Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.
In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.
In – vivo – Bildgebung bietet eine direkte Visualisierung von zellulären Verhalten in der die meisten physiologischen Kontext. Die Transparenz der Genaktivität, deren schnelle und externe Entwicklung und eine reiche Auswahl an genetischen Werkzeugen , die Fluoreszenz – Markierung ermöglichen , sind alle auf den wachsenden Einsatz von In – vivo – Mikroskopie beigetragen , die Dynamik der wichtigsten Entwicklungsereignisse aufzuklären. Imaging – Studien von Entwicklung des Nervensystems in Zebrabärbling haben zum Beispiel unser Wissen über das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen und das Schicksal ihrer Nachkommen einschließlich ihrer späteren Migration erweitert, Differenzierung und Schaltungsintegration 1-8.
Die Bühne ist nun eingestellt, die subzellulären Dynamik zu untersuchen, diese zellulären Verhaltensweisen zugrunde liegen. Tatsächlich sind, Zebrabärbling bereits als Werkzeuge werden für die in vivo Zellbiologie ausgebeutet. Es ist nun möglich , die Mitochondrien zu visualisieren 9-11, Zentrosomen 2,8,12-14, Golgi 15, Die Mikrotubuli 4 und Aktin – Zytoskelett 16, Endosomen 17 und Komponenten des Apikalmembran komplexen 1.18 unter anderem subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo. Bisher viel von dem, was über die Funktion dieser Organellen bekannt ist, kommt von ihrem Verhalten in kultivierten Zellen zu studieren. Während in – vitro – Studien enormen Einblick in die Zellbiologie ergeben haben, Zellen in Kultur repräsentieren nicht vollständig die Komplexität der in vivo – Situation und daher nicht notwendigerweise die Funktion und Dynamik subzellulärer Organellen in vivo widerspiegeln. Zebrabärbling – Embryonen bieten eine tragfähige in vivo alternative subzellulären Dynamik zu untersuchen.
Da Vertebraten besitzen Zebrabärbling viele Organsysteme (beispielsweise neurale Netzhaut), die mit denen in Säugetierspezies gefunden homolog sind. Zusätzlich werden Genaktivität zunehmend eingesetzt, um menschliche Krankheiten zu modellieren 19,20 </snach oben> (Mikrozephalie 21 und Leber 22 kongenitale Amaurose zB) einschließlich und auf die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit zentrosomalen Funktion (zB Parkinson – Krankheit 23, Tauopathies 10,24 und Barth – Syndrom 25). In – vivo – Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene in diesen Fällen wird ein besseres Verständnis der Zellbiologie erlauben diese pathologischen Zustände zugrunde liegen.
Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methoden ist es, eine umfassende Anleitung zur Verfügung zu stellen Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo Lichtmikroskopie zu untersuchen. Der gesamte Arbeitsablauf beteiligt bei der Visualisierung und Verfolgung von subzellulärer Strukturen in vivo beschrieben – von der genetischen Markierung Ansätze zur Erzeugung von transiente Expression und stabile transgene Fische und schließlich mit großem Feld und konfokale Mikroskopie auf Bildgebung. Während jedes dieser procedures von zahlreichen Zebrabärbling Laboratorien verwendet wird, die beschriebenen Protokolle werden optimiert und rationalisiert für die Dynamik subzellulärer Strukturen zu untersuchen. Zwei spezifische Aspekte der Arbeit hier beschriebenen rechtfertigen erwähnt: Erstens, die Verwendung des Gal4-UAS-Expressionssystems in verschiedenen Konfigurationen zu genetisch Etikett Organellen in bestimmten Zelltypen. Zweitens ist ein direkter Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild subzellulärer Strukturen in vivo.
Aktuelle Strategien zur genetisch Label Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrabärbling entweder nutzen verkappte mRNA 1,4,8 oder DNA – basierte Konstrukte , wo Promotorelemente , die Expression von Fusionsproteinen 9,14,15 direkt fahren. In vitro transkribierten RNA gekappt Ergebnisse in schnelle und breite Ausdruck, das ist aber nicht gewebespezifisch. Zusätzlich verringern Expressionsniveaus im Laufe der Zeit als das verkappte RNA verdünnt wird oder abgebaut. Somit ist die Verwendung von RNA-basiertenKonstrukte zu Organell Dynamik in späteren Stadien in der Entwicklung beschränkt ist (in der Regel bis zu 3 Tage nach der Befruchtung) untersuchen.
Diese Einschränkungen können durch die Verwendung von DNA-Konstrukten überwunden werden, wo räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression durch spezifische Promotorelemente bestimmt wird. Wenn DNA – Konstrukte basieren in Kontext der Gal4-UAS – System wesentliche Verbesserungen an Transgen – Expressionsniveaus verwendet werden , werden 26,27 beobachtet. In diesem bipartite Expressionssystem, Zelltyp-spezifische Promotorelemente treiben, die Expression eines Transkriptionsaktivators Gal4, während Reportergenen stromabwärts von der Gal4-Bindungsstromaufwärts Aktivierungssequenz kloniert werden (UAS). Durch UAS Reporter mit entsprechenden Gal4 Treiber kombinieren, können die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränkt werden, wodurch die Notwendigkeit umgangen werden jedes Mal zu klonen Reportergene hinter verschiedenen Promotoren eine spezifische Expressionsmuster gewünscht wird. Des Weiteren kann die Expression mehrerer UAS Reportergene seindurch einen einzigen Gal4 Aktivator angetrieben. Das Gal4-UAS-System stellt somit ein vielseitiges und flexibles genetischer Ansatz für subzelluläre Kennzeichnung.
Breitfeld und konfokale Mikroskope sind die Arbeitstiere der meisten Laboratorien. Weitfeldsysteme typischerweise eine Bogenlampe als Lichtquelle verwenden, und das emittierte Licht mit einer empfindlichen Kamera erkennen, die am Ende des Lichtweges angeordnet ist. Diese Bildgebungsverfahren wird in der Regel auf dünne Proben beschränkt, wie Out-of Fokus Licht verschleiert im Fokus befindlichen Informationen in dickeren Proben. Die konfokale Mikroskope unterscheiden sich von Weitfeld – Systemen dadurch , dass sie gebaut werden Signale zu bevorzugen , die von der Fokusebene über diejenigen , die ihren Ursprung außerhalb des Fokus (dh "optischen Schneidens") 28 stammen. Zu erreichen optischen Schneidens wird ein Pinhole im Emissionspfad in einer konjugierten Position zu der Punktlichtquelle angeordnet. Laser werden als Lichtquellen verwendet, und Signale werden mit Photomultipliern (PMTs) nachgewiesen. Praktisch wird ein LaserStrahl über die Probe Punkt-für-Punkt und der Fluoreszenzemission bei jedem Punkt (Pixel) swiped von der PMT detektiert wird.
Hier Bild, das wir die gleichen subzellulärer Strukturen in Genaktivität leben beide mit großem Feld und konfokaler Mikroskopie mit einem direkten Vergleich der beiden Mikroskopie Modalitäten zur Verfügung zu stellen. Die zugrunde liegende Ziel solcher Vergleiche der Bereitstellung ist es, Richtlinien zu bieten für die am besten geeignete Mikroskopietechnik für die spezifische Frage auf der Hand entschieden haben.
Mit Hilfe der beschriebenen Ansätze hier zeigen wir Gal4-UAS basiert die genetische Markierung der Mitochondrien und Zentrosomen. Diese Organellen sind in verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und in Muskelzellen abzubildenden Verwendung Weitfeld und konfokale Mikroskopie die Eignung jedes Bildgebungsmodalität zu demonstrieren. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht zur Untersuchung von anderen Organellen und subzellulären Strukturen im lebenden Zebrafischembryo angepasst werden.
Hier zeigen wir die Vielseitigkeit des Gal4-UAS – Expressionssystem zur fluoreszenz tag Mitochondrien Zentrosomen und die Zellmembranen von spezifischen Zelltypen in vivo in Zebrabärbling – Embryonen. Viele fluoreszierende Fusionsproteine , die andere Organellen oder subzellulärer Strukturen beschriften kann in der veröffentlichten Literatur zu finden und kann von dem jeweiligen Labor, kommerziellen Quellen oder nichtkommerziellen Plasmid Hinterlegungsstellen (zB Addgene) erhalten werden. Zu e…
The authors have nothing to disclose.
P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.’s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich “Molecular Mechanisms of Neurodegeneration” (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 “Assembly and Function of Neuronal Circuits”, Project A11.
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich – DZNE) for contributing to the development of MitoFish.
Agarose (2-hydroxyethylagarose) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Low-gelling temperature Type VII |
Block heater | Eppendorf | Thermomixer compact | |
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996% | Aldrich | 202967-50g | To prepare 30x Danieau's |
CCD camera | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps | Dumont – Fine Science Tools | 11252-50 | #5 Forceps |
Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000 Fluoview | |
Culture dish heater | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Heating ring |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt | Fluka Analytical | A5040-100G | Tricaine (anesthetic) |
Fluorescence dissecting microscope | Leica | M205 FA | |
GeneClean kit | MP Biomedicals | 111001200 | |
Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | 35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass |
Glass needles | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | For microinjections |
HEPES | Sigma | H3375-250g | To prepare 30x Danieau's |
High vacuum grease | Dow Corning | DCC000001242 150g | Silicon dioxide grease |
Incubator | Thermo Scientific | Heraeus | To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C |
KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | To prepare 30x Danieau's |
MgSO4.7H2O Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent | Sigma-Aldrich | 230291-500g | To prepare 30x Danieau's |
Microinjector | Eppendorf | FemtoJet | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | 0.5-20uL |
Micromanipulator | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
Micropipette holder | Intracel | P/N 50-00XX-130-1 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | To transcribe PCS-Transposase |
NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | To prepare 30x Danieau's |
Nanophotometer | To measure DNA/RNA concentration | ||
Needle puller | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
NIR Apo 40x/0.80W | Nikon | Water-dipping-cone objective | |
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (prevents pigmentation) |
Petri dishes | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
Plastic molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | For microinjections |
Plexiglas cover-with a hole | Custom-made | The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective | |
Tea-strainer (Plastic) | To collect zebrafish eggs | ||
Temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Dual Automatic Temperature Controller |
Transfer pipettes | Sarstedt AG | 86.1171 | 3.5mL plastic transfer pipettes |
UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
UMPlanFLN 20x/0.50W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
Widefield microscope | Olympus | BX51WI | |
PTU (50x Stock) | Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
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Tricaine (20x Stock) | Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7 Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
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Danieau's Solution (30x Stock) | 1740 mM NaCl <21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM HEPES buffer Distilled water upto 1 L Store at 4 oC Use at 0.3x working solution |