Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.
In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.
L'imagerie in vivo fournit une visualisation directe des comportements cellulaires dans le contexte le plus physiologique. La transparence des embryons de poisson zèbre, leur développement rapide et externe et un riche éventail d'outils génétiques qui permettent l' étiquetage fluorescent ont tous contribué à l'utilisation croissante de la microscopie in vivo pour élucider la dynamique des événements clés du développement. Les études d'imagerie de développement du système nerveux chez le poisson zèbre ont par exemple considérablement élargi notre connaissance du comportement des cellules progénitrices neurales et le sort de leur progéniture , y compris leur migration ultérieure, la différenciation et l' intégration du circuit 1-8.
Le décor est désormais planté pour étudier la dynamique subcellulaire qui sous-tendent ces comportements cellulaires. En effet, le poisson zèbre sont déjà exploitées comme des outils pour in vivo la biologie cellulaire. Il est maintenant possible de visualiser les mitochondries 9-11, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15Le cytosquelette d' actine et microtubules 4 16, 17 endosomes et les composants de la membrane apicale complexe 1,18, entre autres structures sous – cellulaires dans les embryons de poisson zèbre in vivo. Jusqu'à présent, une grande partie de ce qui est connu sur la fonction de ces organites vient d'étudier leur comportement dans les cellules cultivées. Bien que des études in vitro ont donné un remarquable aperçu de la biologie cellulaire, les cellules en culture ne représentent pas pleinement la complexité de la situation in vivo et ne reflètent donc pas nécessairement la fonction et la dynamique des organites intracellulaires in vivo. Embryons de poisson zèbre offrent une solution viable en alternative vivo d'étudier la dynamique subcellulaire.
Comme les vertébrés, le poisson – zèbre possède de nombreux systèmes d'organes (par exemple, la rétine neurale) qui sont homologues à celles trouvées chez les espèces de mammifères. En outre, les embryons de poisson zèbre sont de plus en plus utilisés pour modéliser les maladies humaines 19,20 </sup>, y compris ceux qui sont liés à la fonction centrosomale (par exemple, microcéphalie 21 et amaurose 22 congénitale de Leber) et de la fonction mitochondriale (par exemple, la maladie de Parkinson 23, tauopathies 10,24 et le syndrome de Barth 25). imagerie in vivo au niveau cellulaire et subcellulaire dans ces cas, permettra une meilleure compréhension de la biologie des cellules sous-jacentes de ces états pathologiques.
L'objectif général des méthodes décrites ici est de fournir un guide complet pour enquêter sur les organites et d' autres structures subcellulaires dans les embryons de poisson zèbre en utilisant la microscopie optique in vivo. L'ensemble du flux de travail impliqués dans la visualisation et le suivi des structures intracellulaires in vivo est décrit – des approches d'étiquetage génétiques, de générer transitoirement exprimer et de poissons transgéniques stables, et enfin à l' imagerie utilisant grand champ et la microscopie confocale. Bien que chacun de ces procedures est utilisé par de nombreux laboratoires de poisson zèbre, les protocoles décrits sont optimisés et rationalisés pour étudier la dynamique des structures subcellulaires. Deux aspects spécifiques des travaux décrits ici méritent mention: Tout d'abord, l'utilisation du système d'expression Gal4-UAS dans de multiples configurations pour génétiquement organites d'étiquettes dans types cellulaires spécifiques. Deuxièmement, une comparaison directe de grand champ et la microscopie confocale à des structures subcellulaires d'image in vivo.
Les stratégies actuelles pour modifier génétiquement des organites d'étiquettes et autres structures sous – cellulaires chez le poisson zèbre , soit utiliser des ARNm coiffés 1,4,8 ou des constructions d'ADN sur la base , où les éléments promoteurs entraînent directement l'expression des protéines de fusion 9,14,15 transcrit in vitro coiffé résultats d'ARN in. rapide et large expression, ce n'est pas spécifique du tissu cependant. En outre, les niveaux d'expression diminuent au fil du temps que l'ARN coiffé est dilué ou dégradé. Ainsi, l'utilisation d'ARN à base deconstruit pour examiner la dynamique des organites à des stades ultérieurs de développement est limitée (généralement jusqu'à 3 jours après la fécondation).
Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant des constructions d'ADN, où le contrôle spatial et temporel d'expression est déterminé par des éléments spécifiques du promoteur. Quand les constructions d'ADN sur la base sont utilisés dans le contexte du système Gal4-UAS des améliorations significatives des niveaux d'expression du transgène sont observées 26,27. Dans ce système d'expression bipartite éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l'expression d'un activateur de transcription de Gal4, tandis que les gènes rapporteurs sont clonés en aval de la séquence d'activation en amont Gal4 de liaison (UAS). En combinant UAS journalistes avec les pilotes Gal4 appropriés, l'expression peut être limitée aux types cellulaires spécifiques, contourner la nécessité de cloner des gènes rapporteurs derrière des promoteurs différents à chaque fois un motif d'expression spécifique est souhaitée. En outre, l'expression de multiples gènes rapporteurs UAS peut êtreentraînés par un seul activateur de Gal4. Le système Gal4-UAS fournit donc une approche génétique polyvalent et flexible pour l'étiquetage subcellulaire.
Grand champ et microscopes confocaux sont les chevaux de bataille de la plupart des laboratoires. Les systèmes à grand champ utilisent généralement une lampe à arc en tant que source de lumière et détecter la lumière émise par une caméra sensible qui est placé à l'extrémité du trajet lumineux. Cette modalité d'imagerie est généralement limitée à des échantillons minces comme hors de la lumière de mise au point obscurcit les informations de mise au point dans des échantillons plus épais. Microscopes confocale diffèrent des systèmes à champ large en ce qu'ils sont construits pour favoriser les signaux qui proviennent du plan focal par rapport à ceux qui sont originaires de mise au point ( par exemple, «sectionnement optique») 28. Pour réaliser un sectionnement optique à sténopé est placée dans le chemin d'émission dans une position conjuguée à la source de lumière ponctuelle. Les lasers sont utilisés en tant que sources de lumière et les signaux sont détectés avec des tubes photomultiplicateurs (PMT). Pratiquement, un laserfaisceau est glissée sur l'échantillon point par point et l'émission de fluorescence à chaque point (pixel) est détecté par le PMT.
Ici, nous l'image les mêmes structures subcellulaires dans la vie des embryons de poisson zèbre utilisant à la fois grand champ et la microscopie confocale pour fournir une comparaison directe des deux modalités de microscopie. L'objectif sous-jacent de fournir de telles comparaisons est d'offrir des lignes directrices pour le choix technique de microscopie la plus appropriée pour la question spécifique à portée de main.
En utilisant les approches décrites ici, nous démontrons Gal4-UAS étiquetage génétique basée des mitochondries et centrosomes. Ces organites sont imagés dans différents types de cellules du système nerveux et dans les cellules musculaires en utilisant grand champ et la microscopie confocale à démontrer la pertinence de chaque modalité d'imagerie. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour enquêter sur d'autres organites et des structures subcellulaires dans l'embryon de poisson zèbre vivant.
Ici, nous démontrons la polyvalence du système d'expression Gal4-UAS aux mitochondries tag fluorescence, centrosomes et les membranes cellulaires de types cellulaires spécifiques in vivo dans des embryons de poisson zèbre. De nombreuses protéines de fusion fluorescentes qui marquent les autres organites ou structures sous – cellulaires peuvent être trouvés dans la littérature et peuvent être obtenus auprès du laboratoire respectif, les sources commerciales ou des dépôts de plasmides non commerci…
The authors have nothing to disclose.
P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.’s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich “Molecular Mechanisms of Neurodegeneration” (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 “Assembly and Function of Neuronal Circuits”, Project A11.
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich – DZNE) for contributing to the development of MitoFish.
Agarose (2-hydroxyethylagarose) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Low-gelling temperature Type VII |
Block heater | Eppendorf | Thermomixer compact | |
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996% | Aldrich | 202967-50g | To prepare 30x Danieau's |
CCD camera | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps | Dumont – Fine Science Tools | 11252-50 | #5 Forceps |
Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000 Fluoview | |
Culture dish heater | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Heating ring |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt | Fluka Analytical | A5040-100G | Tricaine (anesthetic) |
Fluorescence dissecting microscope | Leica | M205 FA | |
GeneClean kit | MP Biomedicals | 111001200 | |
Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | 35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass |
Glass needles | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | For microinjections |
HEPES | Sigma | H3375-250g | To prepare 30x Danieau's |
High vacuum grease | Dow Corning | DCC000001242 150g | Silicon dioxide grease |
Incubator | Thermo Scientific | Heraeus | To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C |
KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | To prepare 30x Danieau's |
MgSO4.7H2O Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent | Sigma-Aldrich | 230291-500g | To prepare 30x Danieau's |
Microinjector | Eppendorf | FemtoJet | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | 0.5-20uL |
Micromanipulator | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
Micropipette holder | Intracel | P/N 50-00XX-130-1 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | To transcribe PCS-Transposase |
NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | To prepare 30x Danieau's |
Nanophotometer | To measure DNA/RNA concentration | ||
Needle puller | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
NIR Apo 40x/0.80W | Nikon | Water-dipping-cone objective | |
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (prevents pigmentation) |
Petri dishes | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
Plastic molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | For microinjections |
Plexiglas cover-with a hole | Custom-made | The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective | |
Tea-strainer (Plastic) | To collect zebrafish eggs | ||
Temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Dual Automatic Temperature Controller |
Transfer pipettes | Sarstedt AG | 86.1171 | 3.5mL plastic transfer pipettes |
UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
UMPlanFLN 20x/0.50W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
Widefield microscope | Olympus | BX51WI | |
PTU (50x Stock) | Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
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Tricaine (20x Stock) | Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7 Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
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Danieau's Solution (30x Stock) | 1740 mM NaCl <21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM HEPES buffer Distilled water upto 1 L Store at 4 oC Use at 0.3x working solution |