Summary
Implantation af autologe og allogene knogletransplantater udgør accepterede tilgange til behandling af svære kraniofacial knogletab. Endnu virkningen af graft sammensætning på samspillet mellem neovaskularisering, celledifferentiering og knogledannelse er uklar. Vi præsenterer en multimodal billedbehandling protokol til formål at belyse angiogenese-osteogenese indbyrdes afhængighed på graft nærhed.
Abstract
En stor parameter bestemme succes af en knogle-podning procedure er vaskularisering af området omkring transplantatet. Vi antager, at implantation af en knogle autotransplantat ville fremkalde en større knogle regeneration af rigelige blodkar formation. For at undersøge virkningen af implantatet på neovaskularisering ved defektstedet, udviklede vi en mikro-computertomografi (μCT) tilgang til karakterisering nydannede blodkar, hvilket indebærer systemisk perfusion af dyret med en polymeriserende kontrastmiddel. Denne metode gør det muligt detaljeret vaskulær analyse af et organ i sin helhed. Derudover blev blod perfusion vurderet ved anvendelse fluorescensimagografi (FLI) af en blodbåren fluorescerende middel. Knogledannelse blev kvantificeret ved anvendelse af en FLI hydroxyapatit-målrettet probe og μCT analyse. Stamceller rekruttering blev overvåget ved bioluminescens imaging (BLI) af transgene mus, som udtrykker luciferase under styring af osteocalcin promotoren.Her beskriver og demonstrerer forberedelse af allotransplantatet, calvariale defekt kirurgi vi, μCT scanning protokoller for neovaskularisering studiet og knogledannelse analyse (herunder in vivo perfusion af kontrastmiddel), og protokollen til dataanalyse.
3D høj opløsning analyse af vaskulatur signifikant større angiogenese i dyr med implanterede autotransplantater, navnlig med hensyn til arteriole formation. Følgelig blodperfusion var signifikant højere i autograft gruppen af den 7. dag efter operationen. Vi observerede overlegen knoglemineralisering og måles større knogledannelse hos dyr, der modtog autotransplantater. Autograft implantation induceret resident stamcelle rekruttering til graft-værtsknoglen sutur, hvor cellerne differentieret til knogledannende celler mellem 7. og 10. postoperative dag. Dette fund betyder, at øget knogledannelse kan tilskrivesaugmented vaskulære fodring, der kendetegner autotransplantat implantation. Fremgangsmåderne afbildet kan tjene som et optimalt værktøj til at studere knogleregenerering i form af tæt afgrænset knogledannelse og neovaskularisering.
Introduction
Craniofacial knogletab på grund af traumer, tumorresektion, dekompressiv kraniotomi og medfødt defekt sjældent helbreder sig selv og præsenterer et klart udækket behandlingsbehov. Autologe knogletransplantater og allogene knogletransplantater er flittigt brugt til at behandle disse tilstande 1.
Det er almindeligt accepteret, at osteogenese tæt er kombineret med angiogenese 2,3. Således bør fuldstændig undersøgelse af en planlagt terapi for knogleregenerering indeholde en omfattende undersøgelse af vaskulære træ danner hele defektstedet. Der er flere tilgængelige metoder til at karakterisere vaskularisering i forsknings-modeller. Den vaskulære træ kan undersøges ved histologisk analyse. Da histologi afhængig sektionering væv, er der stor sandsynlighed for, at det resulterende billede vil blive forvrænget. For at løse dette problem, kan intravital mikroskopi udføres for at billedet intakt blodkar 4; Men denne metode erbegrænset til en plan afbildning. μCT scanning af prøver taget fra et dyr perfunderet med kontrastmiddel giver 3D-afbildning af det vaskulære netværk, der giver næring til regenerering site 5. Denne fremgangsmåde giver mulighed for en meget detaljeret demonstration af et organ s kar som helhed, samt en omhyggelig analyse af blodkar distribution. Endvidere μCT muliggør differentiering mellem forskellige diametre af blodkar, der kendetegner de forskellige undertyper af blodkar.
Vi antager, at implantation af en calvarial autograft vil inducere større neovaskularisering end implantation af en allograft, og dette tal steg neovaskularisering vil føre til gengæld til øget knogle formation.To forfølge denne hypotese anvendte vi en række teknikker. Vi undersøgte mønstre af nydannede vaskulære træ ved at udføre en μCT-analyse. Vi målte blodperfusion anvendelse af et blod-pool fluorescerende probe. Næste, vi æslersed knoglevæv mineralisering af FLI en hydroxyapatit-rettet probe og μCT analyse. Endelig har vi overvåget stamcelle rekruttering og differentiering, der udfører BLI i transgen mus, hvor luciferase udtrykkes i osteocalcin-positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne i den institutionelle dyr pleje og brug udvalg (IACUC) i Det hebraiske Universitet i Jerusalem, Israel (Request nr MD-12-13524-4), en AAALAC godkendt anlæg, og af Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request nr 3770). Dyrene blev behandlet i streng overholdelse NIH retningslinjer.
1. Fremstilling af Bone Allografter
- Euthanize 7- til 8 uger gamle Balb / C-mus, eller hvilken som helst stamme forskellige fra modtageren under anvendelse af standardmetoden CO 2 inhalation eller intraperitoneal injektion af 50 pi phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bekræfte fravær af et hjerteslag og udfør cervikal dislokation. Alternativt høste allografter fra slagtekroppe, der er blevet holdt i -20 ° C og optøet før høst.
- Barbere den calvariale regionen ved hjælp af en hårklipper, at anvende det mod hårenes vækst. Desinficere slagtekroppen hovedet ved at anvende 70% isopropanol. Skær hovedbunden huden ved hjælp af en nr 11 skalpel og fjern periost.
- Ved hjælp af en tandlægebor og et 4,5-mm indvendig diameter trephine, afmontere en cirkulær fragment af calvarie knogle. Overfør knoglefragment til en 100-mm plastik skål indeholdende sterilt saltvand. På dette tidspunkt, observere blod og bløddele fastgjort til knoglen fragmentet (figur 1A). Opnå knoglefragmenter på denne måde fra 22 donorer.
- Hold en knogle fragment ad gangen ved hjælp buede pincet. Svaber det grundigt med bomuld tippes applikator og fjerne eventuelle hjernevæv, blødt væv, og blod (figur 1B). Forsigtigt skåret væk enhver knogle chips, der forbliver knyttet til transplantatet ved hjælp fine sakse, så transplantatet vil have en perfekt afrundet form.
- Dyp hvert transplantat én gang i en 15 ml-rør indeholdende 70% ethanol og to gange i 15 ml rør indeholdende phosphatbufret saltvand for at vaske ethanol.
- Frys allotransplantater i en -80 ° C køleskab i kryorør for påmindst 1 uge. På dette tidspunkt, skal du sørge for allografter synes transparent (figur 1C).
2. calvariale Defekt Kirurgi
- For modtagerne anvender transgene mus, som udtrykker luciferase under styring af osteocalcin promotoren 6.
- Sterilisere spidserne af de kirurgiske værktøjer ved hjælp af en glasperle varmeapparat til 30 sek. Overfør værktøjerne til en beholder indeholdende 70% isopropanol for at opretholde sterile betingelser. Brug sterile handsker.
- Bedøver en 7- til 8-uger gamle hunmus ved intraperitoneal injektion af en ketamine- medetomidin blanding (75 mg / kg og 1 mg / kg). Klem dyret lemmer for at sikre det er dybt bedøvet. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det genvandt tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Barbere den calvariale regionen ved hjælp af en hårklipper ved at anvende den mod hårenes vækst. Påfør hår fjernelse creme for at fjerne eventuelle pels rester og tør den afteR ikke længere end 2 minutter under anvendelse af tør gaze efterfulgt af saltvand gaze. Der bør udvises forsigtighed for at undgå at få det i øjnene. Alternativt kan dyrlægen øjensalve anvendes forud for hårfjerning som et ekstra lag af beskyttelse for øjnene. Det er bydende nødvendigt, at alle spor af hårfjerningsmiddel fjernes for at undgå mulig irritation fra overdreven udsættelse for kemiske middel. Desinficere hovedbunden ved at anvende 5% chlorhexidin (figur 1D).
- Injicer subkutant 5 mg / kg carprofen fortyndet i 200 pi saltvand. Anvend dyrlæge øjensalve at forhindre tørhed og holde dyret på en termisk pude på alle tidspunkter. Placer dyret under de opererer kikkert.
- Lav en 1-cm-lange ovale snit i hovedbunden huden ved hjælp af fine saks og pincet (Figur 1E). Hold periosteum hjælp buede pincet og skåret væk ved hjælp af fine sakse.
- Bor den calvariale defekt 2 mm forreste til den lambdoid sutur ved hjælp af en tandlægebor ennd 5 mm ydre diameter trepan (figur 1F og G). For at undgå indtrængning af dura mater, bore tre fjerdedele af vejen ind i knoglen og tag knoglen fragmentet ved hjælp af en spatel.
- At implantere en autotransplantat, hente knoglen fragment og vaske det i en 10 mm plast plade indeholdende 10 ml sterilt saltvand for at fjerne snavs. Fjern ikke det bløde væv. At implantere et allotransplantat, tø på forhånd en allograft og normalisere det til RT, og derefter vaske det.
- Placer knogletransplantation i defekten ved hjælp buede pincet så det vil ikke røre ved defekte marginer (Figur 1 H). Lim transplantatet til værten knoglen ved hjælp af fibrin gel (5 pi 46 mg / ml fibrinogen blandet med 5 pi 25 U / ml thrombin).
- Sy huden ved hjælp af 4-0 vicryl sutur (fig 1I). Anvend povidon-iod til det kirurgiske snit. Der bør udvises omhu for at forhindre forurening af sutur af pels. Markér musen øret og injicere 0,25 mg / kg Antisedan to vende den anæstetiske virkning af medetomidin.
- Hvis dyret er vågner op i 10 minutter, sørg for at det er beliggende på en opvarmet pude. Injicer 200 pi sterilt saltvand, og om nødvendigt Injicer 0,1 mg / kg Antisedan. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Holde dyrene i adskilte bure i en uge for at forhindre dem i at åbne suturerne. Placer musefoder opløst i vand i en petriskål på burets gulv for et par dage efter operationen. Injicer subkutant 200 pi 1 mg / ml Carprofen fortyndet i sterilt saltvand en gang dagligt i 3 dage efter operationen til behandling af post-operative smerter.
Figur 1. calvariale allograft Forberedelse og calvarie Defekt kirurgi. Knoglefragmentet isoleres fra calvariale region (A). Blødt væv, Knoglemarv og blod penslet (B), og transplantatet er skyllet i 70% ethanol efterfulgt af to vaske i phosphatbufret saltvand (C, AG = allograft). Modtageren musen er klar til kirurgi ved barbering og desinfektion af huden i calvariale region (D). En oval cut skabes i hovedbunden hud og periosteum fjernes (E). Dernæst calvariale defekt boret under anvendelse af en 5-mm-diameter trepan (F). Knoglefragmentet frigøres ved hjælp af en skeformede spatel, hvorefter den overlegne sagittal sinus intakt (G). Allograft placeres derefter i defekten og sikret med fibrin gel (H). Endelig er huden sutureres (I). Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Mikro-Computed Tomography til karakterisering afDen vaskulære træ
- Forbered hepariniseret saltvand. Vægt 2.000 U natriumheparin og læg den i 50 ml plastrør. Tilsæt 20 ml saltvand og ryst godt røret. Fyld en 20-ml Luer lock sprøjte med 15 ml varmet hepariniseret saltvand og tilslut sprøjten til en 23-G hovedbund vene sæt. Fastgør sprøjten til en sprøjte pumpe, og sæt den til at pumpe 10 ml ved 1 ml / min.
- Adstadige en mus under anvendelse af en intraperitoneal injektion af 50 pi phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Klem dyrets lemmer for at sikre det er dybt bedøvet. Fastgør musen på ryggen til en fiksering bord omviklet med et absorberende overflade liner (figur 2A). Placer den faste mus i et stinkskab for at forhindre personer udsættes for røg.
- Skær hud fra maven til halsen ved hjælp af fine saks og pincet (figur 2B). Skær bugvæggen op til xiphoid fremgangsmåde (figur 2C). Skær brystkassen langs dens laterale aspekt. Undgå skade lungerne and hjerte, og sørg for hjertet er fuldt eksponeret. Brug en hæmostat at trække brystbenet (figur 2D).
- Sæt sommerfuglen nål 3 mm ind i venstre ventrikel (Figur 2E). Lim nålen til hjertet og brystvæggen anvendelse af 3-sec lim (figur 2F).
- Aktivere pumpen straks. Efter et minut, dissekere vena cava inferior med henblik på at tage trykket vaskulaturen (figur 2G). Vip brættet, så væsker vil flyde væk fra hovedet. Vellykket perfusion vil resultere i at rydde lever og blodkar.
- Når hepariniserede saltopløsning perfusion er afsluttet, perfundere 10 ml 4% formaldehyd. Undgå gennemtrængning af luftbobler i karrene og undgå udsættelse for formaldehyd dampe. Vellykket formaldehyd perfusion vil resultere i stivhed af halen. Udskylning af formaldehyd med 10 ml hepariniserede saltopløsning.
- Forbered radiopage kontrastmiddel ifølge manufacturer instruktioner. Typisk vil det kræve blanding af forbindelsen, fortyndingsmiddel og et hærdemiddel. Brug serologiske pipetter og bland opløsningen i et 15 ml plastrør.
- Perfundere dyret med kontrastmidlet blandingen med en hastighed på 1 ml / min. Overhold koronare, tarm og hepatiske blodkar og sørg for at de vender gult efter perfusion af 2 - 3 ml, hvilket indikerer vellykket perfusion (Figur 2H). Ved afslutningen af perfusion, skære sommerfuglen nål s slanger, få kroppen alene og pak det med toiletpapir for at forhindre lækage af løsningen på den calvariale region. Tillad polymerisation i 4 ° CO / N.
- Dissekere calvariale region (fig 2I); Brug først en skalpel til at skære huden som lateral som muligt for at undgå at beskadige skallepartiet af interesse. Find knogletransplantation og derefter bruge fine saks til at klippe den craniale knogle 10 mm væk fra transplantatet.
- Scan den isolerede Calvarial knogle prøve ved hjælp af en μCT scanner; sæt synsfelt til 20,5 mm, X-ray energi på 55 kVp, intensitet på 145 uA, ved anvendelse af 1000 fremspring pr 360 ° og integrationstid på 200 ms. Juster μCT parametre 7 til Image andre knogle defekt modeller.
- Overhold 2D rekonstrueres skiver, der blev genereret af μCT softwaren. Sørg for at scanne området af interesse er korrekt og find derefter calvariale defekt. Vurdere kvaliteten af perfusionen. Efter en vellykket identifikation af blodkar (figur 2J), fortsætte og afkalk prøven ved hjælp af 6% trichloreddikesyre (TCA) fortyndet i Dobbelt destilleret vand (DDW).
- Scanne prøven ved hjælp af parametrene er angivet i afsnit 3.10. Find den Lambdoid sutur i rekonstruerede 2D skiver. Definer et cylindrisk volumen af interesse (VOI) i højden på 2 mm og 8 mm i diameter, der er tangent til sutur - det er den anatomiske stedet for defekt.
- Segment the knoglevæv fra blødt væv under anvendelse af en global tærskelværdiansættelse procedure; indstille lavere tærskel til 130, og anvende en begrænset 3D Gauss filter (sigma [σ] = 2,0 og support = 2) til delvis undertrykke støj i mængder. Generer en 3D-rekonstruktion og sørg for VOI er placeret (figur 2K) ordentligt.
- Generer en tykkelse kort ved hjælp af IPL-softwaren og "dt_object_param" funktion (figur 2L).
BEMÆRK: Denne funktion beskrives volumen fartøj for hver diameter fartøj.
Figur 2. Perfusion anvendelse af en radiopage middel via hjertets tilgang. Musen anbringes på fiksering bord (A), og huden er skåret langs maven op til halsen (B). Bugvæggen skæres langs den mediale line op til formet som et sværd process (C), og brystkassen skæres lateralt (D). En sommerfugl nål indsættes i den venstre ventrikel, så man undgår indføring i højre ventrikel, som er markant mørkere (E, er den højre ventrikel angivet ved den hvide stiplet linie), og nålen er fastgjort til hjertet og brystvæggen (F) . Hepariniseret saltvand (2-3 ml) pumpes ind i hjertet, og vena cava inferior dissekeres (G, hvid pil angiver vena cava inferior). Formaldehyd (4%) perfunderes og vaskes ud; dette efterfølges af en perfusion af gul-farvet radiopage kontrastmiddel. Vellykket perfusion vil være tydeligt ved afslutningen af blodkar, som skifter farve til gul (H). Efter polymerisering er calvariale region isoleret (I, AG = allograft) og afbildes ved hjælp af en scanner μCT at bekræfte korrekt perfusion (J, volumen af interesse er markeret med orange). DePrøven er afkalket og scannes igen (K), efterfulgt af generering af en farvet tykkelse kort (L). Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Fluorescens Imaging af knoglemineralisering og Blood Perfusion
- Rekonstruere prober til en koncentration på 2 nmol / 100 pi PBS i et 1,5 ml rør (brug et bisphosphonat-konjugeret fluorescerende probe til overvågning af knoglemineralisering og en blodbårne fluorescerende middel til at måle blodperfusion). Pipette forsigtigt flere gange for at sikre homogen opløsning af sonden.
- 24 timer før den udpegede imaging session tager en time-nul billede; bedøver 3 mus ved hjælp af 2 l / min indånding af 100% medicinsk kvalitet ilt suppleret med 3% isofluran i en induktion kammer. Efter at der er etableret en ordentlig anæstesi, sænke isofluran koncentration til 1,5% - 2%.
- Påfør dyrlæge øjensalve til at forhindre tørhed og sørg for termisk pude er tændt hele tiden. Klem dyret lemmer for at sikre det er dybt bedøvet. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det genvandt tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Barbere den calvariale regionen ved hjælp af en hårklipper anvende det mod hårenes vækst. Fjern skind rester hjælp hår-fjernelse creme. Alle fur rest vil forstyrre optisk afbildning. Fjern suturer hjælp fine saks og pincet.
- Placer tre dyr på IVIS scenen opvarmet til 37 ° C for hver billeddannelse session. Indstil eksponeringen tid til auto, se felt til C, og justere filtre. Fx til et bisphosphonat-konjugeret fluorescerende probe karakteriseret med maksimal excitation ved lys bølgelængde på 680 nm, bruge et magnetisering filter på 675 nm og en emission filter Cy5.5 . Ligeledes når der anvendes en blodbårne fluorescerende middel med peak excitation ved lysbølgelængde 750 nmbruge en magnetisering filter 710 nm og en emission filter på 780 nm.
- Billede musene gennem Living Billede software ved at trykke på knappen "Acquire". Sørg for, at calvariale region er helt synlig (figur 3B) For en omfattende guide rådgive Lim et al 2009 8.
- Lad mus til at vågne indånde 100% oxygen.
- Injicere 2-nmol fluorescerende probe via en intravenøs hale injektion. På det angivne imaging session, udfører billedbehandling som beskrevet ovenfor.
5. Mikro-Computed Tomography til Bone Regeneration
- Til kvantificering af knogledannelse, bedøver musen ved inhalation af isofluran 3%, som afbildet i trin 4.2 - 4.3. Overfør musen til μCT scanneren sengen, og læg den i scanneren.
- Indstil μCT scannerens røntgenrøret potentiel energi til 55 kVp og intensiteten af 145 uA medium opløsning. Ved hjælp af et synsfelt på 20,5 mm, udføreen spejder (enkelt røntgen) scanning og definere et område af interesse, der strækker sig fra musens øjne på bagsiden af sin kraniet. Udfør en CT-scanning, ved hjælp af 1.000 projektioner per 360 ° og integration tid på 200 ms.
- Rekonstruere 2D skiver ved hjælp af en nominel rumlig opløsning på 20 pm. Juster defekte marginer til en standardiseret position ved hjælp μCT software 9.
- Svarende til trin 3.20, definere et cylindrisk volumen af interesse og anvende den begrænsede 3D Gauss filter (σ = 0,8 og support = 1) til delvis undertrykke støj i mængder. Segment knoglevævet blødt væv under anvendelse af en global tærskelværdiansættelse procedure.
- Bestem mængden af mineraliseret knoglevæv i mængden af interesse.
6. Bioluminescens Imaging af Stem Cell Rekruttering og Differentiering
- Forbered musen til billeddannelse som afbildet i §§ 4,2-4,4 og vågen musene ved inhalation af 100% ilt.
- Administrer 126 mg / kg beetle luciferin til hver mus via intraperitoneal injektion, og sende dyret tilbage til induktion kammeret. Efter 2 min, bedøver dyret under anvendelse af 3% isofluran. Placer mus på IVIS opvarmet fase.
- Via Living Billede software, indstille eksponeringen tid til at "auto", og synsfeltet til C. billede musene 5 min efter luciferin administration. Billede af dyrene som vist i trin 4.6, ved hjælp af "Bioluminescens" modalitet Definer områder af interesse, fordi transgen ekspression varierer mellem mus. Normalisere calvariale signal til halen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neovaskularisering blev vurderet ved μCT volumetrisk analyse og ved hjælp af en FLI fluorescerende blodbårne agent at kvantificere blodperfusion. Syv dage efter operationen, μCT scanning viste en signifikant højere volumen af små og mellemstore diameter blodkar hos mus, der havde modtaget autotransplantater end i mus, der havde modtaget allotransplantater høstet fra C57BL / 6 (figur 3A). Interessant nok i autograft-gruppen den nydannede vaskulære træ syntes at nå hele defekte område, mens blodkar i allograft gruppen syntes at trænge defektstedet fra yderkanterne og udvidet indad kun i begrænset omfang. Den FLI støttede denne observation, viser signifikant højere blod perfusion i autograft-behandlede dyr (figur 3B). Af 14. dag, i allograft gruppe vaskulære træ nåede alle implantatet nærhed, men beholdervolumen var signifikant lavere sammenligningtil autograft gruppen i de fleste kardiametre, som vi undersøgte (figur 3C). Bemærk: forskelle i fartøj volumen var mest fremtrædende, når skibe med 0.08- til 0,1 mm diameter blev sammenlignet. Otteogtyve dage efter kirurgi vaskulaturen volumen tilbage til baseline (figur 3D).
Syv dage efter operationen, FLI udført under anvendelse af hydroxyapatit-rettet probe udviste signifikant større knoglemineralisering i autograft-gruppen (figur 4A). På det tidspunkt havde knogle dannet hele transplantatet nærhed i autograft-implanterede dyr. I modsætning hertil havde knogle i allograften-implanterede mus dannet kun på de defekte margener og var præget af en ring form. Volumener knogledannelse blev kvantificeret 56 dage efter operationen, ved endepunktet af den regenerative proces ved at udføre μCT analyse (figur 4B). Knoglevolumen var signifikant højere (figur 4C) og graft thickness signifikant større i dyr, der modtog autotransplantater (figur 4D). BLI blev anvendt i osteocalcin-luciferase transgene mus til at overvåge stamcelle rekruttering og differentiering mod osteoblastiske slægt (Figur 4E). Hos mus implanteret med allotransplantater, BLI signal toppede 4 - 7 dage efter operationen, når signalet målt ved calvaria var 15 gange højere end den, der måles ved halen. I autograft-implanterede mus, BLI signal toppede lidt senere, 7 - 10 dage efter operationen, og var signifikant større, nemlig en 2-fold højere calvaria-til-hale-forhold (Figur 4F).
Figur 3. autotransplantat Implantation Letter angiogenese. Calvariale defekter blev skabt i mus. Halvdelen af dyrene fik allotransplantater, og den anden halvdel fik autotransplantater. Demus blev perfunderet med en polymeriserende kontrastmiddel 7 dage efter operationen. Den calvariale region blev isoleret, og prøverne blev afkalket og afbildes ved hjælp af en μCT scanner. En volumetrisk tykkelse kort blev genereret under anvendelse af IPL software (A, n = 3, repræsenterer barer ± SE og stjerner angiver P-værdi <0,05). Mus blev injiceret med en fluorescerende probe blodbårne 6 dage efter operationen. 24 timer senere blev dyrene udsat for FLI og en kvantitativ analyse blev udført (B, n = 5, repræsenterer barer ± SE og stjerner angiver P-værdi <0,05). En μCT-baserede vaskulær analyse blev udført 14 (C) og 28 (D) dage efter operationen (C og D: n = 3, repræsenterer barer ± SE og stjerner angiver P-værdi <0,05). Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 4. Implantation af en autograft fremmer Mere Osteogenesis end Implantation af en allograft. Mus modtog implantater af calvariale autotransplantater eller allotransplantater. Musene blev senere injiceret med en hydroxyapatit-målrettet probe ved IV injektion 6 dage efter operationen. 24 timer senere FLI og en kvalitativ analyse blev udført (A, n = 5, repræsenterer barer ± SE og stjerner angiver P-værdi <0,05). In vivo μCT analyse blev udført 56 dage efter operationen, og en cylindrisk volumen af interesse markeret med Orange blev defineret (B). Bone volumen (C) og graft tykkelse (D) blev kvantificeret (n = 8, repræsenterer barer ± SE og stjerner angiver P-værdi <0,05) .Transgenic mus, der udtrykker luciferase drielv af osteocalcin promotoren fik allotransplantater eller autotransplantater. BLI blev udført 10 dage efter operationen (E) samt på yderligere udpegede tidspunkter. Signalet målt ved calvariale regionen var normaliseret, fordi udtrykket varierer blandt mus (F, n = 8, repræsenterer barer ± SE og stjerner angiver P-værdi <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med multimodale billedteknik er beskrevet her, er at gøre det muligt omhyggelig undersøgelse af angiogenese-osteogenese aksen i forbindelse med kraniel knogletransplantation. Neovaskularisering blev filmede med en μCT protokol, som tillod en nøjagtig høj opløsning 3D demonstration af det vaskulære træ fodring hele kranie defekt. μCT data kan let analyseres under anvendelse af avancerede værktøjer såsom IPL software. For eksempel er tykkelsen analyse vist i figur 3C viste, at de væsentligste forskelle mellem kraniel autograft og allotransplantat er i fartøjer området fra 0,1 til 0,08 mm i diameter, som kendetegner blod arterioler 10. Dette resultat er i overensstemmelse med undersøgelser udført i lang knogle model 11. Det skal bemærkes, at de smalleste påviselige skibe på 0,02 mm diameter er fuldt støbt på grund af viskositeten af radiopage middel. Den største ulempe ved denne metode er, at den medføreraflivning af dyret, og dermed langsgående billeddannelse er umuligt. Flere radiomatte prober er tilgængelige for in vivo vaskulær μCT billeddannelse; Men de er ikke så radio-uigennemsigtige som den tætte polymeriserende sonde, og billedopløsningen opfylder ikke der ydes af ex vivo-metode afbildet her 12. μCT opløsning er begrænset og vil ikke være nyttigt at undersøge blod kapillærer, f.eks. Andet end at, hjulpet af en dygtig hånd denne metode giver en reproducerbar teknik til at studere knogler kar i detaljer.
Et afgørende skridt i de afbildede protokoller er bestemmelse af defekten placering (trin 2.7). Skade på lambdoid sutur vil føre til massive blødning. Ved boring af calvariale defekt, bør der udvises forsigtighed for ikke at forstyrre den slave dura mater og den overlegne sagittale sinus. Sidst, indføring af butterfly-nål i den venstre ventrikel er en delikat procedure (trin 3.4). Hvis nålen er indsatsened i højre hjertekammer, vil kontrastmidlet perfundere lungerne og gå videre til venerne, hvilket fører til dårlig perfusion af calvaria. Hvis nålen er indsat for dybt, vil det perforere bageste hjertet væggen; og hvis nålen ikke er indsat langt nok, kan det let rive væk fra hjertet. Forsøg ikke at re-justere nålens position, som du kan interferere med perfusion. Metoden kan ændres ved hjælp af et sæt af tilgængelige fluorescerende prober; Integrin-α 3 β v -targeted probe kan anvendes til at fremhæve nydannede blodkar, mens cathepsin-K-målrettede probe kan anvendes til at kvantificere osteoklastaktivitet.
I overensstemmelse med vores hypotese, vi observeret, at calvariale autografter har en højere osteogent potentiale end allotransplantater. Dette er sandt for lange knogler samt 13 og kan tilskrives flere faktorer. Først autograft indeholder knogledannende celler, som producerer knoglematrix hele transplantatetoverflade, som det fremgår mineraliseringen-rettet FLI (figur 4A); mens allotransplantater inducerer knappe knogledannelse kun på de defekte marginer. For det andet, BLI af osteocalcin-luc mus afslørede mere osteogen aktivitet i autograft-gruppen, hvilket kan forklares ved tilstedeværelsen af vækstfaktorer, som fjernes i allograft tilberedningsprocessen (Figur 4F). Interessant knoglemineralisering var signifikant højere på dage 6 og 7, når hydroxyapatit-målrettet probe blev administreret, og celledifferentiering ved BLI aktivitet var tydelig senere, mellem dag 7 og dag 10. Vi kan udlede heraf, at jo mere omfattende knoglemineralisering kan i det mindste delvist forklares ved den gunstige kar, der kendetegner autolog knogletransplantation.
Vores resultater viser, at autograft har overlegne osteogene kapacitet; dog skal man tage i betragtning, at autogen knogletransplantation har flere drawbacks. Knogle høst er begrænset i omfang og indebærer sygelighed til donor sted 14-16. Hertil kommer, at forekomsten af knogleautotransplantat resorption ikke er ubetydelig 17-19. Allografter er meget tilgængelige og præsentere en off-the-shelf løsning for klinikeren. Flere værker har vist, hvordan osteo-integration af kraniale allotransplantater kan forbedres på forskellige måder, lige fra at coate allograft med BMP-2-kodende adeno-associeret virus 20,21 til adjuvans terapier såsom intermitterende terapi parathyroid 22. I sidste ende, når allograften evne til at fusionere med knoglen er perfektioneret, vil allotransplantatet blive den foretrukne podning materiale.
I lyset af disse resultater, en særlig interesse ligger i spørgsmålet om, hvordan at modulere neovaskularisering på stedet for knogle regeneration. Direkte tilgang af VEGF overekspression blev fundet ineffektiv, da de danner blodkarrene er utæt og ikke danner en functional netto 23,24. Interessant nok blev det konstateret, at BMP signaltransduktion fører til målrettet dannelse af blodkar 25,26. Desuden blev farmaceutiske agenter 11 og celleterapi 27 vist sig at ændre angiogenese mønstre på knogletransplantation nærhed; begge metoder stede lovende strategier for at øge kraniel knogledefekt healing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
