Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In vivo imaging ger direkt visualisering av cellulära beteenden på det mest fysiologiskt sammanhang. Öppenheten i zebrafisk embryon, deras snabba och extern utveckling och ett rikt utbud av genetiska verktyg som tillåter fluorescensmärkning har alla bidragit till den ökande användningen av in vivo mikroskopi för att belysa dynamiken i viktiga utvecklings händelser. Imaging studier av nervsystemets utveckling i zebrafisk har exempelvis kraftigt utökat vår kunskap om beteendet hos neurala stamceller och öde deras avkomma inklusive deras efterföljande migration, differentiering och krets integration 1-8.

Scenen är nu inställd på att undersöka subcellulära dynamik som ligger bakom dessa cellulära beteenden. Faktum är zebrafisk redan utnyttjas som verktyg för in vivo cellbiologi. Det är nu möjligt att visualisera mitokondrier 9-11, centrosom 2,8,12-14, Golgi 15, Mikrotubuli 4 och aktin 16 cytoskelettet, endosomer 17 och komponenterna i det apikala membranet komplexa 1,18, bland andra subcellulära strukturer i zebrafisk embryon in vivo. Hittills har mycket av vad som är känt om funktionen av dessa organeller kommer från att studera deras beteende i odlade celler. In vitro-studier har gett medan enorm inblick i cellbiologi, gör celler i odling är helt representativ för komplicerade situationen in vivo och därför inte nödvändigtvis återspeglar den funktion och dynamik subcellulära organeller in vivo. Zebrafisk embryon har en livskraftig in vivo alternativ till undersöker subcellulära dynamik.

Som ryggradsdjur, zebrafisk har många organsystem (t.ex. neurala näthinnan) som är homologa med de som återfinns i däggdjursarter. Dessutom är zebrafisk embryon alltmer för att modellera mänskliga sjukdomar 19,20 (t.ex. mikrocefali 21 och Lebers kongenitala amauros 22) och mitokondriefunktion (t.ex. Parkinsons sjukdom 23, tauopatier 10,24 och Barth syndrom 25). In vivo imaging på cellulär och subcellulär nivå i dessa fall kommer att möjliggöra en bättre förståelse av cellbiologi bakom dessa patologiska tillstånd.

Det övergripande målet för de metoder som beskrivs här är att ge en heltäckande guide för att undersöka organeller och andra subcellulära strukturer i zebrafisk embryon genom att använda in vivo ljusmikroskop. Hela arbetsflödet involverade i att visualisera och spåra subcellulära strukturer in vivo beskrivs - från genetiska märkningsmetoder, för att generera transient uttrycka och stabil transgen fisk, och slutligen till avbildning med brett fält och konfokalmikroskopi. Även om var och en av dessa procedures används av många zebrafisk laboratorier är protokollen optimerade och strömlinjeformad för att undersöka dynamiken i subcellulära strukturer. Två särskilda aspekter av det arbete som beskrivs här garanterar nämna: För det första, användningen av Gal4-UAS expressionssystem i flera konfigurationer för genetiskt etikettorgan i specifika celltyper. För det andra, en direkt jämförelse av brett fält och konfokalmikroskopi till bild subcellulära strukturer in vivo.

Nuvarande strategier för att genetiskt etikettorganeller och andra subcellulära strukturer i zebrafisk antingen utnyttja utjämnade mRNA 1,4,8 eller DNA-baserade konstruktioner där promotorelement direkt driva uttryck av fusionsproteiner 9,14,15. In vitro transkriberade utjämnade RNA resulterar i snabb och bred uttryck, som inte är vävnadsspecifik dock. Dessutom, uttrycksnivåer minska med tiden som det utjämnade RNA späds eller försämras. Således användningen av RNA baseradkonstruktioner att undersöka organell dynamiken i ett senare skede i utvecklingen är begränsad (vanligtvis upp till tre dagar efter befruktningen).

Dessa begränsningar kan övervinnas genom användning av DNA-konstruktioner, där rumsliga och tidsmässiga kontroll av uttryckning bestäms av specifika promotorelement. När DNA-baserade konstruktioner används i samband med de Gal4-UAS systemet betydande förbättringar av transgena expressionsnivåer iakttas 26,27. I detta tvåparts expressionssystem, cell typspecifika promotorelement driva expressionen av en transkriptionell aktivator Gal4, medan reportergener klonas nedströms om Gal4-bindande uppströmsaktiverande sekvensen (UAS). Genom att kombinera UAS reportrar med lämpliga Gal4 förare, kan uttryck begränsas till specifika celltyper, kringgår behovet att klona reportergener bakom olika promotorer varje gång ett specifikt uttryck mönster önskas. Vidare kan uttrycket av multipla UAS reportergener varadriven av en enda Gal4 aktivator. Gal4-UAS systemet ger således en mångsidig och flexibel genetiska tillvägagångssätt för subcellulär märkning.

Brett fält och konfokala mikroskop är arbetshästar i de flesta laboratorier. Wide-fält system använder typiskt en båglampa som ljuskälla och detektera det emitterade ljuset med en känslig kamera som är placerad vid änden av ljusvägen. Denna avbildning modalitet vanligtvis begränsad till tunna prover utanför fokus ljus döljer fokus information tjockare prover. Konfokala mikroskop skiljer sig från brett fält system genom att de är byggda för att gynna signaler som kommer från fokalplanet över dem som har sitt ursprung ur fokus (dvs "optisk sektionering") 28. För att uppnå optisk sektione ett nålhål placeras i banan emission i ett konjugat läge till punkten ljuskälla. Lasrar används som ljuskällor och signaler detekteras med fotomultiplikatorrör (PMT). Praktiskt, en lasertrålen dras över provet punkt-för-punkt och fluorescensemissionen vid varje fläck (pixel) detekteras av PMT.

Här har vi bild precis samma subcellulära strukturer i levande zebrafisk embryon med både brett fält och konfokalmikroskopi för att ge en direkt jämförelse mellan de båda mikroskopi formerna. Den underliggande syfte att ge sådana jämförelser är att erbjuda riktlinjer för att välja den mest lämpliga mikroskopi teknik för den specifika frågan till hands.

Med hjälp av metoder som beskrivs här visar vi Gal4-UAS baserad genetisk märkning av mitokondrier och centrosom. Dessa organeller är avbildade i olika celltyper i nervsystemet och i muskelcellerna med användning av brett fält och konfokalmikroskopi för att demonstrera lämpligheten hos varje avbildningsmodalitet. De metoder som beskrivs här kan lätt anpassas för att undersöka andra organeller och subcellulära strukturer i levande zebrafisk embryo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurförsök utfördes i enlighet med lokala föreskrifter av regeringen i Oberbayern (München, Tyskland).

1. Märkning organeller och andra subcellulära strukturer

OBS: Här genetisk reporter konstruktioner som fluorescerande tag centrosom, mitokondrier och cellmembran beskrivs.

  1. Använd konventionella kloningsmetoder 29 för att generera fusionsproteiner som fluorescerande märka centrosom och mitokondrier. Klona den kodande sekvensen av zebrafisk centrin4 (cetn4) i ram med ett fluorescerande protein 2 (FP), såsom Gul fluorescerande protein för att generera cetn4-YFP. Klona mitokondriell målsökningssekvensen av subenheten VIII av cytokrom c oxidas i ram med ett FP såsom Cyan fluorescerande protein för att generera mitoCFP 9-11.
  2. Att begränsa expression av fusionsproteinerna (cetn4-YFP eller mitoCFP) till specifika celler i zebrafish embryo (t.ex. nervceller eller muskelceller) använder den tvådelade Gal4-UAS expressionssystem 26,27. Först generera en UAS reporterkonstruktion. Använda konventionella metoder för att klona fusionsproteinet i en UAS expressionsvektor, nedströms om Gal4-bindande UAS kassetten (varianter sträcker sig från 1x till 14x UAS, se diskussion) 26,27,30 och en minimal promotor (E1b basala promotorn från karp βactin gen), och generera UAS: cetn4-YFP och UAS: mitoCFP.
    OBS: För att förbereda UAS reporter konstruktioner för stabil transgen linje generation ytterligare element måste klonas (se 3 nedan)
  3. Att visualisera cellulära sammanhang där centrosom eller mitokondrier är märkta, generera UAS reporter konstruktioner där cellmembran är märkta av ramprogrammen. Klona de första tjugo aminosyrorna av zebrafisk Gap43 (innehållande palmitoylering ställen) i ram med en FP att rikta att FP till cellmembranet (memFP) 31,32.
  4. Obtain drivrutins konstruktioner eller transgena linjer i vilka cell-typspecifika promotorelement driva uttrycket av den transkriptionella aktivatorn Gal4-VP16 27, Gal4FF 33 eller KalTA4 30.
  5. Kombinera UAS reporterkonstruktioner med en lämplig drivrutin konstruktion för att begränsa uttryck till den önskade celltypen av intresse (t.ex., i neuroner eller muskelceller). För att göra detta samarbete injicera Gal4 förare och UAS reporter konstruktioner på en cell skede av befruktade ägg (för detaljerade instruktioner se 2 nedan) för att generera transient uttrycka fisk. Alternativt, generera en UAS reporter stabil transgen linje (för detaljerade anvisningar se 3 nedan) och över till en Gal4 förare stabil transgen linje att generera avkomma som bär båda transgener.
    OBS: Det är också möjligt att injicera UAS reporterkonstruktion / s in i befruktade ägg från en Gal4 förare stabil transgen linje eller en Gal4 förare bygga in fertilized ägg från en UAS reporter stabil transgen linje.
  6. Att samuttrycka flera distinkta fusionsproteiner med hjälp av Gal4-UAS systemet använder en Gal4 förare och UAS reporter / si en av följande konfigurationer: A. Flera separata UAS reporterkonstruktioner (t.ex. UAS: mitoCFP och UAS: memYFP co -inmatade med en Gal4 förare konstruktion) 10, B. Flera UAS kassetter på en enda reporter (t.ex. UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Dubbelriktad UAS reporter (t.ex. UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figur 1).

Figur 1
Figur 1. Strategier för att samuttrycka fusionsproteiner med hjälp av Gal4-UAS-system.
Samuttryck av flera fusionsproteiner kan uppnås genom att använda UAS reporterkassetter i olika konfigurationer: (A) flera, separat UAS-driven constructs, (B) flera UAS kassetter på en enda konstruktion eller (C) en dubbelriktad UAS kassett på en enda konstruktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Generera transient uttrycka Fish

OBS: Följande är en anpassning av tidigare publicerade protokoll 34,35. En grundläggande injektion inställning bör innehålla en stereo med en förstoringsområdet upp till 12x, en mikromanipulator med en mikropipett hållare och en källa för lufttryck. Förbered 2.1-2.5 i förväg:

  1. För att förbereda ägg mikroinjektion kammare, förbereda en lösning av 1,5% (vikt / volym) agaros i vatten. Lägg agarospulver till vatten och mikrovågsugn tills agarosen är fullständigt upplöst. Fyll en petriskål (100 x 15 mm) med denna lösning.
    1. Tillåt agaroslösningen svalna till caoximately 45 ° C innan du placerar en plastmikroinjektion mögel (40 mm x 66 mm, med 6x 50 mm långa åsar som är 1,5 mm bred, 1 mm djup och avstånd 3 mm från varandra) på ytan av den smälta agarosen, se till att inte införa bubblor vid gränsytan.
    2. Efter agarosen apparater, förvara vid 4 o CO / N. Försiktigt bort mögel med en spatel. Förbered flera mikroinjektion kammare vid en tid, förvara vid 4 ° C och använder flera gånger under flera veckor.
  2. Använd en mikropipett avdragare för att generera glas injektion kapillärer med en lång skaft 36.
    OBS: De specifika inställningar som används för att generera injektions kapillärer bör bestämmas empiriskt. Injektion kapillärer kan dras i förväg och lagras före användning.
  3. Mäta koncentrationen av plasmid-DNA (Gal4 förare och UAS reporterkonstruktioner) för mikroinjektion med hjälp av en spektrofotometer enligt tillverkarens manual. Mäta60, förhållandet mellan absorbansen vid 260 nm och 280 nm (A260 / 280). Späd DNA till en slutlig koncentration av 100 ng / pl i nukleasfritt vatten.
    OBS: En A260 / 280-förhållande på ~ 1.8 innebär rent DNA. Överväga att använda ett kommersiellt kit (baserad på kiseldioxid-baserade bindnings matris) för att rena plasmid-DNA som ska användas för injektion. Plasmid-DNA bör vara av hög kvalitet för att förhindra toxicitet.
  4. Förbered 10 | il injektion-mix genom att kombinera DNA (0,5 till 2,5 | il av en 100 ng / | il lager för en slutlig koncentration av 5 till 20 ng / | il), Danieau lösning (0,33 | il 30x stock), Fenolrött (0,25 | il, tillval) och nukleasfritt vatten till en 10 | il total volym.
    OBS: Empiriskt bestämma koncentrationen av DNA som ger lämplig expressions. Gal4 förare och UAS reporter plasmider måste samtidigt injiceras. Inget uttryck kommer att uppstå när endast Gal4 föraren eller UAS reporterplasmid injiceras i vildtyp befruktade ägg. Men om than befruktade ägg är från en Gal4 förare linje sedan injektion av en eller flera UAS reporterplasmider räcker. Omvänt, om microinjecting in i en UAS reporter linje, endast Gal4 föraren plasmiden måste injiceras. Slutligen medan fenolrött kan kraftigt bidra till att visualisera injektioner, är det också en fluorescerande förening i sig. Därför kan fenolrött skymma visualisera ramprogrammen om avbildning planeras före 24 timmar efter befruktning (HPF) eftersom det inte kan vara tillräckligt utspädd med den här gången.
  5. Kvällen före injektioner planeras, inrätta flera par (typiskt 5-10) av manliga och kvinnliga zebrafisk för avel. Använd avelstankar med en insats som innehåller en inrutade botten och en avtagbar avdelare att separera manliga och kvinnliga fisk.
    OBS: Manliga och kvinnliga zebrafisk kan i allmänhet kännetecknas av sin kroppsform. Män tenderar att vara smal, medan kvinnor tenderar att uppvisa en ventralt utskjutande buken. Män tenderar dessutom att ha en gulröd coloring på deras ventrala buken.
  6. Omedelbart före DNA-injektioner, ta bort avdelare för att tillåta den manliga och kvinnliga att para sig. Ca 15 till 30 min efter avlägsnande av avdelaren, ta för ägg på botten av tanken. Överför vuxna fiskar med fiske-net till en ny avel tank.
  7. Häll vattnet, som innehåller de nyligen som befruktade ägg, ur avel tanken i en sil (t.ex. en plast te-sil). Tvätta ägg i sikten med användning av en sprutflaska innehållande Danieau lösning. Vänd sikten på en petriskål och använda en sprayflaska med Danieau lösning för att återställa alla ägg (vanligtvis 50 till 200 ägg per avelspar av vuxen fisk).
  8. Med hjälp av en micro pipett back-fylla en drog injektion kapillär med DNA-injektion-mix. Montera injektions kapillär i hållaren av en mikromanipulator och trimma spetsen under visuell kontroll av ett stereomikroskop, med hjälp av pincett för att skapa en mikropipett som kan penetrate chorion och cellcytoplasman samtidigt som de kan leverera en lämplig volym av DNA.
    OBS: Den grad till vilken spetsen av insprutnings kapillär trimmas bör bestämmas empiriskt och kan bäst bedömas vid injektion av ägg.
  9. För att bestämma volymen av DNA för injektion, ladda ur en droppe av injektionslösningen i mineralolja. Mät radien (r) i släppa med hjälp av en kalibrerings mikrometer och beräkna dess volym (4/3 π r 3). Modulera volymen genom att justera insprutningstrycket och / eller varaktigheten för varje insprutningspuls.
  10. Med hjälp av en plastpipett, överföra alla de uppsamlade ägg (typiskt 50-200, från 2,7 ovan) i skyttegravar en mikroinjektion kammaren. Under visuell kontroll av ett stereomikroskop, använd pincett för att orientera äggen så att cellens cytoplasma (transparent) och äggula (tät, icke-transparent) kan lätt identifieras.
  11. Under visuell kontroll av en stereomikroskop, injicera DNA i cellcytoplasman av befruktade ägg, var noga med att se till att den injicerade volymen (1 till 2 nl) motsvarar cirka 10% av cellens volym.
    OBS: Fenolrött i DNA-lösning hjälper till vid visualisering av injicerade volymen de.
  12. Efter injektion, lossa ägg från diken efter injektionen mögel genom att spola dem med en sprayflaska som innehåller Danieau lösning. Därefter överför ägg i en ny petriskål med en plast överföringspipett och underhålla i en 28,5 ° C inkubator.
  13. Behåll un-injicerade ägg som kontroller för att avgöra om injektioner bidra till hög dödlighet, antingen som en följd av fysisk skada under mikropipett penetration eller DNA mix.
    OBS: Hög dödlighet efter injektioner kan bero på många faktorer, bland annat överdrivet hög DNA-koncentration eller injektionsvolymer och / eller plasmider med contaminants. För att förhindra toxicitet från låg kvalitet DNA preps, kan kommersiella kit (baserade på kiselbaserad bindande matris) användas.
  14. Med jämna mellanrum efter injektioner, använder en stereo att screena för obefruktade ägg och döda eller missbildade embryon och kassera dessa.
    OBS: anser äggen som verkar vara på en cell skede flera timmar efter befruktningen, som obefruktade. Identifiera missbildade embryon av brutto anatomiska defekter såsom en komprometterad främre-bakre kroppsaxlar. Amorft material inom en chorion antyder att embryot inte gå igenom utvecklingsstadier och dog. För att fastställa om embryon som mikroinjicerade genomgå en normal utveckling rådfråga anatomiska atlaser 37.
  15. Överför embryon med hjälp av en plast överföringspipett till Danieau lösning innehållande 1 x 1-fenyl-2-tiourea (1xPTU) mellan 10 och 24 HPF för att förhindra pigmentbildning. Behåll embryona i Danieau lösning fortsaining PTU för varaktigheten av experimentet.
    OBS: Förutom melanoforer kan iridophores på ytan av huden vara problematiskt för avbildning. Medan PTU inte hämmar iridophore bildning, mutanta linjer med minskat antal iridophores såsom Roy Orbison (Roy) existerar och kan användas 38.
  16. Efter embryon lucka (oftast på den andra eller tredje dagen efter befruktningen, 2 eller 3 DPF), kasta chorions och utbyta Danieau lösning innehållande PTU.
    OBS: Dessa steg är viktiga för att säkerställa kvaliteten av embryot mediet och livskraft friska embryon.

3. generera stabila transgena linjer

OBS: Stabil transgena linjerna effektivt kan skapas med hjälp av Tol2 transposon systemet. En Tol2 transposon vektor innehållande transgenen av intresse är co-injiceras tillsammans med mRNA som kodar för transposas enzymet i gödslad ägg på en-cells stadiet. Transposas protein från det injicerade mRNA katalyserar excision av transgen kassett från transposon vektorn och dess integration i genomet 39.

  1. Klona transgen reporter kassett (t.ex. UAS: mitoCFP) mellan Tol2 inverterade terminala upprepningar i en av de Tol2 vektorer som för närvarande används i zebrafisk samfundet som beskrivs 40.
    OBS: Tol2 vektorer innehållande en selekterbar kassett i vilken promotorelement driver FP expression i system som saknar samband med det intressanta området organ (t.ex. hjärt 41 eller linsen 42) är användbara för screening av UAS reportertransgena linjer i frånvaro av Gal4 transaktivering.
  2. Med användning av ett kommersiellt kit (baserad på kiseldioxid-baserade bindnings matris), rena plasmid-DNA som ska användas för injektion. Säkerställa att plasmid-DNA är av hög kvalitet för att förhindra toxicitet.
  3. Transkribera Tol2 transposas-kodande mRNA: t med användning av enlämplig transkriptionsvektor såsom PCS-TP 43. I korthet, linjärisera PCS-TP och använda ett kommersiellt kit för att generera utjämnade mRNA och följa tillverkarens protokoll. Var noga med att undvika kontaminering med RNaser (t.ex. använda RNAse-fri pipettspetsar och rör). Alikvotera RNA, i en koncentration av 100 ng / | j, l, för engångsbruk och förvara vid -80 ° C.
  4. På morgonen injektionerna, tina en alikvot av transposas mRNA på is. Blanda transposonen DNA-vektorn (2 | il av 100 ng / | j, l) och transposas mRNA (2 | il av 100 ng / | il) i en 1: 1-förhållande, och tillsätt 6 | il av RNase-fritt vatten för att bringa den totala volymen till 10 pl.
    ANMÄRKNING: En koncentration av 20 ng / ul rekommenderas för varje men den optimala koncentrationen bör bestämmas empiriskt. Använd RNas-fritt vatten för utspädning. Använd handskar vid hantering av DNA-RNA-injektion mix och hålla den på is för hela perioden av injektioner för att förhindra nedbrytning av mRNA.
  5. Med hjälp av detaljerade instruktioner i avsnitt 2 ovan, injicera DNA-RNA-injektion mix i befruktade ägg vid en cellstadiet. Under visuell kontroll av ett stereomikroskop mål cellens cytoplasma vid en cellstadiet för de högsta nivåerna av genmodifiering effektivitet. Bibehålla de injicerade embryon vid 28,5 ° C tills redo att screena för transgen expression.
    OBS: PCR kan göras för att kontrollera för effektiviteten i Tol2 transposas som tidigare beskrivits 44.
  6. Screen embryon i en petriskål för genmodifiering använder okularen av en fluorescens dissektionsmikroskop.
    OBS: Använd lämpliga filteruppsättningar i mikroskop för att visualisera FP uttryck av den selekterbara kassetten (dvs fluorescens i hjärtat eller objektiv) vid två eller tre dpf. Identifiera potentiella transgena embryon genom uttryck (i hjärtat eller lins) och ta upp dessa embryon till vuxen ålder (F 0 generationen) med hjälp av standardprotokoll 45. Alternativt, identifiera potentiella transgena embryon genom PCR som beskrivs i 46.
  7. När UAS reporter F 0 fisk är 2,5 - 3 månaders ålder, korsa dem (se 2.5 för mer information) till icke-transgena vildtyp fisk att förvärva ägg för att upprätta en F 1 generation. Alternativt korsa UAS reportern F 0 fisk till en Gal4 förare linje att etablera en F 1 generation. I det senare fallet, kan UAS-driven transgen direkt övervakas i embryona erhållna från korset.
  8. Använd en fluorescens dissekera mikroskop för att screena F 1 embryon för uttryck av transgenen eller valbara kassett.
    OBS: När uttryck bekräftas då transgenen kan sägas vara nedärvda sändas. Genmodifiering är inte Mendels på F 0 scenen. Antalet embryon som uttrycker transgenen kan variera från ett litet antal till den stora majoriteten i de enskilda clutches. Transposon integration i olika F 0 fisk kan variera kraftigt, vilket resulterar i olika uttrycksmönster. Därför upprätthålla F 1 fisk från olika F 0 grundare som separata under linjer. Transposon integrationer i F 1 fisk är stabila och är vidare till efterföljande generationer i en Mendels sätt.
  9. Behåll varje F 0 fisk i separata tankar att åter identifiera transgen bärare.

4. Förbered Embryon för Imaging på en upprätt mikroskop

OBS! Metoderna som beskrivs här har optimerats för avbildning på upprätt mikroskop med långa arbetsavstånd vattendoppning-kon mål.

  1. Använda en fluorescens dissektionsmikroskop för att screena embryon för transgen expression.
    OBS: Uttryckning av en UAS reporter transgen kommer att bero på den specifika Gal4 föraren linje som används. Välj embryon för avbildning experiment baserat på önskad expression mönster.
  2. Överför valda embryon med hjälp av en plastpipett till en separat petriskål innehållande Danieau buffert med 1x PTU och 1x Tricaine.
    OBS: När märkning är gles (endast ett fåtal celler i ett organsystem) montera embryon i agaros (se 4,3-4,7 nedan) och skärmen för transgen expression med hjälp av ett brett fält mikroskop med höga mål förstoring (se 5.1 nedan). Tricaine anesthetizes fisk och bör vara effektiva inom några sekunder. Om fisken inte är immobiliserade är det troligt att den Tricaine har degraderat. Möjliga orsaker till denna nedbrytning är dålig förvaring av Tricaine, som är ljuskänsliga 47.
  3. Förbereda agarosen att bädda in fisken genom upplösning lågsmältande agaros pulver i Danieau buffert till en slutkoncentration av 0,7%. Alikvot (1 ml) och hålla i ett värmeblock vid 40 ° C tills den ska användas.
    OBS: Högre Koncentratjoner av agaros (upp 1,5%) kan också användas för att bädda in fisk.
  4. Tillsätt 50 | il av en 20x stock av Tricaine och 20 | il av en 50x förrådslösning av PTU till 1 ml alikvot av lågsmältande agaros och blanda väl genom att knacka på sidan av röret. Återgå röret till värmeblocket. Med hjälp av en plast överföringspipett, försiktigt pipett några (1-10) sövda embryon i agarosen, överföra så lite vätska som möjligt för att undvika utspädning av agarosen.
  5. Med hjälp av en plastpipetten överföring alla embryon med en liten mängd agaros till ett glas botten petriskål.
  6. Arbetar relativt snabbt, använder pincett för att placera embryon i den önskade orienteringen, beroende på strukturen som skall avbildas.
    OBS: Orient embryon på sin sida om näthinnan eller Rohon-Beard (RB) sensoriska neuroner bör avbildas.
  7. Tillåta agarosen att stelna i minst 15 minuter. Lägg Danieau buffert innehållande 1xPTU och 1xTricaine att täcka embryon inbäddade i Agarose. Placera skål innehållande agaros-inbäddade embryon i en inkubator vid 28,5 ° C tills den ska bilden.

5. Imaging Cellular och subcellulära strukturer med hjälp av brett fält eller konfokalmikroskopi

OBS: brett fält mikroskopi och punkt-scanning konfokalmikroskopi är de mest använda formerna för bild fluorescerande zebrafisk embryon Tabell 1 sammanfattar de viktigaste fördelarna och nackdelarna med båda systemen.. För båda formerna av mikroskopi, är embryon monterade i agaros såsom beskrivits i 4 ovan, och hölls vid 28,5 ° C under hela avbildningsexperiment genom att använda en upphettningskammare på scenen av mikroskopet. Viktigt är skålen med agaros-inbäddade embryon fick utjämnas till 28,5 ° C före avbildning börjar som temperaturvariationer orsakar drift i z-dimensionen. När de utför långtids imaging experiment (över Several timmar), placera en Plexiglas täcka över petriskål för att minska avdunstningen av bufferten.

Brett fält Point-scanning konfokala
Kosta relativt billigt Dyr (ca. 5x mer)
Fotoblekning Låg Hög. Provet exponeras för laserljus över och under fokalplanet.
Foto-toxicitet Låg Hög (se Bild-blekning ovan)
upptagningshastighet Snabb Långsam
Beslut xy Abbes lag Abbe lag (kan förbättras efter app 40% med användning av ett mycket litet hål,. Men ide flesta inställningar detta har liten praktisk tillämpning)
optisk sektionering Fattig Ja (kan justeras genom pinhole storlek)
vävnadspenetrering Begränsad till ytliga strukturer (t.ex. Rohon-Skägg celler eller muskelfibrer) Begränsat till <100 mm från ytan av embryot

Tabell 1. Allmän jämförelse av brett fält och punkt-scanning konfokalmikroskopi

  1. Brett fält mikroskopi
    OBS: Här riktlinjer tillhandahålls för avbildning zebrafisk embryon med hjälp av en upprätt brett fält mikroskop med långa arbetsavstånd vattendoppning-kon mål. Mikroskopet är utrustat med en kyld CCD-kamera, och filteruppsättningar för att visualisera olika fluoroforer monterade på en automatiserad filterhjulet för snabb förvärv av flera kanaler.Bild förvärv styrs av μManager, ett open source mikroskopi programpaket 48. Ett specifikt exempel för avbildning mitokondrier i RB sensoriska neuroner tillhandahålls. RB celler är genetiskt märks med membran riktade YFP och deras mitokondrier är GFP-märkt (se 1.1 ovan).
    1. Mount embryon på sin sida i lågsmältande agaros såsom beskrivits i 4 ovan.
    2. Låt skålen med monterad fisk till jämvikt till 28,5 ° C i ett värmeskåp på scenen av mikroskopet innan påbörjas avbildning.
    3. Använda en låg förstoring vatten-doppning-kon objektiv och titta igenom okularen i mikroskopet för att välja ett område på ytan av embryot till bild.
      OBS: Om den stabila transgena MitoFish reporter linje, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, används i kombination med ett förar linje såsom Huc: Gal4 då mest RB nervceller är märkta, och visas som en tät mesh-arbete neurite arbors på ytan av embryot. Om mikroinjektion av DNA-konstruktioner används för att uppnå glesa märkning (t.ex. Sensory: Gal4-VP16 med UAS: mitoCFP och UAS: MA-YFP), embryon skärmen för att identifiera dubbelmärkta celler.
    4. Öppna mikroskop programvara (μManager 1,4) och klicka på "Belysning" "under" Konfigurationsinställningar "för att definiera de korrekta filteruppsättningar för våglängden av intresse (YFP eller GFP för det aktuella exemplet). Under" Kamerainställningar "enter exponeringstiden som krävs för att förvärva en lämplig bild.
      OBS! "Belysning Settings" är förinställd av användaren vid installationen av programvaran och laddas när du öppnar μManager. Om programvaran inte är konfigurerad att styra filterhjulet flyttar manuellt filterhjulet i tornet till lämpligt läge.
    5. Byt till en lång arbetsavstånd vattendoppning-kon mål som sträcker sig från 40-100x förstoring. VäljaMålet som har den högsta numeriska bländaröppningen (NA) och kromatiskt korrigerad (Apochromat).
    6. Klicka på "Live" för att välja synfältet: När det gäller RB neuron, bild mitokondriell transporter vid stäven axonet, som härrör från cellkroppen, eller i det perifera bersån.
      OBS: De perifera hållare av RB nervceller i stjärtfenan veck av embryot ger ett utmärkt tillfälle att avbilda ett stort synfält som är platt och kan därför fångas på en enda bildruta med ett brett fält mikroskop. Det är därför viktigt att montera embryot så plant som möjligt på sin sida, så att stjärtfenan vecket är parallellt till botten av petriskålen.
    7. Efter att ha valt ett synfält, klicka på "rektangulär markering" i ImageJ menyn, definiera ett område av intresse (ROI) och klicka på "ROI" i μManager fönstret. Efter att ha valt ROI för avbildning, klicka på "Stop" och "Spara" för att take en bild av YFP-kanalen för att spela in den lokala morfologin hos neurite / s.
    8. Till bilden mitokondriell transporter klicka på "Multi-D Acq." knapp. Observera en extra fönster ( "Multi-dimensionell Acquisition") och välj antalet tidpunkter samt intervallet mellan tidpunkter i detta fönster. Använd frame rates på 0,3-1 Hz. Utföra inspelningar i minst 10 min för att samla så många datapunkter som möjligt.
    9. I "Multi-dimensionell Acquisition" fönstret, klicka på "kanaler", lägga till och definiera våglängden för avbildning (GFP för mitokondrier i detta exempel) och exponeringstiden. Håll exponeringstider till under 400 ms för avbildning mitokondriell transporter.
    10. Klicka på alternativet "Spara bilder" i "Multi-dimensionell Acquisition" fönster, för att automatiskt spara filerna i en viss mapp som beskrivs i "Directory root". Klicka på "Skaffa" i övre högra hörnet för att starta time-lapse avbildning.
    11. justera manuellt fokus medan inspelning med tidsluckor för att kompensera för eventuell drift i z-dimensionen.
      OBS: Med hjälp av dessa parametrar mitokondriell transport i RB nervceller kan avbildas så länge som fyra timmar.
  2. konfokalmikroskopi
    OBS: Här riktlinjer finns för avbildning med en upprätt Olympus FV1000 konfokalmikroskop och långa arbetsavstånd vattendoppning-kon mål. Mikroskopet är utrustat med flera laserlinjer och flera detektorer (konventionella PMTs och mer känsliga galliumarsenidfosfid detektorer) som gör det möjligt för flerkanalig avbildning. Specifik hänvisning görs till Olympus Fluoview programvara. Dock bör bildparametrar som beskrivs här vara lätt överföras till andra konfokala system.
    1. Mount embryon i lågsmältande agaros i en orientering lämplig för den orgel / strukturen som skall avbildas, såsom beskrivs i 4 ovan.
    2. ° C i ett värmeskåp på scenen av mikroskopet innan du börjar avbildning.
    3. Använd långa arbetsavstånd vattendoppning koner mål för konfokala mikroskop i en upprätt konfiguration. Välj mål med högsta möjliga NA att maximera mängden av fluorescerande signaler som kan samlas in och har den bästa upplösningsförmågan. När samla bilder från flera kanaler väljer kromatiskt korrigerade mål (Apochromat).
    4. Öppna mikroskop mjukvaran och klicka på "Trans lampa" eller "Epi lampa" att använda antingen sänds eller fluorescens ljus respektive för att identifiera regionen av intresse genom okularen i mikroskopet.
    5. Använda programvaran för att ställa in följande skanningsparametrar för att förvärva bildstaplar:
      1. I "Förvärv Setting" fönster kontrollera att målet valts för avbildning matchar mål som visas på drop-down meny med tillgängliga mål.
        OBS: Detta är att se till att förhandsberäknade parametrar för ett visst mål (t.ex. lateral och axiell upplösning, storlek konfokala bländare etc.) håller streck och tillförlitligt kan användas.
      2. Välj lämpliga laserlinjen / s, och excitations- och emissions bikromatfilter till bilden specifik fluorescerande protein (er). Gör detta genom att klicka på "Dye listan" i "Image Acquisition Control" fönstret och välja lämplig fluorofor / s. Du kan också klicka på knappen "Ljus väg och färgämnen" för att ställa dessa parametrar manuellt.
        OBS: När "Dye List" knappen alternativ som väljs, väljer programmet automatiskt lämpliga laserlinjer, excitations- och emissions bikromatfilter och justerar storleken på den konfokala bländare på lämpligt sätt.
      3. I "Förvärv Setting" fönster, justera "Zoom" faktor och "Storlek aspect ratio "(dvs, 512x512, 1024x1024 mm) av den skannade bilden för att få pixelstorleken som krävs för att bäst lösa de strukturer som avbildas. Ställ in pixelstorleken vara ungefär hälften av den teoretiska upplösningen av målet, och därmed följer Nyquist provtagning kriterier . för att bestämma pixelstorlek på den förvärvade bilden Klicka på knappen med symbolen för information ( "i") i "Image Acquisition Control" fönstret.
      4. Ställ in sökningshastigheten och det snabbast möjliga (2 ps / pixel) i "Förvärv Setting" fönster.
      5. I "Image Acquisition Control" fönstret klicka på Kalman linje genomsnitt för att minska noise.A faktor 2-3 vanligtvis räcker.
      6. Välj en sekventiell scanning vid avbildande av fluoroforer med överlappande spektra. För att göra detta, klicka på "Sequential" och "Line" i "Image Acquisition Control" fönstret.
      7. Justera uteffekten från de relevanta laser linje / s (typisktunder 5%). De specifika värden behöver bestämmas empiriskt.
      8. Klicka på "XY Repeat" eller "Fokus x2" eller "Fokus x4" för att kontinuerligt scanna det markerade området medan du justerar detektorinställningar för varje kanal. Justera "HV", "Gain" och "Offset" för varje kanal för att få bilder som har den högsta dynamiska omfånget av gråvärden.
        OBS: De specifika värden för dessa inställningar måste bestämmas empiriskt. "HV" justerar spänningen på detektorn för att ändra dess känslighet, "Offset" justerar utsignalen från detektorn och "Gain" multiplicerar utsignalen från detektorn med en konstant faktor.
      9. Tryck på Ctrl + H för att visualisera de förvärvade bilderna via en uppslagstabell (Hi-Lo) som identifierar under mättad (visas blå) och över-mättade pixlar (visas röd), vilka båda bör i allmänhet undvikas. Omvärdera uteffekten av den relevanta laser line / s och detektorinställningar.
        OBS: Genom att använda hög lasereffekt och höga nivåer av "HV" av detektorn kommer att leda till mer signal. Högre lasereffekt kommer dock att leda till ökad blekning och fototoxicitet. Ökning av "HV" kommer att leda till ökat buller. Därför måste en kompromiss hittas vid inställning lasereffekt och "HV" att förvärva bilder med acceptabla bullernivåer samtidigt förhindra fotoskada (se även tabell 1).
      10. Samla bilder från en definierad volym genom att fokusera på de övre och nedre gränserna för området av intresse. I "Förvärv Setting" fönstret klicka på "End Set" och "Start Set" set knapparna på z-stack fönster på de övre och nedre gränserna för den volym som skall avbildas. Välj en stegstorlek som är hälften av z-upplösning för den givna målet (eg., Om z resolutionen 2 pm välja en pm). För att bestämma z-upplösning av objective klicka på knappen med symbolen för information ( "i") i "Image Acquisition Control" fönstret.
      11. Ställa in en tidsserie för att samla in z-stackar vid en temporal frekvens som är lämplig för dynamiken i den subcellulära strukturen som avbildas. I "TimeScan" sub-fönstret anger den frekvens där z-stackar bör förvärvas ( "Interval") och hur många gånger bilderna ska förvärvas ( "Num").
      12. Klicka på "Djup" och "Time" knapparna i "Image Acquisition Control" fönstret för att bekräfta att ett z-stack och tidsserie kommer att förvärvas. Slutligen klicka på "XYZT" knappen för att börja förvärva tidsförlopp bilder.
      13. Efter avslutad bildtagning, observera "serie Klar" på programvaran gränssnitt. Klicka på den och spara bilderna i "OIB" format för att spela in bilder och metadata associerade med dem.
        OBS: Bilder som erhållits påbrett fält mikroskop och konfokalmikroskop kan visualiseras och analyseras med hjälp av program som FIJI, en fri public domain bildbehandlingsprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här användningen av brett fält och konfokalmikroskopi till bild mitokondrier och centrosom i levande zebrafisk embryon är direkt jämförs och kontrasteras. Beroende på placeringen av cellerna i vilka organell dynamiken skall undersökas och den inneboende frekvensen av de specifika subcellulära händelser, i allmänhet antingen brett fält eller konfokalmikroskopi är ett bättre val. Vi avbildade organ i RB neuron belägna på ytan av embryot och i näthinnans celler ligger djupare. Den ytliga placering RB nervceller tillsammans med sin tvådimensionella geometri gör dem goda kandidater för att avbildas av både brett fält och konfokalmikroskopi (figur 2). Förvärva bilder med hjälp av konfokalmikroskopi är dock betydligt långsammare och kan leda till en underskattning av dynamiken i specifika subcellulära händelser (t.ex. förflyttning av mitokondrier, figur 2C, D (Figur 3).

För att möjliggöra samtidig visualisering av organeller och cellmembran vi använde Gal4-UAS-system i tre olika konfigurationer. För det första UAS MitoFish reporter linje Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) var mde6 användes. Här tillåter en dubbelriktad UAS samtidig uttryck av mitokondriellt riktade GFP och membran riktade YFP. I kombination med lämpliga Gal4 förare linjer, MitoFish märka mitokondrierna och cellmembranen hos RB sensoriska neuroner (Figur 2A-C) eller retinala celler (Figur 3A, B) med GFP och YFP r espectively. För det andra, två UAS konstruerar (UAS: mitoCFP och UAS: MA-YFP) kombinerades med en Gal4 förare konstruktion (Sensory: Gal4-VP16, sensoriska neuron-specifika förstärkarelement från ö-1-genen) 7 i transienta injektioner. Mosaiken uttryck som i allmänhet är resultatet av dessa injektioner tillåtet att spåra individuella celler under dagarna (figur 2E). Ett tredje sätt utnyttjas användningen av två UAS kassetter, var och en driver expressionen av en annan fusionsprotein, på en enda sammanhängande konstruktion. Denna strategi användes för att generera CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) tum1, i vilken en centrin4-YFP fusion etiketter centrosom och Cerulean är riktad till cellmembran. I kombination med specifika Gal4 förare linjer centrosom och cellmembranen av näthinnans celler (figur 3C, D) eller muskelfibrer (Figur 4) är märkta.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 2: Imaging mitokondrier in vivo i RB sensoriska neuroner i embryonal zebrafisk.
RB sensoriska neuroner i svans delen av fenan veck 2 dpf MitoFish avbildades med hjälp av en Apochromat 40x vattendoppning-kon mål med en NA på 0,80, antingen genom brett fält (A) eller konfokala (B) mikroskopi. Paneler till höger visar detalj i regionen som beskrivs. C vidvinkeltidsförlopp bilder av en liten region av intresse i det perifera berså av en RB neuron i 2 dpf MitoFish. Rörelsen hos en enda mitokondrie (pil i 0 '') spårades över 100 sek; sex tidpunkter visas. Positionen för mitokondrien i föregående tidspunkt beskrivs i magenta. D positionen för den rörliga mitokondrien i C E Confocal bilder av en RB sensoriska neuron vid 2 och 3 dpf. Märkning av enskilda RB-celler och deras mitokondrier uppnåddes genom samtidig injicering av ett sensoriska neuron-specifika Gal4 föraren bygga tillsammans med två UAS reporterkonstruktioner, UAS: mitoCFP och YH: MA-YFP vid en cellstadiet och screening för isolerad dubbel -märkta celler. Bilden är kontrasten inverterad och enskilda mitokondrier avbildas schematiskt som magenta prickar. Skalstock A, B 20 ^ m, C 2 ^ m,E 50 | im. Mitokondriellt riktade GFP (mitoCFP), membran riktade YFP (MA-YFP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Jämförelse av brett fält och konfokalmikroskopi till bildorgan in vivo i embryonala zebrafisk näthinnan.
Otx2 promotorelement driva uttryck av GFP i mitokondrier och YFP i cellmembran (A och B) eller YFP i centrosom och Cerulean i cellmembran (C och D) i näthinnan av 2 dpf zebrafiskembryon. För att uppnå detta märkningsmönster, Otx2: Gal4 transgena fiskar antingen korsas till MitoFish (A och B) or CentrinFish (C och D). En 40x vattendoppning-kon Apochromat mål (NA 0,80) användes för att förvärva bilder av samma region i varje näthinna använder brett fält (A, C) och konfokal (B, D) mikroskopi. Infällningar i A och B visar detaljer i ett område av det inre nukleära skiktet, inlägg i C och D visar en cell i M-fas. Skala bar 20 ^ m. Mitokondriellt riktade GFP (mitoCFP), membran riktade YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), membran riktade Cerulean (MA-Cerulean). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Jämförelse av brett fält och konfokal Microscopiera till bild centrosom in vivo.
En enda muskelfiber med fluorescensmärkta cellmembran och centrosom (Otx2: Gal4; CentrinFish) avbildades med hjälp av brett fält (A) och konfokal (B) mikroskopi. I båda fallen en 40x vatten-doppning-kon Apochromat mål (NA 0,80) användes. Skala bar 10 ^ m. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), membran riktade Cerulean (MA-Cerulean) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här visar vi mångsidigheten av Gal4-UAS expressionssystem för att fluorescent märka mitokondrierna, centrosom och de cellulära membranen i specifika celltyper in vivo i zebrafiskembryon. Många fluorescerande fusionsproteiner som märka andra organeller eller subcellulära strukturer kan hittas i den publicerade litteraturen och kan fås från respektive laboratorium, kommersiella källor eller icke-kommersiella plasmid förvarings (t.ex. Addgene). Att utforma en ny fluorescerande fusionsprotein, flera parametrar måste beaktas, inklusive vilka FP att använda och om att smälta FP vid amino- eller karboxiänden av proteinet av intresse. För en mer ingående diskussion om att skapa fluorescerande fusionsproteiner, är läsarna hänvisas till djupgående artiklar om ämnet 49-51.

Vi belyser tre strategier för att uppnå samexpression av fusionsproteiner med användning av UAS-drivna transgener. Multipel, Separate UAS reporterkonstruktioner tillåter för att kombinera olika befintliga reporter konstruktioner utan behov av ytterligare kloning. Reporterexpressionsnivåer kan också titreras oberoende av varandra. Men högre nivåer av samexpression uppnås när antingen flera UAS kassetter eller en dubbelriktad UAS kassett på en enda konstruktion används. Eftersom FP används som taggar det är relativt lätt att kontrollera samexpression. Det bör noteras att andra metoder för fler cistronic expression finns också, inklusive användning av interna ribosomala inträdesställen 40 och virala 2A peptider 52,53. Som ett alternativ till DNA baserade konstruktioner, in vitro transkriberat capped mRNA kan användas för att uttrycka fluorescerande fusionsproteiner för att märka subcellulära strukturer 1,4,8. Förbehållet med denna metod är dock att uttrycket är begränsat till de första dagarna av utveckling och inte cell eller vävnadsspecifik. Oberoende av den valda metoden för att uttrycka fusionsproteiner, är det kritisktför att säkerställa att expressionsnivåer inte leder till icke-specifik märkning och äventyra det fysiologiska tillståndet hos cellerna. I detta avseende, kan amplifieringen av reportergenuttryckning inneboende i Gal4-UAS-systemet 27 vara problematiskt, manifesterar exempelvis såsom cytosoliskt märkning även när FP är riktad till en specifik organell. När de är tillgängliga, bör antikroppar användas för att kontrollera att de uttrycksmönster som erhålls genom fusionsproteiner återspeglar den endogena situation. I vissa fall kan injektionen av låga (er) DNA-koncentrationer mildra problemet med felaktig lokalisering av fusionsproteinet. Alternativt vektorer med ett lågt antal UAS upprepningar kan bidra till att titrera ner transgen uttrycksnivåer 30. På samma sätt, för aktivator Gal4-VP16 existerar modifierade versioner, som rapporteras att driva uttryck jämförelsevis svagt och är därför mindre toxiska 30,33. Om felaktig lokalisering av fusionsproteinet kvarstår trots ansträngningar för att titrera down transgen uttrycksnivåer, kan det bli nödvändigt att avstå från Gal4-UAS-system och driva uttryck av promotorelement direkt.

De stabila transgena linjerna, MitoFish 10 och CentrinFish 12, beskriver vi i detta manuskript gjordes med användning 14xUAS kassetter. Vi upprätthåller dessa rader i bakgrunden av Gal4 förare linjer för att upptäcka förändringar i uttryck över generationer, eftersom reporter linjer med flera UAS upprepningar har rapporterats vara benägna att tysta 54. Vi har inte sett tecken på att tysta över 3 generationer vi har propagerade CentrinFish. Vi har dock sett brokiga uttryck i MitoFish och därför strikt välja embryon med "full", starka nivåer av uttryck att propagera för kommande generationer. Den aktuella litteraturen tyder på att expressionsvektorer med 5xUAS upprepningar kan vara ett alternativ för att generera stabila transgena linjer - reportern ärdrivs till tillräckligt höga nivåer 30 och förhållandevis låga antalet UAS upprepar kan göra det mindre benägna att transgen tyst, även om icke-repetitiva UAS upprepningar är enligt uppgift ännu mindre känslig 54.

Paletten av ramprogrammen för närvarande tillgängliga för taggorgan eller andra subcellulära strukturer är mycket bred 55. När du väljer en viss FP som en tagg, bör hänsyn tas till följande parametrar: För det första att den excitation och emissionsspektra av FP bestämma den specifika laserlinjen samt excitations- och emissionsfilter som krävs för dess visualisering. För det andra, ljusstyrka och fotostabilitet av FP. För det tredje, den hastighet med vilken den FP mognar följande översättning. Fjärde, huruvida FP har en tendens att aggregera i fusioner. När det gäller den sista parametern, bör försiktighet iakttas och kontrollexperiment bör göras för att testa lämpligheten av varje FP för specifika experiment. Till exempel, medan red ramprogrammen mCherry och DsRed används allmänt, de sägs bilda aggregat i vissa fusioner 56. Vi har funnit TagRFP-T 57, en mer foto stabil variant av TagRFP, att prestera bra när det riktas till mitokondrier och cellmembran (opublicerade observationer). När flera organeller måste samtidigt visualiseras, FP med icke-överlappande spektra bör användas. Vi har framgångsrikt använt kombinationer av cyan ramprogrammen (GFP och Cerulean) och YFP (figurerna 2-4). Genom att utnyttja hela spektralområdet från blått till nära infrarött, kan en kraftigt utöka antalet subcellulära strukturer som kan samtidigt visualiseras 2. I tillägg till den konventionella FP, foto aktiverbar-FP är särskilt användbara för att sondera organell dynamik, t.ex., användandet av FP Kaede att spåra ödet för individuella mitokondrier 58.

Vilken mikroskopi teknik - brett fält eller konfokala - är den mestlämplig för avbildning beror på ett antal faktorer, bland annat placeringen av de celler som skall avbildas och den hastighet med vilken specifika subcellulära eller cellulära händelser förväntas inträffa. Brett fält mikroskopi är att föredra modalitet i ytliga platser och gles märkta prover. Det erbjuder låg fototoxicitet och avbildning med hög hastighet till ett rimligt pris. Men om avbildning behöver utföras i icke-ytliga delar av zebrafisk, i tätt märkta prover eller för att få tredimensionell information konfokala eller någon annan form av optisk sektione mikroskopi blir den metod som.

Oavsett vilken cellulär eller subcellulär struktur som övervakas, finns det ofta en avvägning mellan att förvärva bästa möjliga bild och hålla provet vid liv och i gott fysiologiskt tillstånd för upprepad time-lapse avbildning. Foto-toxicitet kan yttra sig som förändringar i beteendet hos organeller, avvikande morfologi av celler eller till och med celldöd. Nyckeln till att minska fotoblekning och fototoxicitet för både brett fält och konfokalmikroskopi är att använda lägsta möjliga nivå av ljus för att få bilder. I detta avseende mål med högsta möjliga NA är nyckeln för att maximera mängden av fluorescerande signal som kan samlas in. För konfokalmikroskopi kan ett antal parametrar justeras för att kompensera för användningen av lägre lasereffekt. Detektorer med högre DQE jämfört med konventionella PMTs, t.ex., galliumarsenidfosfid detektorer kan användas för att se till att utsända fotoner är mer sannolikt att upptäckas. Alternativt eller dessutom kan högre dynod spänningar tillämpas i PMT för att öka känsligheten hos detektorerna. Konfokala bländare (hål) kan öppnas för att möjliggöra insamling av mer fluorescerande signal, om än med en förlust av axiell upplösning. Att exponera proverna till så lite ljus som möjligt bör skanning göras vid höga hastigheter, så att uppehållstiden förlasern per pixel är låg. Skanning med lägre spatial upplösning har också effekten att öka hastigheten på skanningen. Imaging har sällan den ytterligare fördelen av att exponera provet för mindre ljus, men bör endast övervägas om det inte äventyrar omfattande provtagning av de undersökta processerna.

Som ett alternativ, snurrande skiva konfokala mikroskop och konfokala mikroskop som är utrustade med en så kallad "resonant" scanner erbjuder möjligheten för snabb scanning. Båda formerna har den fördelen att de är snabbare och mindre foto giftigare än "klassiska", punktskanning konfokala mikroskop. Men snurrande skiva konfokala mikroskop är mer begränsade i z-upplösning och kan inte tränga så djupt in i vävnaden som punkt-scanning konfokala mikroskop. På samma sätt kan tillämpningen av resonans-skanner konfokala mikroskop begränsas som mycket kort pixel uppehållstid kommer att leda till sämre bildkvalitet som kunde,i sin tur, utgör hinder för detektering av sub-cellulära händelser (t.ex. binära bilder med minskad signal-till-brus).

Slutligen, medan brett fält och konfokal avbildning lyfts fram här, kan andra former av ljusmikroskop, såsom två-foton 59 och ljus ark mikroskop 60 vara lämpligare för specifika frågor. Två-foton-mikroskopi är baserad på excitering av en fluorofor genom samtidig absorption av två fotoner i det infraröda området av det ljusspektrum. I likhet med konfokalmikroskopi, använder den punkt scanning för att hämta bilder från provet och har optiska sektione kapacitet på grund av den icke-linearitet tvåfotonexcitering. Användningen av långvågigt ljus för fluorofor excitation tillåter avbildning på djup flera hundra mikrometer från ytan. Vidare begränsning av excitation till en liten avbildningsvolymen förhindrar fotoblekning och foto-toxicitet utanför fokalplanet. Men inte alla FPs har hög multifoton absorption tvärsnitt, ett problem som är särskilt utbrett i rött ramprogrammen. Dessutom hitta en enda infraröd våglängd att samtidigt excitera flera distinkta ramprogrammen är svårt, vilket gör flerkana imaging besvärlig. Ljus ark mikroskopi använder en tunn "ark" (typiskt tjocklek som sträcker sig från 2 till 10 | j, m) av laserljus för att excitera provet och detekterar fluorescenssignaler från denna belysta fokalplanet vid en vinkelrät vinkel med användning av en känslig kamera. Optisk sektionering åstadkommes genom att belysa ett enda plan i taget. Denna begränsning av excitationsljus minskar förekomsten av fototoxicitet. Eftersom fluorescenssignaler från hela belysta planet samlas samtidigt är bilden förvärvet betydligt snabbare än punkt scanning konfokala och multifotonmikroskop. Alla dessa egenskaper gör ljus ark mikroskopi särskilt lämpad för avbildning dynamiska cellulära händelser med hög Spatiotemporal upplösning istora volymer av levande prover. Faktum är att använda ljus ark mikroskopi cell öde i hela zebrafisk embryot var omfattande spåras under de första 24 h av utveckling 61. Med fortsatta förbättringar av bättre avbildning penetration 62,63 och spatial upplösning 64, är det tänkbart att ljus ark mikroskop kommer att användas för att undersöka dynamiken inte bara på cellulär men också på subcellulär nivå i hela zebrafisk embryon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter