maximiser la quantité de signal fluorescent qui peut être recueilli. Pour la microscopie confocale, un certain nombre de paramètres peuvent être ajustés pour compenser l'utilisation d'une puissance laser plus faible. Les détecteurs avec un rendement quantique supérieur par rapport aux PMT classiques, par exemple, l' arséniure de gallium détecteurs de phosphure, peuvent être utilisés pour faire en sorte que les photons émis sont plus susceptibles d'être détectées. En variante ou en plus, des tensions plus élevées de dynodes peuvent être appliqués dans le PMT pour augmenter la sensibilité des détecteurs. L'ouverture confocale (sténopé) peut être ouvert pour permettre la collecte de plus de signal fluorescent, bien qu'avec une perte de résolution axiale. Exposer les échantillons à la lumière aussi peu que possible, le balayage doit être effectué à des vitesses élevées de telle sorte que le temps de séjourle laser par pixel est faible. La numérisation à une résolution spatiale inférieure a également pour effet d'augmenter la vitesse de numérisation. Imaging a moins souvent l'avantage supplémentaire d'exposer l'échantillon à moins de lumière, mais ne devrait être envisagée que si elle ne compromet pas l'échantillonnage complet des processus étudiés.

Comme alternative, disques filature microscopes confocaux et des microscopes confocaux qui sont équipés d'un soi-disant scanner 'résonance' offrent la possibilité pour la numérisation rapide. Les deux modalités ont l'avantage qu'ils sont plus rapides et moins microscopes confocaux, points de balayage «classique» photo-toxique que. Cependant, disques filature microscopes confocaux sont plus limitées dans z-résolution et ne peuvent pas pénétrer aussi profondément dans les tissus que les microscopes point confocal à balayage. De même, l'application de résonance-scanner microscopes confocaux peut être limité que le pixel très court temps de séjour va aboutir à une qualité d'image qui pourrait,à son tour, empêche la détection d'événements sub-cellulaires (par exemple, des images binaires avec une réduction de signal à bruit).

Enfin, si grand champ et l' imagerie confocale sont mis en évidence ici, d' autres formes de microscopie optique tels que deux photons 59 et la lumière de la fiche microscopie 60 pourrait être plus approprié pour des questions spécifiques. La microscopie biphotonique est basée sur l'excitation d'un fluorophore par l'absorption simultanée de deux photons dans le domaine infrarouge du spectre lumineux. En commun avec la microscopie confocale, il utilise l'analyse du point d'acquérir des images à partir de l'échantillon et possède des capacités de coupes optiques en vertu de la non-linéarité de excitation à deux photons. L'utilisation d'une longue lumière de longueur d'onde pour fluorophore excitation permet l'imagerie à des profondeurs de plusieurs centaines de microns de la surface. En outre, la limitation de l'excitation à un faible volume d'imagerie empêche la photo-blanchiment et de photo-toxicité en dehors du plan focal. Cependant, tous les PFs ont une forte absorption multiphotonique sections transversales, un problème qui prévaut notamment en rouge MF. En outre, la recherche d'une seule longueur d'onde infrarouge pour exciter simultanément MF distinctes multiples est difficile, ce qui rend l'imagerie multi-canal encombrant. Light-feuille au microscope utilise une mince 'feuille' (typiquement épaisseur allant de 2 à 10 pm) de la lumière laser pour exciter l'échantillon et détecte les signaux de fluorescence de ce plan focal lumineux à un angle perpendiculaire à l'aide d'une caméra sensible. sectionnement optique est obtenue en éclairant un seul plan à la fois. Cette restriction de la lumière d'excitation réduit l'apparition de la photo-toxicité. Comme les signaux de fluorescence de l'ensemble du plan lumineux sont collectées simultanément, l'acquisition d'image est nettement plus rapide que le point de balayage confocale et microscopes multiphotonique. Toutes ces caractéristiques font la lumière feuille microscopie particulièrement adaptée à l'imagerie des événements cellulaires dynamiques avec une résolution spatiotemporelle élevéede grands volumes d'échantillons vivants. En effet, en utilisant la lumière feuille sort de la cellule de microscopie dans tout embryon de poisson zèbre a été complètement suivi pendant les 24 premières heures du développement 61. Avec l' amélioration continue de mieux 62,63 de pénétration de l' imagerie et la résolution spatiale 64, il est concevable que la lumière de la fiche microscopie sera utilisé pour sonder la dynamique non seulement au niveau cellulaire , mais aussi au niveau subcellulaire dans des embryons de poisson zèbre entiers.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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References

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Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish
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Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

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