A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.
A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.
Højtryksvæskekromatografi (HPLC) kombineret med post kolonne derivatisering (PCD) er et kraftfuldt værktøj, der er nyttige i at løse en række spørgsmål i analyselaboratoriet. Det kan bruges til at detektere forbindelser, som ellers er målbart med suite af detektorer tilgængelige 1,2, forøge signalet af målanalytten, som tillader nedre grænser for detektion og kvantificering 3-5 eller selektivt derivatisere en målanalyt for at undgå matrixeffekter 6. Almindeligt anvendte PCD reaktioner omfatter omsætningen af aminer, såsom aminosyrer, med ortho-phthaladehyde 7-9, ninhydrin 9,10 eller fluorescamin 11,12, derivatiseringen af reaktive oxygenarter (ROS) med 2,2-diphenyl 1-picrylhydrazil radikal (DPPH •) 13,14 eller 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) 15,16, og brugen af iodidet-azidreagens at derivatisere svovl containing forbindelser 17,18.
Der er imidlertid adskillige ulemper ved anvendelsen af PCD reaktioner med HPLC-systemer 6. Hovedsagelig blandt disse er anvendelsen af reaktionsprodukter spoler mellem punktet for tilsætning af derivatiseringen reagens (er) og detektoren, der give tid til blanding og reaktionen at forekomme 8. Disse reaktion sløjfer ofte volumener af 500 pi eller mere, hvilket er signifikant sammenlignet med volumenet af resten af HPLC-systemet 19. Anvendelsen af disse høj lydstyrke reaktion loops resulterer i forøget topforbredning forhold til hvad der ville blive observeret uden tilstedeværelse af reaktionen loop. Dette resulterer i kortere, bredere toppe, der har højere grænser for kvantificering og detektion og negativt påvirker kromatografisk opløsning. Figur 1 og 2 fremhæve forringelse af topform, der skyldes tilsætning af forskellige indlæg kolonne reaktion loop mængder. denne analyseblev udført med en mobil fase sammensætning på 94% methanol og 6% Milli-Q-vand. Strømningshastigheden af den mobile fase var 1 ml / min, injektionsvolumen var 20 pi og analysen bølgelængde var 265 nm. Spoler af varierende døde mængder fra 20 pi til 1000 pi blev indsat mellem søjlen og detektoren at simulere virkningerne af reaktion loop døde volumen i PCD metoder. Disse sløjfer blev fremstillet af rustfrit stålrør på 0,5 mm indvendig diameter. Eksperimentet blev udført på et HPLC-system bestående af en kontroller (SCL-10AVP), en lav trykgradient Ventil (FCL-10ALVP), en pumpe (LC-20AD), en injektor (SIL-10ADVP), og en PDA detektor ( SPD-M10ADVP). Den mobile fase blev pumpet gennem en afgasser før indføring i HPLC-systemet. Separationen blev udført ved anvendelse af en 250 mm id 5 um kolonne x 4,6 mm. Forsøgsbetingelserne var valgt til at være typisk for PCD reaktioner, er for nylig blevet publiceret i litteraturen.
Detenkleste, er mest almindeligt post kolonnereaktoren setup betegnes en ikke-segmenteret rørformet reaktor, som er effektivt en lang, tynd slange, gennem hvilken væsken kan strømme, og reaktionen kan finde sted. I dette system topforbredning er afhængig af ikke blot den døde volumen tilsat til systemet, men også den indre diameter af røret som fremhævet af Iijima et al. 8. Endvidere spole geometri spiller en rolle i den observerede mærke udvidelse. Stewart 20 anførte, at opvikling af reaktoren ændrer den sekundære strømning profiler, hvilket resulterer i bedre blanding, hvilket betyder, at de døde volumen kan minimeres. Det er blevet oplyst, at topforbredning er ikke signifikant, når der anvendes en åben rørformede spole 21. Når topforbredning er alt for store, kan andre typer af reaktorer også overvejes 20,22. Disse kan omfatte bed reaktorer eller segmenterede flow reaktorer. Disse reaktorer er især nyttige til langsomme reaktioner, der ellers ville require stor reaktion sløjfer. Som ikke-segmenterede rørformede reaktorer er de mest almindelige typer af reaktorer, der anvendes i PCD applikationer, resten af denne artikel omhandler med denne type reaktor setup.
Udformningen af reaktionen flow (RF) søjle indeholder en multi-port endefittingen, der tillader mobile fase for at afslutte (eller enter) søjlen gennem enten en enkelt port placeret ved den radiale midterområdet af søjlen eller tre porte placeret ved den ydre vægområde af kolonnen (se figur 3). Disse to strømme adskilles med en ende fitting indeholdende en central porøs fritte, der er omgivet af en impermeabel ring, der igen er omgivet af en ydre porøs fritte, der strækker sig ud til søjlen væg. På grund af den centrale uigennemtrængelige ring cross flow er ikke mulig mellem de to porøse områder.
Under reaktion flow kromatografi er derivatiseringen reagens (er) pumpes mod retningen af mobile fase flow i en eller two af de ydre havne reaktion flow kolonnen. Søjlen eluent blandes med derivatiseringen reagens (er) i den ydre fritte og ledes til detektoren gennem en fri ydre port. Reaktionen flow kan anvendes til enten et enkelt reagens derivatisering (1 port til derivatiseringen reagens til 1 port passere kolonnen eluent til detektoren og 1 port blokeret) eller et dobbelt reagenssystem (2 porte til derivatiseringen reagenser og 1 port til passere kolonnen eluent til detektoren). Strømmen fra den centrale strøm kan enten anvendes til at detektere den uderivatiserede kolonne elueringsmiddel, effektivt multiplexing detektering 23, eller føres til spilde.
En væsentlig tuning teknik, der er til rådighed, når du kører RF-PCD kromatografi er forholdet mellem det centrale og perifere strømme. Det optimale forhold for hver derivatisering afhænger af en række faktorer, såsom hvorvidt den centrale flow vil blive opdaget eller videregivet til spilde. Derfor endnu det optimale forhold er blevet bestemtDet skal sikres, at den korrekte flow-forhold opnås før hver kørsel, der udføres.
Det har vist sig, at anvendelsen af en fritte at blande kolonnen eluent strøm og derivatiseringen reagens i RF-PCD resulterer i mere effektiv blanding sammenlignet med traditionelle blandingsteknikker, der anvender typisk et nul dødvolumen T-stykke eller lavt dødvolumen W- stykke at blande de to strømme. Dette har muliggjort anvendelsen af relativt små reaktionsprodukter loops, eller endda eliminering af reaktionen loop helt. Reduktionen af de reaktion loop format medfører skarpere toppe i forhold til traditionelle indlæg kolonne derivatisering metoder. Det betyder, at større signal-støj-forhold på trods af, at ikke alle af kolonnen eluent er derivatiseret, overholdes, og kan opnås derfor nedre grænser for detektion og kvantificering.
Reaktion flow kromatografi er udviklet til at overvinde vanskeligheder med tilpasning af PCD reaktions til moderne HPLC kolonner og systemer, især tabet i effektivitet skyldes band udvide på grund af store indlæg kolonne døde volumener forårsaget af behovet for at ansætte store mængder reaktion sløjfer. De mere effektiv blanding processer i RF-PCD sammenlignet med konventionel PCD betyde, at mindre reaktionsprodukter loop rumfang kan anvendes fører til en stigning i den observerede adskillelseseffektivitet. Desuden viser RF-PCD kromatografi både øget signal og nedsat støj sammenlignet med konventionelle PCD teknikker resulterer i lavere detektionsgrænser og kvantificering sammenlignet med konventionelle PCD metoder. En yderligere fordel ved RF-PCD sammenlignet med konventionelle PCD metoder er evnen til at overvåge uderivatiserede stream, der eluerer fra den centrale port af RF kolonnen samt den derivatiserede stream, der eluerer fra det perifere område af kolonnen. RF-PCD er en relativt ny, men lovende teknik, der viser mange fordele frem for traditionelle PCD metoder.
<p class="jove_content"> Tilslutning af RF kolonnen opnås i næsten samme måde som en konventionel HPLC-søjle med den væsentligste forskel er antallet af endestykker på en RF-søjle. Fittings bruges til at tilslutte en standard HPLC-kolonne til HPLC-systemet er i stand til at blive brugt til at forbinde en RF kolonne til HPLC-systemet.RF-PCD muliggør effektiv blanding af derivatiseringsreagens med HPLC effluenten post column uden anvendelse af reaktionsprodukter spoler, hvilket minimerer effekterne af bandet udvide og forbedre adskillelse ydeevne. RF-PCD metoder har også vist forbedringer i signal respons med hensyn til påvisningsmetoden. Camenzuli et al. 28 var den første til at rapportere brugen af reaktion flow kolonner med DPPH • til påvisning af ROS i en espresso kaffe prøve. Deres undersøgelse omfattede a…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
Additional Pump(s) for derivatisation system | Shimadzu | LC-20A | |
RF colum | Non-commercial | ||
PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
Column stoppers | Provided with column | ||
PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials | ||
HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method | ||
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |