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Chemistry

पोस्ट स्तंभ derivatization रिएक्शन प्रवाह उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभों का उपयोग

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

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उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) पोस्ट स्तंभ derivatization (PCD) के साथ मिलकर है कि विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला में अनेक मुद्दों को हल करने में उपयोगी है एक शक्तिशाली उपकरण है। यह यौगिकों कि अन्यथा उपलब्ध 1,2 डिटेक्टरों के सूट के साथ undetectable हैं का पता लगाने के लक्ष्य analyte है, जो या चुनिंदा का पता लगाने और quantitation 3-5 के निचले सीमा की अनुमति देता है के संकेत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आदेश से बचने के लिए एक लक्ष्य analyte derivatize मैट्रिक्स प्रभाव 6। आमतौर पर इस्तेमाल किया PCD प्रतिक्रियाओं ऐसे एमिनो एसिड के रूप में amines, की प्रतिक्रिया, ऑर्थो-phthaladehyde 7-9 से, 9,10 या fluorescamine 11,12, (आरओएस) प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की derivatization 2,2-diphenyl- साथ ninhydrin शामिल 1-picrylhydrazil कट्टरपंथी (DPPH •) 13,14 या 2,2'-azino-बीआईएस (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic एसिड (ABTS) 15,16, और आयोडाइड-azide अभिकर्मक के उपयोग derivatize के लिए सल्फर गontaining यौगिकों 17,18।

वहाँ रहे हैं, तथापि, एचपीएलसी सिस्टम 6 के साथ PCD प्रतिक्रियाओं का उपयोग करने के लिए कई कमियां। इनमें मुख्यतः derivatization अभिकर्मक (एस) और डिटेक्टर, जो मिश्रण और प्रतिक्रिया 8 घटित करने के लिए समय की अनुमति के अलावा के बिंदु के बीच प्रतिक्रिया कॉयल का इस्तेमाल होता है। ये प्रतिक्रिया अक्सर 500 μl या उससे अधिक है, जो एचपीएलसी प्रणाली 19 में से बाकी की मात्रा की तुलना में महत्वपूर्ण है की मात्रा है छोरों। इन उच्च मात्रा प्रतिक्रिया का उपयोग क्या प्रतिक्रिया पाश की उपस्थिति के बिना मनाया जाएगा की तुलना में वृद्धि हुई छोरों शिखर को विस्तृत बनाने में परिणाम है। यह छोटा, व्यापक चोटियों quantitation और पता लगाने की उच्च सीमा है कि में यह परिणाम है और नकारात्मक chromatographic संकल्प प्रभाव। 1 आंकड़े और 2 शिखर आकार कि विभिन्न पद स्तंभ प्रतिक्रिया पाश की मात्रा के अलावा से परिणाम की गिरावट पर प्रकाश डाला। इस विश्लेषण94% मेथनॉल के एक मोबाइल चरण रचना और 6% मिल्ली क्यू पानी के साथ प्रदर्शन किया गया था। मोबाइल चरण के प्रवाह की दर 1 मिलीग्राम / मिनट था, इंजेक्शन की मात्रा 20 μl था और विश्लेषण तरंग दैर्ध्य 265 एनएम था। 20 से 1000 μl μl से मृत की मात्रा बदलती के Coils स्तंभ और डिटेक्टर PCD तरीकों में प्रतिक्रिया पाश मृत मात्रा के प्रभाव का अनुकरण करने के लिए के बीच में डाला गया था। इन छोरों 0.5 मिमी आंतरिक व्यास के स्टेनलेस स्टील टयूबिंग से तैयार थे। प्रयोग एक एचपीएलसी एक नियंत्रक (एससीएल-10AVP) से मिलकर व्यवस्था पर प्रदर्शन किया गया था, एक कम दबाव ढाल वाल्व (एफसीएल-10ALVP), एक पंप (नियंत्रण रेखा-20AD), एक इंजेक्टर (एसआईएल-10ADVP), और एक पीडीए डिटेक्टर ( एसपीडी M10ADVP)। मोबाइल चरण एचपीएलसी प्रणाली में शुरूआत से पहले एक degasser के माध्यम से लगाया गया था। जुदाई एक 250 मिमी x 4.6 मिमी आईडी 5 माइक्रोन स्तंभ का उपयोग किया गया था। प्रयोगात्मक शर्तों PCD प्रतिक्रियाओं है कि हाल ही में साहित्य में प्रकाशित किया गया के विशिष्ट होने के लिए चुना गया था।

सरल, सबसे आम पद स्तंभ रिएक्टर सेटअप एक गैर-खंडों ट्यूबलर रिएक्टर जो प्रभावी रूप से एक लंबी, पतली ट्यूब के माध्यम से जो तरल प्रवाह कर सकते हैं और प्रतिक्रिया जगह नहीं ले सकता है करार दिया है। इस प्रणाली के शिखर में विस्तार न सिर्फ मृत मात्रा व्यवस्था करने के लिए कहा, लेकिन यह भी ट्यूब के रूप में Iijima एट अल। 8 से प्रकाश डाला के आंतरिक व्यास पर निर्भर है। इसके अलावा, कुंडल ज्यामिति मनाया ब्रांड का विस्तार करने में एक भूमिका निभाता है। स्टीवर्ट ने कहा कि 20 रिएक्टर की coiling बदलता माध्यमिक प्रवाह प्रोफाइल, बेहतर मिश्रण में जिसके परिणामस्वरूप, जिसका अर्थ है कि मृत मात्रा को कम किया जा सकता है। यह कहा गया है कि शिखर विस्तार महत्वपूर्ण है जब 21 का तार बुना हुआ एक खुला ट्यूबलर का उपयोग नहीं कर रहा है। जब पीक विस्तार जरूरत से ज्यादा बड़ी है, रिएक्टरों के अन्य प्रकार के भी 20,22 माना जा सकता है। ये बिस्तर रिएक्टरों या खंडों प्रवाह रिएक्टरों शामिल हो सकते हैं। इन रिएक्टरों धीमी प्रतिक्रिया है कि अन्यथा requir होगा के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैंई बड़ी प्रतिक्रिया छोरों। के रूप में गैर-खंडों ट्यूबलर रिएक्टरों PCD अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया रिएक्टरों का सबसे आम प्रकार, रिएक्टर की स्थापना के इस प्रकार के साथ यह लेख सौदों के बाकी हैं।

प्रतिक्रिया प्रवाह (आरएफ) स्तंभ के डिजाइन एक बहु बंदरगाह अंत संयोग ही है कि मोबाइल चरण या तो एक या स्तंभ के रेडियल मध्य क्षेत्र बाहरी पर स्थित तीन बंदरगाहों पर स्थित बंदरगाह के माध्यम से बाहर निकलने के लिए (या प्रवेश) स्तंभ की अनुमति देता है शामिल स्तंभ की दीवार क्षेत्र (चित्रा 3 देखें)। इन दो धाराओं का अंत एक केंद्रीय झरझरा मिलाना कि एक अभेद्य अंगूठी एक बाहरी झरझरा मिलाना है कि स्तंभ दीवार से बाहर फैली से घिरा बारी में है कि से घिरा हुआ है जिसमें फिटिंग का उपयोग कर अलग हो रहे हैं। केंद्रीय अभेद्य अंगूठी पार प्रवाह के कारण दो झरझरा क्षेत्रों के बीच संभव नहीं है।

प्रतिक्रिया प्रवाह क्रोमैटोग्राफी के दौरान, derivatization अभिकर्मक (एस) एक या tw में मोबाइल चरण प्रवाह की दिशा के खिलाफ पंप हैंप्रतिक्रिया प्रवाह स्तंभ की बाहरी बंदरगाहों में से ओ। स्तंभ eluent एक नि: शुल्क बाहरी बंदरगाह के माध्यम से बाहरी मिलाना में derivatization अभिकर्मक (एस) के साथ मिलाया जाता है और डिटेक्टर को पारित कर दिया है। रिएक्शन प्रवाह या तो एक एकल अभिकर्मक derivatization के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक दोहरी अभिकर्मक प्रणाली (derivatization अभिकर्मकों के लिए 2 बंदरगाहों और 1 के लिए बंदरगाह (derivatization अभिकर्मक के लिए 1 बंदरगाह, 1 बंदरगाह डिटेक्टर और 1 बंदरगाह अवरुद्ध करने के लिए स्तंभ eluent पारित करने के लिए) डिटेक्टर के लिए स्तंभ eluent) से गुजरती हैं। केंद्रीय धारा से प्रवाह या तो underivatized स्तंभ eluent, प्रभावी ढंग से बहुसंकेतन का पता लगाने के 23, या बर्बाद करने के लिए पारित पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक प्रमुख ट्यूनिंग तकनीक उपलब्ध है कि जब चल आरएफ PCD क्रोमैटोग्राफी मध्य और परिधीय प्रवाह का अनुपात है। प्रत्येक derivatization के लिए इष्टतम अनुपात में इस तरह के केंद्रीय प्रवाह या पता लगाया जाएगा कि क्या बर्बाद करने के लिए पारित जैसे कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है। इसलिए एक बार इष्टतम अनुपात निर्धारित किया गया हैयह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि सही प्रवाह अनुपात प्रत्येक रन प्रदर्शन किया जा रहा से पहले हासिल की है।

यह पाया गया है कि एक मिलाना के उपयोग स्तंभ eluent धारा और पारंपरिक मिश्रण तकनीक है कि आम तौर पर एक शून्य मृत मात्रा टी-पीस या कम मृत मात्रा को रोजगार के साथ तुलना में अधिक कुशल मिश्रण में आरएफ PCD परिणामों में derivatization अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए डब्ल्यू टुकड़ा दो धाराओं मिश्रण करने के लिए। इस अपेक्षाकृत छोटे प्रतिक्रिया छोरों के उपयोग के लिए अनुमति दी है, या पूरी तरह प्रतिक्रिया पाश का भी उन्मूलन किया है। तेज चोटियों में प्रतिक्रिया पाश आकार परिणामों की कमी पारंपरिक पोस्ट स्तंभ derivatization तरीकों की तुलना में। इसका मतलब यह है कि तथ्य यह है कि स्तंभ eluent के सभी नहीं derivatized है के बावजूद, शोर अनुपात करने के लिए अधिक से अधिक संकेत मनाया जाता है और पता लगाने और quantitation की इसलिए निचली सीमाएं प्राप्त किया जा सकता है।

रिएक्शन प्रवाह क्रोमैटोग्राफी PCD प्रतिक्रिया के रूपांतरण के साथ कठिनाइयों को दूर करने के लिए विकसित किया गया हैआधुनिक एचपीएलसी स्तंभों और प्रणालियों, बैंड को विस्तृत बनाने की वजह से दक्षता में विशेष रूप से हानि बड़े पद स्तंभ मृत बड़ी मात्रा में प्रतिक्रिया छोरों को रोजगार के लिए जरूरत की वजह मात्रा के कारण के लिए है। आरएफ PCD में और अधिक कुशल मिश्रण प्रक्रियाओं पारंपरिक PCD की तुलना में इसका मतलब यह है कि छोटे प्रतिक्रिया पाश मात्रा में मनाया जुदाई दक्षता में वृद्धि करने के लिए अग्रणी नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा आरएफ PCD क्रोमैटोग्राफी दोनों संकेत वृद्धि हुई है और पारंपरिक तरीकों की तुलना में PCD का पता लगाने और quantitation के निचले सीमा में जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक PCD तकनीकों की तुलना में कमी आई शोर से पता चलता है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में PCD आरएफ PCD का एक अतिरिक्त लाभ underivatized धारा है कि आरएफ स्तंभ के केंद्रीय बंदरगाह के रूप में अच्छी तरह से derivatized धारा उस स्तंभ के परिधीय क्षेत्र से elutes से elutes निगरानी करने की क्षमता है। आरएफ PCD एक अपेक्षाकृत नया है लेकिन होनहार तकनीक है कि पारंपरिक PCD तरीकों पर कई फायदे को प्रदर्शित करता है।

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Protocol

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सावधानी: कृपया सभी सामग्री और अभिकर्मकों के लिए सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) के लिए उपयोग करने से पहले (यानी मेथनॉल के लिए, एमएसडीएस) देखें। जब सॉल्वैंट्स और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) eluent से निपटने के लिए सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग सुनिश्चित करें। एचपीएलसी, विश्लेषणात्मक संतुलन और डिटेक्टर इंस्ट्रूमेंटेशन इंजीनियरिंग नियंत्रण के उचित उपयोग सुनिश्चित करने, और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पैंट पूरी लंबाई, और बंद पैर की अंगुली जूते) का उपयोग किया जाता है।

नोट: इस प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रतिक्रिया प्रवाह के बाद स्तंभ derivatization के 3 तरीकों (आरएफ PCD) तकनीक का वर्णन ब्याज की एक रासायनिक यौगिक की प्रकृति के विशिष्ट एक अलग अभिकर्मक के साथ। आरओएस के विश्लेषण के लिए, "का उपयोग 1. आरओएस की जांच DPPH •" अनुभाग पर जाएँ प्राथमिक amines अनुभाग देखें के विश्लेषण के लिए "2. fluorescamine का उपयोग कर प्राथमिक amines की जांच", और phenolic यौगिकों के विश्लेषण के लिए खंड "3 करने के लिए जाना । फिनोल की जांच4-aminoantipyrene और पोटेशियम ferricyanide "का उपयोग। भर में अति शुद्ध पानी (जैसे, मिल्ली क्यू पानी) का प्रयोग करें।

नोट: आरएफ स्तंभ के कनेक्शन प्रमुख अंतर एक आरएफ स्तंभ पर अंत फिटिंग की संख्या होने के साथ एक पारंपरिक एचपीएलसी स्तंभ के रूप में लगभग एक ही तरीके से हासिल की है। एचपीएलसी प्रणाली के लिए एक मानक एचपीएलसी स्तंभ कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया फिटिंग एचपीएलसी प्रणाली के लिए एक आरएफ स्तंभ कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने में सक्षम हैं।

1. आरओएस का पता लगाने का उपयोग DPPH

  1. एचपीएलसी साधन की स्थापना
    1. लाइन एक पर 100% पानी और मोबाइल चरण के रूप में लाइन बी पर 100% मेथनॉल के साथ एचपीएलसी साधन तैयार करें। निर्माता की जरूरतों के अनुसार पंप पर्ज।
    2. एचपीएलसी भूमिका निभाई घटकों और अतिरिक्त derivatization पंप चित्रा -4 ए में सचित्र के रूप में सेट करें।
    3. 520 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर विश्लेषण करने के लिए यूवी विज़ डिटेक्टर सेट करें।
  2. की स्थापनाआरएफ स्तंभ
    1. एचपीएलसी साधन के लिए आरएफ स्तंभ के इनलेट कनेक्ट करें।
    2. आरएफ स्तंभ के केंद्रीय बंदरगाह आउटलेट के लिए 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई कनेक्ट करें।
    3. यूवी विज़ डिटेक्टर 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई का उपयोग करने के लिए एक दुकान परिधीय पोर्ट से कनेक्ट।
    4. आरएफ स्तंभ के आउटलेट पर एक परिधीय बंदरगाह के लिए DPPH पंप लाइन कनेक्ट।
    5. एक स्तंभ डाट का उपयोग कर आरएफ स्तंभ के आउटलेट पर अप्रयुक्त परिधीय बंदरगाह ब्लॉक।
    6. 100% मेथनॉल - एचपीएलसी पंप के प्रवाह की दर 1 मिलीलीटर मिनट के लिए ले आओ -1 100% लाइन बी पर।
    7. एक 4.6 मिमी आईडी x 100 मिमी लंबाई स्तंभ के लिए 10 मिनट के लिए 100% मेथनॉल मोबाइल चरण के साथ स्तंभ संतुलित करना। इस बार अन्य स्तंभों उपयोगकर्ता काम कर सकते हैं के आयामों के अनुसार बढ़ाया जाना चाहिए।
  3. DPPH अभिकर्मक की तैयारी
    1. मेथनॉल में DPPH की एक 0.1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है। 10 मिनट के लिए DPPH अभिकर्मक युक्त कुप्पी Sonicate।
    2. प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के लिए पन्नी में कुप्पी कवर।
    3. शुद्ध निर्माता की जरूरतों के अनुसार तैयार DPPH अभिकर्मक के साथ DPPH पंप।
  4. आरएफ स्तंभ आउटलेट ट्यूनिंग
    1. सही दो साफ और शुष्क वाहिकाओं तौलना। केंद्रीय रूप में एक पोत और परिधीय के रूप में अन्य लेबल।
    2. प्रवाह पोत 1.0 मिनट के लिए केंद्रीय लेबल में केंद्रीय बंदरगाह बाहर निकलने लीजिए।
    3. केंद्रीय बंदरगाह पोत पुन: वजन और इस प्रकार के रूप में केंद्रीय बंदरगाह से प्रवाह के वजन की गणना:
      केन्द्रीय पोर्ट (छ) के वजन = केन्द्रीय पोर्ट पोत (छ) के अंतिम वजन - केन्द्रीय पोर्ट पोत की प्रारंभिक वजन (छ)
    4. दोहराएँ 1.4.2 और 1.4.3 कदम प्रवाह यूवी विज़ कि आरएफ स्तंभ के परिधीय बंदरगाह से जुड़ी है और परिधीय बंदरगाह पोत के लिए वजन की गणना की जाती है बाहर निकलने के लिएइस प्रकार है:
      परिधीय पोर्ट (छ) के वजन = परिधीय पोर्ट पोत (छ) के अंतिम वजन - परिधीय पोर्ट पोत की प्रारंभिक वजन (छ)
    5. प्रवाह मध्य और परिधीय बंदरगाहों से आने वाले इस प्रकार के रूप में के प्रतिशत की गणना:
      % केन्द्रीय पोर्ट = केन्द्रीय पोर्ट (छ) का वजन / (केन्द्रीय पोर्ट (छ) + परिधीय पोर्ट (छ) के भार का भार) x 100
      % परिधीय पोर्ट = परिधीय पोर्ट (छ) के वजन / (सेंट्रल पोर्ट (छ) + परिधीय पोर्ट (छ) के भार का भार) x 100
    6. सुनिश्चित केंद्रीय प्रवाह और परिधीय प्रवाह के बीच विभाजन अनुपात 30:70 (: परिधीय केंद्रीय) है। केंद्रीय प्रवाह 30% ऊपर है, तो केंद्रीय बंदरगाह के आउटलेट के लिए 0.13 मिमी आईडी ट्यूबिंग की लंबाई जोड़कर प्रवाह बाहर निकलने की मात्रा को कम। केंद्रीय प्रवाह 30% नीचे है, तो केंद्रीय बंदरगाह से 0.13 मिमी टयूबिंग की लंबाई कम होती है।
    7. दोहराएँ कदम 1.4.1 1.4.6 के लिए जब तक 30:70 का एक विभाजन अनुपात (Central: परिधीय) हासिल की है।
    8. डी के प्रवाह की दर निर्धारित0.5 मिलीलीटर मिनट -1 के लिए पीपीएच अभिकर्मक पंप।
      नोट: आरएफ स्तंभ DPPH अभिकर्मक के साथ स्थापित की अब विश्लेषण के लिए तैयार है। नमूने अब इंजेक्ट किया जा सकता है।
  5. पोस्ट चलाने शटडाउन की स्थिति
    1. एक बार नमूने के सभी, इंजेक्शन दिया गया है यह दर्शाता है कि रन समाप्त हो गया है, derivatization अभिकर्मक पंप प्रवाह बंद करो।
    2. परिधीय बंदरगाह से DPPH अभिकर्मक पंप लाइन निकालें और बंदरगाह डाट।
    3. मोबाइल चरण में जो यह मोबाइल चरण -1 1 मिलीलीटर मिनट पर कॉलम के माध्यम से पारित करने के लिए 10 मिनट के लिए अनुमति देकर संग्रहित किया जा रहा है साथ स्तंभ संतुलित करना।
    4. एचपीएलसी साधन पर मोबाइल चरण पंप के प्रवाह को रोकने।
    5. मेथनॉल के साथ DPPH अभिकर्मक बदलें और अतिरिक्त पंप शुद्ध करना।
      नोट: एचपीएलसी प्रणाली अब बंद हो सकता है।

2. प्राथमिक amines fluoresc का प्रयोग की जांचअमाइन

  1. मोबाइल चरण की तैयारी
    1. मात्रा के कमजोर पड़ने से पहले 5 एम अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 9.0 करने के लिए समाधान के पीएच का समायोजन, 10 मिमी अमोनियम एसीटेट समाधान के लिए एक के 1 एल तैयार करें।
    2. 95:05 (: एसीएन बफर) के एक premixed मोबाइल चरण प्राप्त करने के लिए अमोनियम एसीटेट बफर करने के लिए acetonitrile (ACN) की 52.6 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. एचपीएलसी साधन की स्थापना
    1. मोबाइल चरण के रूप में लाइन एक पर पूर्व मिश्रित तैयार बफर के साथ एचपीएलसी साधन तैयार करें। निर्माता की जरूरतों के अनुसार पंप पर्ज।
    2. एचपीएलसी भूमिका निभाई घटकों और अतिरिक्त derivatization पंप चित्रा -4 ए में सचित्र के रूप में सेट करें।
    3. derivatization पंप करने के लिए एक पल्स dampener तार संलग्न।
    4. सेट-अप प्रतिदीप्ति डिटेक्टर (FLD) 475 एनएम के 390 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ।
  3. आरएफ स्तंभ की स्थापना
    1. वें कनेक्टएचपीएलसी साधन के लिए आरएफ स्तंभ के ई इनलेट।
    2. आरएफ स्तंभ के केंद्रीय बंदरगाह आउटलेट के लिए 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई कनेक्ट करें।
    3. 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई का उपयोग कर FLD डिटेक्टर के लिए आरएफ स्तंभ की एक दुकान परिधीय पोर्ट से कनेक्ट।
    4. आरएफ स्तंभ के आउटलेट पर एक परिधीय बंदरगाह के लिए derivatization पंप लाइन कनेक्ट।
    5. एक स्तंभ डाट का उपयोग कर आरएफ स्तंभ के आउटलेट पर अप्रयुक्त परिधीय बंदरगाह ब्लॉक।
    6. 1 मिलीलीटर मिनट के लिए एचपीएलसी पंप के प्रवाह की दर लाओ -1 100% लाइन पर एक - 10 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर पीएच 9, 5% एसीएन के साथ premixed।
    7. एक 4.6 मिमी आईडी x 100 मिमी लंबाई स्तंभ के लिए 10 मिनट के लिए 100% लाइन एक मोबाइल चरण के साथ स्तंभ संतुलित करना। इस बार अन्य स्तंभों उपयोगकर्ता काम कर सकते हैं के आयामों के अनुसार बढ़ाया जा सकता है।
  4. Fluorescamine अभिकर्मक की तैयारी
    1. एक 0.1 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 fluorescamine अभिकर्मक के 100 मिलीलीटर बनाओ।
    2. <li> 1 मिनट के लिए sonicate।
    3. प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के लिए पन्नी के साथ कवर।
    4. निर्माता की जरूरतों के अनुसार तैयार fluorescamine अभिकर्मक के साथ अभिकर्मक पंप पर्ज।
  5. आरएफ स्तंभ आउटलेट ट्यूनिंग
    1. सही दो साफ और शुष्क वाहिकाओं तौलना। केंद्रीय रूप में एक पोत और परिधीय के रूप में अन्य लेबल।
    2. प्रवाह पोत 1.0 मिनट के लिए केंद्रीय लेबल में केंद्रीय बंदरगाह बाहर निकलने लीजिए।
    3. केंद्रीय पोत पुन: वजन और कदम 1.4.3 में इस प्रकार के रूप में केंद्रीय बंदरगाह से प्रवाह के वजन की गणना।
    4. दोहराएँ कदम 2.5.2 प्रवाह FLD कि आरएफ स्तंभ के परिधीय बंदरगाह से जुड़ी है और परिधीय के लिए वजन की गणना कदम 1.4.4 में इस प्रकार है बाहर निकलने के लिए 2.5.3 करने के लिए।
    5. प्रवाह मध्य और परिधीय बंदरगाहों से आने वाले कदम 1.4.5 में इस प्रकार के रूप में के प्रतिशत की गणना।
    6. सुनिश्चित केंद्रीय प्रवाह और परिधीय के बीच विभाजन अनुपातप्रवाह 43:57 (: परिधीय केंद्रीय) है। केंद्रीय प्रवाह 43% ऊपर है, तो केंद्रीय बंदरगाह के आउटलेट के लिए 0.13 मिमी आईडी ट्यूबिंग की लंबाई जोड़कर प्रवाह बाहर निकलने की मात्रा को कम। केंद्रीय प्रवाह 43% से कम है, तो केंद्रीय बंदरगाह से 0.13 मिमी टयूबिंग की लंबाई कम होती है।
    7. दोहराएँ कदम 2.5.1 2.5.6 के लिए जब तक 43:57 का एक विभाजन अनुपात (Central: परिधीय) हासिल की है।
    8. 0.7 मिलीलीटर मिनट के लिए मोबाइल चरण पंप के प्रवाह की दर सेट -1।
    9. 0.1 मिलीलीटर मिनट में प्रवाह करने के लिए derivatization पंप सेट -1।
      नोट: आरएफ स्तंभ fluorescamine अभिकर्मक के साथ स्थापित की अब विश्लेषण के लिए तैयार है। नमूने अब इंजेक्ट किया जा सकता है।
  6. पोस्ट चलाने शटडाउन की स्थिति
    1. एक बार नमूने के सभी, इंजेक्शन दिया गया है यह दर्शाता है कि रन समाप्त हो गया है, derivatization पंप बंद करो।
    2. परिधीय बंदरगाह और डाट से derivatization पंप लाइन निकालें।
    3. मोबाइल चरण के साथ स्तंभ संतुलित करनाजो यह मोबाइल चरण -1 1 मिलीलीटर मिनट पर कॉलम के माध्यम से पारित करने के लिए 10 मिनट के लिए अनुमति देकर संग्रहित किया जा रहा है।
    4. मोबाइल चरण पंप के प्रवाह को रोकने।
    5. acetonitrile साथ fluorescamine अभिकर्मक बदलें और derivatization पंप शुद्ध करना।
      नोट: एचपीएलसी प्रणाली अब बंद हो सकता है।

3. 4-Aminoantipyrene और पोटेशियम ferricyanide का प्रयोग Phenols की जांच

  1. मोबाइल चरण की तैयारी
    1. मात्रा के कमजोर पड़ने से पहले 5 एम अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 9.0 करने के लिए समाधान के पीएच का समायोजन, 100 मिमी अमोनियम एसीटेट समाधान के लिए एक के 1 एल तैयार करें।
    2. 5 (बफर: मेथनॉल) का 95 एक premixed मोबाइल चरण प्राप्त करने के लिए अमोनियम एसीटेट बफर करने के लिए मेथनॉल के 52.6 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. एचपीएलसी साधन की स्थापना
    1. मोबाइल चरण के रूप में लाइन एक पर पूर्व मिश्रित तैयार बफर के साथ एचपीएलसी साधन तैयार करें। प्रति निर्माता के रूप में पंप शुद्ध 'की आवश्यकताओं।
    2. एचपीएलसी भूमिका निभाई घटकों और दो ​​अतिरिक्त अभिकर्मक पंप चित्रा 4 बी में सचित्र के रूप में सेट करें।
    3. अभिकर्मक पंप से प्रत्येक के लिए एक पल्स dampener तार संलग्न।
    4. 500 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर विश्लेषण करने के लिए यूवी विज़ डिटेक्टर सेट करें।
  3. आरएफ स्तंभ की स्थापना
    1. एचपीएलसी साधन के लिए आरएफ स्तंभ के इनलेट कनेक्ट करें।
    2. आरएफ स्तंभ के केंद्रीय बंदरगाह आउटलेट के लिए 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई कनेक्ट करें।
    3. यूवी विज़ डिटेक्टर 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई का उपयोग करने के लिए आरएफ स्तंभ की एक दुकान परिधीय पोर्ट से कनेक्ट।
    4. प्रत्येक अभिकर्मक (यानी, 4-aminoantipyrene और पोटेशियम ferricyanide) आरएफ स्तंभ के आउटलेट पर एक परिधीय बंदरगाह के लिए पंप लाइन कनेक्ट।
    5. 1 मिलीलीटर मिनट के लिए एचपीएलसी पंप के प्रवाह की दर लाओ -1 100% लाइन पर एक - 100 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर पीएच 9, 5% मेथनॉल के साथ premixed।
    6. स्तंभ डब्ल्यू संतुलित करनाएक 4.6 मिमी आईडी x 100 मिमी लंबाई स्तंभ के लिए 10 मिनट के लिए 100% लाइन एक मोबाइल चरण ith। इस बार अन्य स्तंभों उपयोगकर्ता काम कर सकते हैं के आयामों के अनुसार बढ़ाया जा सकता है।
  4. 4-aminoantipyrene अभिकर्मक की तैयारी
    1. कदम 3.1.1 का पालन करते हुए 9 के एक पीएच के साथ एक अमोनियम एसीटेट बफर तैयार करें।
    2. 150 मिलीग्राम वजन 4-aminoantipyrene और तैयार अमोनियम एसीटेट बफर (पीएच 9) की 100 मिलीलीटर में भंग।
    3. 1 मिनट के लिए Sonicate।
    4. प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के लिए पन्नी के साथ कवर।
    5. निर्माता की जरूरतों के अनुसार तैयार 4-aminoantipyrene अभिकर्मक के साथ पहले अभिकर्मक पंप पर्ज।
  5. पोटेशियम ferricyanide अभिकर्मक की तैयारी
    1. पोटेशियम ferricyanide की 150 मिलीग्राम वजन और कदम 3.1.1 के अनुसार तैयार अमोनियम एसीटेट बफर के 100 मिलीलीटर (पीएच 9) में भंग।
    2. 1 मिनट के लिए Sonicate।
    3. पन्नी में कवर प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए।
    4. Purgनिर्माता की जरूरतों के अनुसार तैयार पोटेशियम ferricyanide अभिकर्मक के साथ ई दूसरे अभिकर्मक पंप।
  6. आरएफ स्तंभ की ट्यूनिंग
    1. सही दो साफ और शुष्क वाहिकाओं तौलना। केंद्रीय रूप में एक पोत और परिधीय के रूप में अन्य लेबल।
    2. प्रवाह पोत 1.0 मिनट के लिए केंद्रीय लेबल में केंद्रीय बंदरगाह बाहर निकलने लीजिए।
    3. केंद्रीय पोत पुन: वजन और कदम 1.4.3 में इस प्रकार के रूप में केंद्रीय बंदरगाह से प्रवाह के वजन की गणना।
    4. दोहराएँ कदम 3.6.2 प्रवाह यूवी विज़ कि आरएफ स्तंभ के परिधीय बंदरगाह से जुड़ी है और परिधीय के लिए वजन की गणना कदम 1.4.4 में इस प्रकार है बाहर निकलने के लिए 3.6.3 करने के लिए।
    5. प्रवाह मध्य और परिधीय बंदरगाहों से आने वाले कदम 1.4.5 में इस प्रकार के रूप में के प्रतिशत की गणना।
    6. सुनिश्चित केंद्रीय प्रवाह और परिधीय प्रवाह के बीच विभाजन अनुपात 50:50 (: परिधीय केंद्रीय) है। केंद्रीय प्रवाह 50% से ऊपर है, कमीप्रवाह आउटलेट केंद्रीय बंदरगाह के लिए 0.13 मिमी आईडी ट्यूबिंग की लंबाई जोड़कर बाहर निकलने की राशि। केंद्रीय प्रवाह 50% से कम है, तो केंद्रीय बंदरगाह से 0.13 मिमी टयूबिंग की लंबाई कम होती है।
    7. दोहराएँ कदम 3.6.1 3.6.6 के लिए जब तक 50:50 का एक विभाजन अनुपात (Central: परिधीय) हासिल की है।
    8. 0.5 मिलीलीटर मिनट के लिए 4-aminoantipyrene पंप ​​के प्रवाह की दर सेट -1।
    9. 0.25 मिलीलीटर मिनट के लिए पोटेशियम ferricyanide पंप ​​के प्रवाह की दर सेट -1।
      नोट: आरएफ स्तंभ दो घटक अभिकर्मकों के साथ स्थापित की अब विश्लेषण के लिए तैयार है। नमूने अब इंजेक्ट किया जा सकता है।
  7. पोस्ट चलाने शटडाउन की स्थिति
    1. एक बार नमूने के सभी रन इंजेक्शन दिया गया है समाप्त हो गया है, यह दर्शाता है कि रन समाप्त हो गया है, अभिकर्मक पंप के दोनों बंद करो।
    2. परिधीय बंदरगाहों से अभिकर्मक पंप लाइनों निकालें और उन्हें 0.13 मिमी ट्यूबिंग का एक टुकड़ा 15 सेमी के साथ बदलें।
    3. whi में मोबाइल चरण के साथ स्तंभ संतुलित करनाचर्चा यह मोबाइल चरण -1 1 मिलीलीटर मिनट पर कॉलम के माध्यम से पारित करने के लिए 10 मिनट के लिए अनुमति देकर संग्रहित किया जा रहा है।
    4. एचपीएलसी साधन पर मोबाइल चरण पंप के प्रवाह को रोकने।
    5. बदलें दोनों अभिकर्मक पर अभिकर्मकों मेथनॉल के साथ पंप और निर्माता आवश्यकता के अनुसार अतिरिक्त पंप शुद्ध करना।
      नोट: एचपीएलसी प्रणाली अब बंद हो सकता है।

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Representative Results

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पहले PCD तरीका है कि आरएफ PCD द्वारा उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था एंटीऑक्सीडेंट 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil कट्टरपंथी (DPPH •) 24 का उपयोग करने का derivatization था। यह प्रतिक्रिया Koleva एट अल द्वारा पेश किया गया था। 25 और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया। पता लगाने DPPH के विरंजन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उपस्थिति में कट्टरपंथी मनाया absorbance में एक बूंद में एंटीऑक्सीडेंट परिणामों की इसलिए उपस्थिति पर निर्भर करता है। DPPH प्रतिक्रिया अक्सर 500 μl या अधिक 13-15 के बड़े प्रतिक्रिया छोरों को रोजगार, हालांकि यह पाया गया है कि कोई भी प्रतिक्रिया पाश जब आरएफ PCD स्तंभ का उपयोग आवश्यक था। चित्रा 5 ristretto कॉफी का एक नमूना के दो chromatograms का उपयोग कर derivatized चलता DPPH पारंपरिक PCD और आरएफ PCD इंस्ट्रूमेंटेशन दोनों का उपयोग कट्टरपंथी।

दूसरी PCD तरीका है कि आरएफ PCD द्वारा उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है der हैचार अमीनो एसिड (ग्लाइसिन, leucine, फेनिलएलनिन और नियासिन) derivatization अभिकर्मक 23 के रूप में उपयोग करने का fluorescamine ivatization। विधि मोबाइल चरण रचना, fluorescamine एकाग्रता और fluorescamine प्रवाह की दर आरएफ कॉलम के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित के साथ Udenfriend एट अल। 11 से काम से अनुकूलित किया गया था। पारंपरिक विधि एक दो अभिकर्मक derivatization प्रणाली जहां पीएच 9.0 बफर fluorescamine अभिकर्मक के अलावा पहले प्रवाह धारा में जोड़ा गया था, जबकि आरएफ PCD विधि एक मोबाइल चरण है कि पहले से ही बफर था उपयोग किया है, इस प्रकार केवल एक ही अभिकर्मक derivatization प्रणाली का उपयोग आवश्यकता थी। इस आवेदन के लिए derivatized धारा 390 एक यूवी दृष्टिगोचर डिटेक्टर, जो उत्तेजना तरंगदैर्ध्य प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाने के लिए इस्तेमाल करने के लिए संगत का उपयोग कर एनएम पर विश्लेषण किया गया था। derivatized धारा एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर का उपयोग कर, शोर करने के लिए अधिक से अधिक संकेत दे रही है और पता लगाने और क्वांट की इसलिए निचली सीमाओं का पता लगाया जा सकता हैitation, काम के अनुसार Udenfriend एट अल। 11 से। इसके अलावा, eluent आरएफ PCD सेटअप के केंद्रीय बंदरगाह से आ रही एक दूसरी यूवी दृश्य डिटेक्टर का उपयोग नजर रखी थी।

एमिनो एसिड की derivatization के लिए आरएफ PCD विधि का प्रदर्शन पारंपरिक विधि PCD। टेबल के लिए दोनों आरएफ PCD और पारंपरिक PCD मोड में विश्लेषण अमीनो एसिड से प्रत्येक के लिए quantitation और पता लगाने की 1 सूचियों गणना की सीमा तुलना में था। पता लगाने की सीमा एकाग्रता जहां 2 के शोर अनुपात करने के लिए एक संकेत है, जबकि quantitation की सीमा एकाग्रता जहां 10 के शोर अनुपात करने के लिए एक संकेत प्राप्त किया गया था होना करने के लिए परिभाषित किया गया था प्राप्त किया गया था होना करने के लिए परिभाषित किया गया था। चित्रा 6 चार के एक वर्णलेख चलता अमीनो एसिड पारंपरिक विधि PCD, आरएफ PCD विधि और आरएफ PCD विधि से underivatized धारा का उपयोग का विश्लेषण किया। चित्रा 7 मटर के लिए प्राप्त संकेतों की तुलना हैग्लाइसिन और leucine दोनों पारंपरिक विधि PCD और आरएफ PCD विधि का उपयोग करने के कारण KS। चित्रा जब RF- से पारंपरिक विधि PCD, आरएफ PCD विधि और underivatized धारा का उपयोग का विश्लेषण 8 tryptophan चोटी के शिखर चौड़ाई तुलना PCD विधि।

अंतिम PCD तरीका है कि आरएफ PCD 26 द्वारा उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है चार फिनोल (फिनोल, 4-methoxyphenol, पी -cresol और tocopherol) की derivatization है। विधि मामूली बदलाव के साथ Bigley और Grob 27 से काम से अनुकूलित किया गया था आरएफ कॉलम के साथ उपयोग के लिए विधि अनुकूलन करने के लिए। यह काम एक दो घटक derivatization प्रतिक्रिया जहां दोनों 4-amionantiprine और पोटेशियम ferricyanide का समाधान आरएफ कॉलम के अंत फिटिंग पर स्तंभ eluent करने के लिए जोड़ा गया था का उपयोग किया। यह पाया गया कि जब प्रतिक्रिया के लिए एक आरएफ स्तंभ का उपयोग कर कोई अतिरिक्त पद स्तंभ प्रतिक्रिया छोरों की जरूरत इस्तेमाल किया जाएगा। 9 चित्रा एक वर्णलेख जहां का एक उदाहरण से पता चलता हैएक 21 घटक परीक्षण नमूना है कि कुछ घटक है कि derivatization योजना के लिए एक प्रतिक्रिया और कुछ है कि नहीं है, अलग हो गए थे और पता लगाया derivatized (काला ट्रेस) दिखाने निहित। एक ही मिश्रण भी अलग कर दिया और तुलना (लाल ट्रेस) के लिए underivatized का पता चला था। 9 चित्रा में आरएफ-PCD प्रतिक्रिया आसान दृश्य भेद (डिटेक्टर प्रतिक्रिया प्राप्त सकारात्मक था) के लिए एक नकारात्मक प्रतिक्रिया के रूप में प्रदर्शित किया गया है। चित्रा 10 पी के शिखर आकार की तुलना से पता चलता -cresol दोनों आरएफ PCD स्तंभ का उपयोग derivatized और underivatized।

आकृति 1
चित्रा 1. Chromatographic विभिन्न मृत मात्रा में स्तंभ और डिटेक्टर के बीच कहा के साथ एक एचपीएलसी सिस्टम पर इंजेक्शन hexylbenzene की ओवरले। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. टोल्यूनि, ethylbenzene और propylbenzene विभिन्न मृत मात्रा में स्तंभ और डिटेक्टर के बीच कहा के साथ एक एचपीएलसी सिस्टम पर इंजेक्शन के Chromatographic ओवरले। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. रिएक्शन प्रवाह स्तंभ डिजाइन का चित्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. वाद्य आरएफ PCD की स्थापना की। (ए) एकल अभिकर्मक (यानी, DPPH या fluorescamine derivatization अभिकर्मकों) और (बी) के दोहरे अभिकर्मक (यानी, 4-aminoantipyrene और पोटेशियम ferricyanide derivatization अभिकर्मकों)। कृपया यहाँ क्लिक करें देखने के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्रा 5
चित्रा 5. का उपयोग कर पोस्ट स्तंभ derivatization के बाद पता लगाने के साथ ristretto कॉफी की जुदाई की chromatograms 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil कट्टरपंथी (DPPH •)। Derivatization एक 500 μl प्रतिक्रिया तार के साथ एक पारंपरिक स्तंभ का उपयोग किया गया था (ए) और एक प्रतिक्रिया प्रवाह स्तंभ (बी रोंग>)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 Chromatographic चार अमीनो एसिड के ओवरले (ग्लाइसिन (जी), leucine (एल), फेनिलएलनिन (पी) और नियासिन (टी)) एक PCD अभिकर्मक के बाद के रूप में fluorescamine का उपयोग कर 10 से 1000 पीपीएम की सीमा पद स्तंभ derivatization द्वारा पता लगाया खत्म एचपीएलसी से जुदाई। (ए) पारंपरिक PCD, (बी) आरएफ PCD, और (सी) सेंट्रल (underivatized) आरएफ-PCD से पोर्ट:। Chromatograms इस प्रकार हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 7. ग्लाइसिन (पहली शिखर) और पारंपरिक PCD (लाल ट्रेस) और आरएफ PCD (काला ट्रेस) से leucine (दूसरी चोटी) के लिए प्राप्त संकेतों की तुलना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
(ए) अवधारण समय और (बी) के शिखर मात्रा के आधार पर tryptophan के कारण चोटी के 8 चित्रा शिखर चौड़ाई तुलना। काला ट्रेस पारंपरिक PCD विधि से पता चलता है, लाल ट्रेस आरएफ PCD विधि से पता चलता है और हरे रंग का पता लगाने से पता चलता है आरएफ PCD विधि के केंद्रीय बंदरगाह से underivatized धारा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तम्बू "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> 9 चित्रा
9 चित्रा Chromatographic एक कृत्रिम नमूना की जुदाई। घटकों को शामिल फिनोल (पी), 4-methoxyphenol (एम), पी -cresol (सी) और tocopherol (टी) के साथ ही कई alkylbenzenes, polynuclear सुरभित हाइड्रोकार्बन, anisole, phentanole, कैफीन, फेनिलएलनिन और benzamide। चोटियों मैं लेबल, द्वितीय और तृतीय alkylbenzenes कि अप्रत्याशित रूप से derivatization योजना के लिए दिया जाता है। काला ट्रेस underivatized प्रतिक्रिया 254 एनएम पर एक यूवी डिटेक्टर का उपयोग करते समय लाल निशान 500 एनएम पर derivatized प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिनिधित्व करता है। दृश्य स्पष्टता derivatized प्रतिक्रिया उलटा कर दिया गया है के लिए ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10 चित्रा 10 पी -cresol की Chromatographic प्रतिक्रिया। काला ट्रेस करते हुए लाल ट्रेस derivatized (आरएफ-PCD) 500 एनएम पर प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है underivatized प्रतिक्रिया 254 एनएम पर एक यूवी डिटेक्टर का उपयोग प्रतिनिधित्व करता है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

प्रतिक्रिया प्रकार ग्लाइसिन leucine फेनिलएलनिन tryptophan
लोद (पीपीएम) LOQ (पीपीएम) लोद (पीपीएम) LOQ (पीपीएम) लोद (पीपीएम) LOQ (पीपीएम) लोद (पीपीएम) LOQ (पीपीएम)
आरएफ PCD 6 25 10 100 25 250 50 250
आरएफ PCD केंद्रीय बंदरगाह (underivatized) पता नहीं लगा पता नहीं लगा पता नहीं लगा 1 10
परम्परागत PCD 10 100 50 500 50 500 100 500

तालिका 1 का पता लगाने और चार अलग अलग अमीनो एचपीएलसी से अलग होने के बाद derivatization अभिकर्मक के रूप में fluorescamine का उपयोग कर विभिन्न पद स्तंभ derivatization सिस्टम द्वारा पता लगाया एसिड की quantitation की सीमाएं।

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Discussion

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आरएफ PCD बैंड विस्तार के प्रभाव को कम करने और जुदाई के प्रदर्शन में सुधार प्रतिक्रिया कॉयल के उपयोग के बिना एचपीएलसी प्रवाह के बाद स्तंभ के साथ derivatization अभिकर्मक के कुशल मिश्रण के लिए अनुमति देता है। आरएफ PCD तरीकों में भी पता लगाने की विधि के संबंध में संकेत प्रतिक्रिया में सुधार दिखाया है। Camenzuli एट अल। 28 पहले एक एस्प्रेसो कॉफी नमूने में आरओएस का पता लगाने के लिए DPPH के साथ प्रतिक्रिया प्रवाह स्तंभों के उपयोग रिपोर्ट करने के लिए किया गया था। उनके अध्ययन का विश्लेषण और आरएफ शर्तों के अनुकूलन शामिल अधिकतम प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए, विभिन्न DPPH अभिकर्मक प्रवाह दरों के साथ DPPH सांद्रता का एक सीमा का परीक्षण। यह निष्कर्ष निकाला गया था कि एक DPPH 0.5 मिलीलीटर मिनट की एक DPPH अभिकर्मक प्रवाह की दर के साथ 0.1 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 की एकाग्रता -1 एक बेहतर जुदाई प्रदर्शन (यानी, कार्यकुशलता और संवेदनशीलता) आरएफ PCD के तहत के लिए इष्टतम थाशर्तों DPPH derivatization के पारंपरिक PCD विधि की तुलना में। चित्रा 5 एक एस्प्रेसो कॉफी नमूने में DPPH एंटीऑक्सीडेंट की परख के उपयोग के दो chromatograms से पता चलता है। विशेष रूप से दिलचस्प लगभग 5 मिनट की अवधारण समय के साथ उच्च तीव्रता चोटियों कर रहे हैं। यह देखा जा सकता है कि जब एक 500 μl प्रतिक्रिया पाश, जो पारंपरिक DPPH derivatization तरीकों की खासियत है का उपयोग कर, एक एकल, व्यापक चोटी मनाया जा सकता है। हालांकि, जब आरएफ PCD विधि एक प्रतिक्रिया पाश के लिए आवश्यकता के बिना प्रयोग किया जाता है, यह स्पष्ट हो जाता है कि एक चोटी का उपयोग कर एक 500 μl पाश तथ्य यह दो चोटियों में है मनाया। इसके अलावा, अतिरिक्त विस्तार जब आरएफ PCD सेटअप का उपयोग 5.5 मिनट के बाद देखा जा सकता है। इस प्रकार, का उपयोग कर DPPH •, आरएफ PCD की तकनीक के नमूनों में आरओएस के विश्लेषण के लिए उपयोग कर DPPH आरओएस विश्लेषण के पारंपरिक तरीकों से बेहतर साबित हुई।

साथ आरएफ-PCDfluorescamine अभिकर्मक प्राथमिक अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए उपयोग किया और fluorescamine 20 के साथ PCD के परंपरागत रूपों की तुलना की गई है। आरएफ स्तंभ अंत ढाले भी मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए एक मंच प्रदान के बाद से, underivatized केंद्रीय प्रवाह, यूवी विज़ के माध्यम से नजर रखी थी, जबकि प्रवाह और fluorescamine के बीच derivatization आरएफ अंत फिटिंग के बाहरी क्षेत्र में किया जाता है और यूवी के माध्यम से पता चला था विज़। परीक्षा चार अमीनो एसिड से युक्त मानकों की एक श्रृंखला मल्टिप्लेक्स आरएफ PCD की शर्तों के तहत विश्लेषण किया गया। चित्रा 6 PCD (चित्रा 6A) और आरएफ PCD (derivatized का पता लगाने (चित्रा 6B) की पारंपरिक विधि के लिए chromatographic प्रोफ़ाइल तुलना और underivatized (चित्रा 6C)) एमिनो एसिड की श्रृंखला की। चित्रा 7 पारंपरिक PCD और आरएफ PCD के माध्यम से प्राप्त दो एमिनो एसिड संकेतों के एक उपरिशायी है। यह देखा जा सकता है कि टी के कारण और अधिक कुशल मनाया जुदाईवह प्रतिक्रिया पाश को हटाने के तथ्य यह है कि सभी कॉलम के प्रवाह की derivatized गया था के बावजूद, अधिक से अधिक संकेत प्रतिक्रिया करने के लिए प्रेरित किया है। इसके अलावा, अधिक कुशल derivatization अभिकर्मक मिश्रण योजना कम आधारभूत शोर में हुई, आगे शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ रही है। इस आशय का पता लगाने और quantitation आरएफ PCD विधि तालिका 1 में पारंपरिक PCD विधि की तुलना के लिए गणना की निचली सीमा में वहन किया जाता है। इस प्रवृत्ति को भी चित्रा 5 जहां DPPH करने के लिए एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया के लिए अधिक से अधिक है, में देखा जा सकता है आरएफ PCD विधि पारंपरिक PCD विधि की तुलना में। महत्वपूर्ण शिखर गिरावट chromatograms जहां एक पारंपरिक PCD सेटअप इस्तेमाल किया गया था जो इस विधि के निचले संकेत प्रतिक्रिया की ओर जाता है में मनाया जा सकता है।

8 चित्रा tryptophan के शिखर प्रोफ़ाइल जब आरएफ PCD (दोनों derivatized और underivatized धाराओं) और पारंपरिक PCD द्वारा विश्लेषण तुलना। समय के खिलाफ शिखर प्रोफ़ाइल साजिश रची है जब पीक चौड़ाई सभी मोटे तौर पर इसी तरह की (चित्रा 8A) दिखाई देते हैं। सुधार पारंपरिक PCD की तुलना में आरएफ PCD में पाया स्पष्ट है जब शिखर प्रोफ़ाइल चोटी मात्रा (चित्रा 8B) के खिलाफ साजिश रची है। जब पीक मात्रा के खिलाफ साजिश रची, यह स्पष्ट है कि जब आरएफ PCD चोटी underivatized शिखर की तुलना में गिरावट की एक छोटी राशि से पता चलता है, ह्रास, हालांकि, कम से कम पारंपरिक PCD विधि से मनाया कि की तुलना में है। आरएफ PCD पारंपरिक PCD की तुलना की जुदाई दक्षता में सुधार भी चित्रा 7 जो दोनों पारंपरिक PCD और आरएफ PCD द्वारा derivatization के बाद ग्लाइसिन और leucine के शिखर आकार तुलना में प्रदर्शन कर रहे हैं। यह देखा जा सकता है कि पारंपरिक PCD मोड में ग्लाइसिन और leucine चोटियों मुश्किल से आधारभूत अलग हो रहे हैं, जबकि आरएफ PCD मोड में संकेत दो चोटियों के बीच एक बहुत लम्बी अवधि के लिए बेस लाइन पर है।

एकपारंपरिक तरीकों की तुलना में PCD आरएफ PCD के अतिरिक्त लाभ आरएफ स्तंभ मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए सक्षम करने के केंद्रीय बंदरगाह से underivatized प्रवाह पर नजर रखने की क्षमता है। यह संभव है के रूप में आरएफ अंत फिटिंग के भीतर मिलाना के डिजाइन रेडियल मध्य क्षेत्र में प्रवाह उपयुक्त अंत के परिधीय क्षेत्र में प्रवाह के साथ मिश्रण करने के लिए अनुमति नहीं है, इस प्रकार के बाहरी क्षेत्र से derivatized धारा की निगरानी को सक्षम करने फिटिंग के साथ-साथ केंद्रीय बंदरगाह से underivatized धारा की निगरानी। इस क्षमता fluorescamine 20 से 1 टेबल, जो derivatization के बाद गरीब संकेत प्रतिक्रिया के लिए जाना जाता है में tryptophan के लिए प्राप्त परिणामों से प्रकाश डाला है, हालांकि, अन्य अमीनो एसिड के विपरीत यह एक यूवी डिटेक्टर के लिए एक प्रतिक्रिया जब (280 एनएम) underivatized चलता । दोनों derivatization सिस्टम का पता लगाने और quantitation की सीमा अपेक्षाकृत अधिक थे, लेकिन पता लगाने और quantitation की सीमाओं के लिए टी के लिए बहुत कम थेवह धारा underivatized। क्षमता का उपयोग करना दोनों derivatized और underivatized प्रवाह धाराओं का पता लगाने के मानकों को प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए प्रदर्शन का सबसे बड़ा स्तर देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पर नजर रखने के लिए।

आरएफ अंत फिटिंग के मल्टीपोर्ट डिजाइन दोहरी derivatization अभिकर्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। सलीम एट अल। 23 दो अभिकर्मकों (4-aminoantipyrene और पोटेशियम ferricyanide) 4 aminoantipyrene और पोटेशियम ferricyanide का उपयोग कर PCD के परंपरागत तकनीक की तुलना में phenolic यौगिकों के विश्लेषण के लिए आरएफ PCD शर्तों का उपयोग के प्रदर्शन की जांच की। PCD तकनीक के इस प्रकार के दो पंपों की आवश्यकता है और प्रतिक्रिया प्रत्येक derivatization अभिकर्मक के रूप में DPPH के लिए एक पंप और प्रतिक्रिया पाश का विरोध करने के लिए छोरों। विभिन्न phenolic और Alkylbenzene यौगिकों पारंपरिक और आरएफ PCD की शर्तों के तहत विश्लेषण किया गया। दिलचस्प है, गैर-phenolic यौगिकों कि पारंपरिक विधि के तहत नहीं पाया गया थे तथ्य यह संयुक्त राष्ट्र का पता चलाder आरएफ PCD की स्थिति। आंकड़ा 9 यूवी विज़ chromatographic प्रतिक्रिया और आरएफ PCD एक मानक परीक्षण मिश्रण करने के लिए वर्णमिति प्रतिक्रिया से पता चलता। आरएफ PCD के रूप में 10 चित्र में मनाया इंस्ट्रूमेंटेशन के मामले में एक सरल बनाया PCD तकनीक प्रदान की है। जुदाई प्रदर्शन का समझौता किए बिना, चित्रा 10 पी -cresol के शिखर प्रोफ़ाइल तुलना जब derivatization बिना आरएफ PCD द्वारा विश्लेषण किया है और यह भी। यह देखा जा सकता है कि आरएफ-PCD वर्णलेख के शिखर चौड़ाई बहुत underivatized वर्णलेख के समान है। दो chromatograms के बीच प्रमुख अंतर यह है कि आरएफ PCD वर्णलेख आधार पर थोड़ा व्यापक है। इससे पता चलता है आरएफ PCD तकनीक के कारण कोई चोटी फैलाव के लिए बहुत कम नहीं है। इसी तरह की प्रतिक्रिया 9 चित्रा जो पता चलता है कि यह न केवल पी -cresol शिखर समान शिखर चौड़ाई जब इसकी underivatized शिखर की तुलना में आरएफ PCD द्वारा derivatized है कि में मनाया गया, लेकिन सभी फिनोल और alkylbenzenes कि derivatization योजना के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की इस एक ही प्रवृत्ति देखी गई। हालांकि, दो derivatization अभिकर्मकों के उपयोग के साथ-आरएफ PCD पारंपरिक गैर derivatization विधि के लिए एक समान जुदाई प्रदर्शन प्राप्त की, आरएफ PCD phenolic यौगिकों के चुनिंदा का पता लगाने के लिए अनुमति दी है, जिनमें से एक यह है कि गैर-derivatized की शर्तों के तहत पता नहीं था ।

के रूप में आरएफ PCD पारंपरिक एचपीएलसी-PCD तरीकों में से एक विकास, इस तरह के मोबाइल चरण संरचना के रूप में ट्यूनिंग उपकरण सामान्य एचपीएलसी तरीकों में उपलब्ध सभी और प्रवाह की दर है, इंजेक्शन की मात्रा और विश्लेषण तरंगदैर्ध्य आरएफ PCD तरीकों को लागू कर रहे हैं। इसके अलावा, ट्यूनिंग उपकरण जैसे PCD अभिकर्मक प्रवाह की दर के अनुपात में मोबाइल चरण के साथ ही PCD अभिकर्मक रचना के रूप में पारंपरिक एचपीएलसी-PCD तरीकों में उपलब्ध आरएफ PCD तरीकों को लागू कर रहे हैं। एक अतिरिक्त ट्यूनिंग उपकरण उपलब्ध जब आरएफ PCD का उपयोग करते हुए कि पारंपरिक तरीकों PCD में उपलब्ध नहीं है मध्य और परिधीय से आने वाले प्रवाह का अनुपात हैस्तंभ के बंदरगाहों। प्रवाह लंबाई और / या पोस्ट डिटेक्टर की आंतरिक व्यास को नियंत्रित करने से लाइनों में से प्रत्येक पर रिश्तेदार वापस दबाव में फेरबदल के द्वारा नियंत्रित (या स्तंभ पोस्ट अगर प्रवाह केंद्रीय बंदरगाह से आ नहीं पाया जा रहा है) ट्यूबिंग रहे हैं। परिधीय प्रवाह के लिए केंद्रीय का इष्टतम अनुपात प्रश्न में प्रतिक्रिया है, साथ ही इस तरह के रूप में अन्य कारकों पर निर्भर करता है, केंद्रीय बंदरगाह पता लगाया जा रहा है कि क्या है या नहीं है। 60% और 40% परिधीय केंद्रीय का प्रवाह अनुपात अक्सर एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।

ट्यूनिंग मानकों के साथ के रूप में, मुद्दों है कि आरएफ PCD स्तंभ के उपयोग के साथ पैदा कर सकते हैं के कई लोग भी पारंपरिक तरीकों के साथ PCD आम हैं। एक विशेष पैरामीटर कि chromatographer जब प्रदर्शन आरएफ PCD का विश्लेषण करती है के बारे में पता होना चाहिए प्रवाह और प्रणाली में दबाव की स्थिरता, विशेष रूप से है कि अभिकर्मक पंप (एस) की है। यदि यह प्रणाली में प्रवाह स्थिर नहीं है, यह हो सकता है आधारभूत अस्थिरता इसलिए कम हो रहीशोर अनुपात संकेत और बाद में quantitation और पता लगाने की सीमा।

आरएफ PCD क्रोमैटोग्राफी आधुनिक एचपीएलसी कॉलम और प्रणालियों के लिए PCD प्रतिक्रियाओं अनुकूल ढालने में कठिनाइयों को दूर करने के लिए विकसित किया गया है। पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना PCD आरएफ PCD के प्रमुख लाभ की वजह से यह आरएफ कॉलम के अंत फिटिंग के भीतर एक मिलाना के अंदर जगह लेने के लिए और अधिक कुशल मिश्रण है, और इस मिश्रण को एक से थोड़ा वापस उच्च दबाव में है। इस न्यूनीकरण या बड़ी मात्रा प्रतिक्रिया छोरों कि कई पारंपरिक तरीकों PCD में उपयोग किया जाता है का भी उन्मूलन के लिए अनुमति देता है। पोस्ट स्तंभ मृत मात्रा के इस न्यूनीकरण के साथ, अधिक से अधिक chromatographic संकल्प के साथ और अधिक कुशल विभाजन किया जा सकता है।

आरएफ PCD मोड पारंपरिक PCD तरीकों की तुलना में शोर करने के लिए जुदाई दक्षता, शिखर आकार और संकेत में सुधार में हुई है। हालांकि, यह ध्यान दें कि संकेत सुधार डिटेक्टर निर्भर कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। उदाहरण डिटेक्टरों के लिएकि नमूना राशि निर्भर आरएफ PCD की स्थिति पारंपरिक तरीकों की तुलना तहत संकेत प्रतिक्रिया में वृद्धि का प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं। यह इसलिए है क्योंकि पारंपरिक तरीकों के तहत स्तंभ पर नमूने के 100% का पता चला है, जहां आरएफ PCD की स्थिति केवल स्तंभ पर नमूना का एक निश्चित प्रतिशत के तहत विभाजन अनुपात के आधार पर पता लगाया जाता है। हालांकि यह अनुमान है कि आरएफ PCD प्रतिक्रियाओं किसी भी एक या दो अभिकर्मक लिए अनुकूलित किया जा करने में सक्षम हो जाएगा (जब तक दोनों अभिकर्मकों एक ही समय में जुड़ जाते हैं) कम से कम फिर से अनुकूलन के साथ PCD प्रतिक्रिया और लाभ तीनों के लिए मनाया कि प्रतिक्रियाओं अब तक अन्य सभी PCD प्रतिक्रियाओं के लिए अनुवाद करेंगे परीक्षण किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

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References

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  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
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पोस्ट स्तंभ derivatization रिएक्शन प्रवाह उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभों का उपयोग
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Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

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