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Chemistry

Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

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cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada con la columna posterior derivatización (DCP) es una poderosa herramienta que es útil para resolver una serie de problemas en el laboratorio de análisis. Se puede utilizar para detectar compuestos que son de otro modo indetectable con la suite de detectores disponibles 1,2, aumentar la señal del analito diana, lo que permite límites inferiores de detección y cuantificación 3-5 o selectivamente derivatizar un analito diana a fin de evitar 6 efectos de la matriz. Reacciones de PCD comúnmente usados ​​incluyen la reacción de aminas, tales como aminoácidos, con orto-phthaladehyde 7-9, ninhidrina 9,10 o fluorescamina 11,12, la derivatización de las especies reactivas de oxígeno (ROS) con el 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicales DPPH (•) o 13,14 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) 15,16, y el uso del reactivo de yoduro-azida para derivatizar azufre ccompuestos ontaining 17,18.

Hay, sin embargo, numerosos inconvenientes a la utilización de reacciones de PCD con sistemas de HPLC 6. Principalmente entre estos es el uso de bobinas de reacción entre el punto de adición del reactivo de derivatización (s) y el detector, que permiten tiempo para la mezcla y la reacción se produzca 8. Estos bucles de reacción a menudo tienen volúmenes de 500 l o más, lo que es significativo en comparación con el volumen del resto del sistema de HPLC 19. El uso de estos reacción alto volumen bucles de resultados en el aumento ensanchamiento de los picos en comparación con lo que se observaría sin la presencia del bucle de reacción. Esto se traduce en más cortos picos más amplios, que tienen límites más altos de cuantificación y detección y negativamente los efectos que la resolución cromatográfica. Las figuras 1 y 2 destacan el deterioro de la forma de los picos que resultan de la adición de varios volúmenes de bucle de reacción post columna. Este análisisse realizó con una composición de fase móvil de 94% de metanol y 6% de agua Milli-Q. La velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1 ml / min, el volumen de inyección fue de 20 l y la longitud de onda análisis fue 265 nm. Las bobinas de diferentes volúmenes muertos de 20 l a 1000 l se insertaron entre la columna y el detector para simular los efectos de bucle de reacción volumen muerto en los métodos de PCD. Estos bucles se prepararon a partir de tubo de acero inoxidable de diámetro interno 0,5 mm. El experimento se realizó en un sistema HPLC que consta de un controlador (SCL-10AVP), una baja presión del gradiente de la válvula (FCL-10ALVP), una bomba (LC-20AD), un inyector (SIL-10ADvp), y un detector de PDA ( SPD-M10ADVP). La fase móvil se bombea a través de un desgasificador antes de la introducción en el sistema de HPLC. La separación se realizó usando un identificador de 5 micras columna de 250 mm x 4,6 mm. Las condiciones experimentales fueron elegidos para ser típica de las reacciones de PCD que recientemente han sido publicados en la literatura.

losmás simple, la configuración más común de post reactor de columna se denomina un reactor tubular no segmentado que es efectivamente un tubo largo y delgado a través del cual el líquido puede fluir y la reacción puede tener lugar. En este pico del sistema ensanchamiento depende no sólo el volumen muerto añadido al sistema, sino también el diámetro interior del tubo como se destaca por Iijima et al. 8. Por otra parte, la geometría de la bobina juega un papel importante en la ampliación de la marca observada. Stewart 20 declaró que bobinado del reactor cambia los perfiles de flujo secundarias, lo que resulta en un mejor mezclado, lo que significa que el volumen muerto puede ser minimizado. Se ha dicho que ensanchamiento de los picos no es significativa cuando se utiliza un punto tubular abierta bobina 21. Cuando el ensanchamiento de los picos es excesivamente grande, otros tipos de reactores también pueden ser considerados 20,22. Estos pueden incluir reactores de lecho o reactores de flujo segmentados. Estos reactores son particularmente útiles para reacciones lentas que de otro modo requirbucles e gran reacción. Como reactores tubulares no segmentados son los tipos más comunes de los reactores utilizados en aplicaciones de PCD, el resto de este artículo trata con este tipo de configuración del reactor.

El diseño de la columna de flujo de reacción (RF) incorpora un accesorio en el extremo de varios puertos que permite a la fase móvil para salir (o entrar) la columna a través de un puerto único situado en la región central radial de la columna o tres puertos situados en el exterior región de la pared de la columna (véase la Figura 3). Estas dos corrientes se separan usando un accesorio en el extremo que contiene una frita porosa central que está rodeado por un anillo impermeable que está a su vez rodeado por una frita de vidrio poroso exterior que se extiende a la pared de la columna. Debido al flujo transversal anillo impermeable central no es posible entre las dos regiones porosas.

Durante cromatografía de flujo de reacción, el reactivo (s) de derivatización se bombea contra la dirección de flujo de la fase móvil en una o two de los puertos exteriores de la columna el flujo de reacción. El eluyente de la columna se mezcla con el reactivo (s) de derivatización en la frita exterior y se pasa al detector a través de un puerto exterior libre. flujo de reacción se puede utilizar ya sea para una derivatización solo reactivo (1 puerto para el reactivo de derivatización, 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector y 1 puerto bloqueado) o un sistema de reactivos dual (2 puertos para los reactivos de derivatización y 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector). El flujo de la corriente central o bien se puede utilizar para detectar el eluyente de la columna no derivatizado, con eficacia de detección de multiplexación 23, o pasado a los residuos.

Una de las principales técnica de sintonización que está disponible cuando se ejecuta la cromatografía de RF-PCD es la relación de los flujos central y periférico. La relación óptima para cada derivatización depende de una serie de factores tales como si se detecta o se pasa a perder el flujo central. Por lo tanto una vez que la relación óptima se ha determinado, Se debe asegurar que la relación de flujo correcta se consigue antes de cada carrera se realiza.

Se ha encontrado que el uso de una frita para mezclar la corriente de la columna de eluyente y el reactivo de derivatización en los resultados de RF-PCD en una mezcla más eficiente en comparación con técnicas de mezcla tradicionales que emplean típicamente un volumen muerto cero pieza en T o de bajo volumen muerto W- pieza a mezclar las dos corrientes. Esto ha permitido el uso de bucles de reacción relativamente pequeñas, o incluso la eliminación de la del circuito de reacción en conjunto. La reducción de los resultados de la reacción de tamaño de bucle en picos más agudos en comparación con los métodos tradicionales de derivatización post-columna. Esto significa que, a pesar del hecho de que no todo el eluyente de la columna se derivatiza, una mayor relación señal-ruido se observan y por lo tanto los límites inferiores de detección y cuantificación se puede lograr.

cromatografía de flujo de reacción se ha desarrollado para superar las dificultades con la adaptación de la reacción PCDs a modernas columnas de HPLC y los sistemas, en particular la pérdida de eficacia provocada por banda ensanchamiento debido a las grandes columnas poste volúmenes muertos causados ​​por la necesidad de emplear bucles de reacción de gran volumen. Los procesos de mezcla más eficientes en RF-PCD en comparación con PCD convencionales significan que los volúmenes de bucle de reacción más pequeño se pueden emplear conduce a un aumento de la eficacia de separación observada. Además cromatografía RF-PCD muestra tanto el aumento de la señal y el ruido disminuyó en comparación con las técnicas convencionales de PCD que resulta en límites inferiores de detección y cuantificación en comparación con los métodos convencionales de PCD. Una ventaja adicional de RF-PCD comparación con los métodos convencionales de PCD es la capacidad de controlar la corriente no derivatizado que eluye desde el puerto central de la columna de la RF, así como la corriente de derivatizado que eluye de la región periférica de la columna. RF-PCD es una forma relativamente nueva pero prometedora técnica que muestra muchas ventajas sobre los métodos tradicionales de PCD.

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Protocol

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Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los materiales y reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegurar el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manipular disolventes y cromatografía líquida de eluyente alta resolución (HPLC). Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, balanza analítica y un detector de instrumentación, y asegurar el uso de equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados).

Nota: Este protocolo describe 3 métodos de flujo de reacción de derivatización post-columna (RF-PCD) técnicas, cada uno con un reactivo diferente específica a la naturaleza de un compuesto químico de interés. Para el análisis de ROS vaya a la sección "1. La detección de ROS mediante DPPH •", para el análisis de aminas primarias véase la sección "2. Detección de aminas primarias usando fluorescamina", y para el análisis de compuestos fenólicos vaya a la sección "3 . La detección de fenolesutilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio ". Use agua ultra pura (por ejemplo, agua Milli-Q) en todas partes.

Nota: La conexión de la columna de RF se consigue en casi la misma forma que una columna de HPLC convencional con la principal diferencia es el número de accesorios de los extremos en una columna de RF. Accesorios utilizados para conectar una columna de HPLC estándar para el sistema de HPLC son capaces de ser utilizado para conectar una columna de RF al sistema de HPLC.

1. Detección de ROS Utilizando DPPH

  1. Puesta en marcha de instrumento de HPLC
    1. Preparación del instrumento HPLC con 100% de agua en la línea A y 100% de metanol en la línea B como la fase móvil. Purgar las bombas de acuerdo con los requisitos del fabricante.
    2. Configurar los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional como se ilustra en la Figura 4A.
    3. Ajuste el detector de UV-Vis para analizar a una longitud de onda de 520 nm.
  2. Puesta en marcha decolumna de RF
    1. Conectar la entrada de la columna de RF al instrumento HPLC.
    2. Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF.
    3. Conectar un puerto de periféricos de salida al detector UV-Vis utilizando una longitud de 15 cm de tubo Identificación del 0,13 mm.
    4. Conecte la línea de bomba de DPPH a un puerto de periféricos de la salida de la columna de RF.
    5. Bloquear el puerto de periféricos sin utilizar en la salida de la columna de RF usando un tapón de columna.
    6. Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea B - 100% de metanol.
    7. Equilibrar la columna con la fase móvil metanol 100% durante 10 min para una columna mm de longitud 4,6 mm ID x 100. Este tiempo debe hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear.
  3. Preparación de DPPH Reactivo
    1. Preparar una solución / ml 0,1 mg de DPPH en metanol. Sonicar el matraz que contiene el DPPH reactivo para 10 min.
    2. Tapar el matraz en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
    3. Purgar el DPPH bomba con el preparado de DPPH Reactivo de acuerdo con los requisitos del fabricante.
  4. Sintonizar la salida de la columna de RF
    1. Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico.
    2. Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min.
    3. Volver a pesar el recipiente de puerto central y calcular el peso del flujo desde el puerto central de la siguiente manera:
      Peso del puerto central (g) = peso final del puerto central del buque (g) - Peso inicial del puerto central del buque (g)
    4. Repetir los pasos 1.4.2 y 1.4.3 para el efluente que sale de la UV-Vis que está unido al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso de la embarcación puerto de periféricos comosiguiente:
      Peso del puerto de periféricos (g) = peso final del puerto de periféricos de buques (g) - Peso inicial del puerto de periféricos de buques (g)
    5. Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera:
      % Puerto central = Peso del puerto central (g) / (Peso del puerto central (g) + Peso del puerto de periféricos (g)) x 100
      % De puerto de periféricos = Peso del puerto de periféricos (g) / (Peso del puerto central (g) + Peso del puerto de periféricos (g)) x 100
    6. Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el flujo periférico es 30:70 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 30%, disminuir la cantidad de salida de flujo mediante la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm a la salida del puerto central. Si el flujo central está por debajo de 30% de disminución de la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central.
    7. Repita el paso 1.4.1 a la 1.4.6 hasta que una relación de segmentación de 30:70 (central: periférica) se logra.
    8. Ajuste el caudal de la DPPH bomba de reactivo de 0,5 ml min-1.
      Nota: La columna de RF configurado con DPPH reactivo está listo para su análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras.
  5. Pon ejecutar condiciones de parada
    1. Una vez que todas las muestras se han inyectado, lo que indica que la carrera ha terminado, detener el flujo de la bomba del reactivo de derivatización.
    2. Retire la línea de DPPH bomba de reactivo desde el puerto de periféricos y el tapón del puerto.
    3. Equilibrar la columna con la fase móvil en la que se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min.
    4. Detener el flujo de la bomba de la fase móvil en el instrumento de HPLC.
    5. Vuelva a colocar el DPPH reactivo con metanol y purgar la bomba adicional.
      Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado.

2. Detección de aminas primarias Uso de FLUORESCamina

  1. Preparación de la fase móvil
    1. Preparar 1 L de una solución de acetato de amonio 10 mM, ajustando el pH de la solución a 9,0 con hidróxido de amonio 5 M antes de la dilución al volumen.
    2. Añadir 52,6 ml de acetonitrilo (ACN) al tampón de acetato de amonio para obtener una fase móvil premezclada de 95:05 (tampón: ACN).
  2. Puesta en marcha de instrumento de HPLC
    1. Preparación del instrumento HPLC con el tampón preparado pre-mezclado de la línea A como fase móvil. Purgar la bomba de acuerdo con los requisitos del fabricante.
    2. Configurar los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional como se ilustra en la Figura 4A.
    3. Adjuntar una bobina amortiguador de impulsos a la bomba de derivación.
    4. Puesta en marcha del detector de fluorescencia (FLD) con una longitud de onda de excitación de longitud de onda de 390 nm y emisión de 475 nm.
  3. Puesta en marcha de la columna de RF
    1. Conectar THe entrada de la columna de RF al instrumento HPLC.
    2. Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF.
    3. Conectar un puerto de periféricos de salida de la columna de RF al detector FLD utilizando una longitud de 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm.
    4. Conecte la línea de bomba de derivación a un puerto de periféricos de la salida de la columna de RF.
    5. Bloquear el puerto de periféricos sin utilizar en la salida de la columna de RF usando un tapón de columna.
    6. Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea A - 10 mM acetato de amonio tampón de pH 9, premezclado con 5% de ACN.
    7. Equilibrar la columna con la línea de una fase móvil 100% durante 10 min para una columna mm de longitud 4,6 mm ID x 100. Este tiempo puede hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear.
  4. Preparación de reactivo de fluorescamina
    1. Hacer 100 ml de un reactivo de 0,1 mg ml -1 fluorescamina.
    2. <li> Someter a ultrasonidos durante 1 minuto.
    3. Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
    4. Purgar la bomba de reactivo con el reactivo fluorescamina preparados de acuerdo con los requisitos del fabricante.
  5. Sintonizar la salida de la columna de RF
    1. Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico.
    2. Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min.
    3. Volver a pesar el recipiente central y calcular el peso de la corriente desde el puerto central de la siguiente manera en el paso 1.4.3.
    4. Repetir los pasos 2.5.2 a 2.5.3 para el efluente que sale de la FLD que está conectado al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso para periférica de la siguiente manera en el paso 1.4.4.
    5. Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera en el paso 1.4.5.
    6. Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el periféricoflujo es 43:57 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 43%, disminuir la cantidad de salida de flujo mediante la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm a la salida del puerto central. Si el flujo central está por debajo de 43%, disminuir la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central.
    7. Repita el paso 2.5.1 a 2.5.6 hasta una proporción de 43:57 segmentación (central: periférica) se logra.
    8. Ajuste el caudal de la bomba de fase móvil a 0,7 ml min-1.
    9. Ajuste la bomba de derivación a fluir a 0,1 ml min-1.
      Nota: La columna RF configurar con el reactivo de fluorescamina está ahora lista para el análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras.
  6. Pon ejecutar condiciones de parada
    1. Una vez que todas las muestras se han inyectado, lo que indica que la carrera ha terminado, parar la bomba derivatización.
    2. Retire la línea de la bomba de derivación desde el puerto de periféricos y el tapón.
    3. Equilibrar la columna con la fase móvil enque se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min.
    4. Detener el flujo de la bomba de la fase móvil.
    5. Vuelva a colocar el reactivo fluorescamina con acetonitrilo y purgar la bomba de derivación.
      Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado.

3. La detección de fenoles utilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro potásico

  1. Preparación de la fase móvil
    1. Preparar 1 L de una solución de acetato de amonio 100 mM, ajustando el pH de la solución a 9,0 con hidróxido de amonio 5 M antes de la dilución al volumen.
    2. Añadir 52,6 ml de metanol a la solución tampón de acetato de amonio para obtener una fase móvil premezclada de 95: 5 (tampón: metanol).
  2. Puesta en marcha de instrumento de HPLC
    1. Preparación del instrumento HPLC con el tampón preparado pre-mezclado de la línea A como fase móvil. Purgar la bomba de acuerdo con el fabricante; S requisitos.
    2. Configurar los componentes instrumentales de HPLC y las dos bombas de reactivos adicionales, como se ilustra en la Figura 4B.
    3. Adjuntar una bobina amortiguador de impulsos a cada una de las bombas de reactivos.
    4. Ajuste el detector de UV-Vis para analizar a una longitud de onda de 500 nm.
  3. Puesta en marcha de la columna de RF
    1. Conectar la entrada de la columna de RF al instrumento HPLC.
    2. Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF.
    3. Conectar un puerto de periféricos de salida de la columna de RF al detector de UV-Vis usando una longitud de 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm.
    4. Conectar cada reactivo (es decir, 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio) de la línea de la bomba a un puerto de periféricos en la salida de la columna de RF.
    5. Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea A - 100 mM acetato de amonio tampón de pH 9, premezclado con 5% de metanol.
    6. Equilibrar la columna won la línea A de la fase móvil 100% durante 10 minutos para una columna mm de longitud de 4,6 mm de diámetro x 100. Este tiempo puede hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear.
  4. Preparación de reactivo de 4-aminoantipireno
    1. Preparar un tampón de acetato de amonio con un pH de 9 siguiendo el paso 3.1.1.
    2. Pesar 150 mg 4-aminoantipireno y disolver en 100 ml de tampón de acetato de amonio preparada (pH 9).
    3. Sonicar durante 1 min.
    4. Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
    5. Purgar la primera bomba de reactivo con el reactivo 4-aminoantipireno preparados de acuerdo con los requisitos del fabricante.
  5. Preparación de reactivo de ferricianuro de potasio
    1. Pesar 150 mg de ferricianuro de potasio y disolver en 100 ml de tampón de acetato de amonio (pH 9) preparado como en la etapa 3.1.1.
    2. Sonicar durante 1 min.
    3. Cubrir con papel de para evitar la exposición a la luz.
    4. Purge la segunda bomba de reactivo con el reactivo de ferricianuro de potasio preparada de acuerdo con los requisitos del fabricante.
  6. Sintonización de la columna de RF
    1. Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico.
    2. Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min.
    3. Volver a pesar el recipiente central y calcular el peso de la corriente desde el puerto central de la siguiente manera en el paso 1.4.3.
    4. Repetir los pasos 3.6.2 a 3.6.3 para el efluente que sale de la UV-Vis que está unido al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso para periférica de la siguiente manera en el paso 1.4.4.
    5. Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera en el paso 1.4.5.
    6. Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el flujo periférico es 50:50 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 50%, disminuir elcantidad de flujo que sale por la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm para el puerto central de salida. Si el flujo central está por debajo de 50%, disminuir la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central.
    7. Repita el paso 3.6.1 a la 3.6.6 hasta que una relación de segmentación de 50:50 (central: periférica) se logra.
    8. Ajuste el caudal de la bomba 4-aminoantipireno a 0,5 ml min-1.
    9. Ajuste el caudal de la bomba de ferricianuro de potasio y 0,25 ml min-1.
      Nota: La columna de RF establecido con los reactivos de dos componentes está ahora listo para su análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras.
  7. Pon ejecutar condiciones de parada
    1. Una vez que todas las muestras se han inyectado la carrera ha terminado, lo que indica que la carrera ha terminado, deje de ambas bombas de reactivos.
    2. Retire las líneas de la bomba de reactivo de los puertos periféricos y reemplazarlos con una pieza de 15 cm de tubo de 0,13 mm.
    3. Equilibrar la columna con la fase móvil en which que se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min.
    4. Detener el flujo de la bomba de la fase móvil en el instrumento de HPLC.
    5. Reemplazan tanto los reactivos en el reactivo de bombas con metanol y se purgan las bombas adicionales según el requisito del fabricante.
      Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado.

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Representative Results

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El primer método PCD que fue adaptado para su uso por RF-PCD fue la derivación de antioxidantes utilizando el radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Esta reacción se introdujo por Koleva et al. 25 y se ha utilizado ampliamente desde entonces. La detección se basa en la decoloración del DPPH radical en presencia de especies reactivas del oxígeno, por lo tanto, la presencia de los resultados de los antioxidantes en una caída en la absorbancia observado. El DPPH reacción a menudo emplea bucles de reacción grandes de 500 l o más 13-15, sin embargo se encontró que cuando se utiliza la columna de la RF-PCD se requiere ningún bucle de reacción. La figura 5 muestra dos cromatogramas de una muestra de café Ristretto derivatizados usando el DPPH radical utilizando tanto PCD convencional y instrumentación RF-PCD.

El segundo método de PCD que ha sido adaptado para su uso por RF-PCD es la derivatization de cuatro aminoácidos (glicina, leucina, fenilalanina y triptófano) usando fluorescamina como reactivo de derivatización 23. El método fue adaptado de la obra por Udenfriend et al. 11 con la composición de la fase móvil, la concentración y la velocidad de flujo fluorescamina fluorescamina optimizado para su uso con columnas de RF. El método convencional utiliza un sistema de derivación de dos reactivos que se añadió pH 9,0 tampón para la corriente de efluente antes de la adición del reactivo de fluorescamina, mientras que el método de RF-PCD utilizado una fase móvil que ya estaba tamponado, por tanto, sólo un único sistema de derivatización reactivo era necesario. Para esta aplicación la corriente derivatizada se analizó a 390 nm utilizando un detector de UV-Visible, que corresponde a la longitud de onda de excitación utilizada para la detección por fluorescencia. La corriente derivatizado se pudo detectar usando un detector de fluorescencia, dando mayor relación señal a ruido y por lo tanto más bajos límites de detección y quantsanea-, según el trabajo de Udenfriend et al. 11. Además, el eluyente que viene desde el puerto central de la configuración de RF-PCD se controló usando un segundo detector de UV-Visible.

El rendimiento del método de RF-PCD para la derivatización de aminoácidos se comparó con la Tabla convencional PCD método. 1 enumera los límites calculados de cuantificación y detección para cada uno de los aminoácidos analizados en los modos de PCD convencionales RF-PCD y. Se definió el límite de detección a ser la concentración en el que se obtiene una relación de señal a ruido de 2 mientras se definió del límite de cuantificación para ser la concentración en la que se consigue una relación de señal a ruido de 10. La figura 6 muestra un cromatograma de los cuatro aminoácidos analizados mediante el método de PCD convencional, el método de RF-PCD y la corriente no derivatizado del método RF-PCD. la figura 7 es una comparación de las señales obtenidas para el guisanteks debido a la glicina y leucina utilizando tanto el método de PCD convencional y el método de RF-PCD. La figura 8 compara la anchura de pico del pico de triptófano en el análisis utilizando el método de PCD convencional, el método de RF-PCD y la corriente no derivatizado de la RF- método PCD.

El método PCD final que ha sido adaptado para su uso por RF-PCD 26 es la derivatización de cuatro fenoles (fenol, 4-metoxifenol, p-cresol y tocoferol). El método fue adaptado de trabajo por Bigley y Grob 27 con pequeños cambios para optimizar el método para su uso con columnas de RF. Este trabajo utiliza una reacción de derivatización de dos componentes que se añadieron soluciones de ambos 4-amionantiprine y potasio ferricianuro para el eluyente de la columna en la conexión final de la columna de la RF. Se encontró que cuando se utiliza una columna de RF para la reacción no hay bucles de reacción post-columna adicionales necesarias para ser utilizados. La figura 9 muestra un ejemplo de un cromatograma dondeuna muestra de ensayo 21-componente que contenía algunos componentes que muestran una respuesta al régimen de derivatización y algunos que no lo hacen, se separaron, se derivatiza y detectado (trazo negro). La misma mezcla también se separó y se detecta sin derivar para la comparación (línea roja). En la Figura 9 la respuesta RF-PCD se ha mostrado como una respuesta negativa para la distinción visual más fácil (la respuesta del detector obtenida fue positivo). La Figura 10 muestra una comparación de la forma del pico de p-cresol tanto derivatizado utilizando la columna de la RF-PCD y sin derivar.

Figura 1
Figura 1. Cromatografía de superposición de hexilbenceno inyectado en un sistema de HPLC con varios volúmenes añadidos entre la columna y el detector muertos. Por favor clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Cromatografía de superposición de tolueno, etilbenceno y propilbenceno se inyecta en un sistema HPLC con varios volúmenes añadidos entre la columna y el detector muertos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Ilustración del diseño de columna de flujo de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Instrumental puesta en marcha de RF-PCD. (A) de reactivo único (es decir, DPPH o reactivos de derivatización fluorescamina) y (B) de doble reactivo (es decir, 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio reactivos de derivatización). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Los cromatogramas de la separación de café Ristretto con detección después de derivatización post-columna usando el radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •). La derivatización se llevó a cabo usando una columna convencional con un serpentín de reacción l 500 (A) y una columna de flujo de reacción (B rong>). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. superposición cromatográfica de cuatro aminoácidos (glicina (G), leucina (L), fenilalanina (P) y triptófano (T)) en el rango de 10 a 1000 ppm detectado por derivatización post-columna usando fluorescamina como reactivo PCD después de la separación por HPLC. Los cromatogramas son los siguientes: (A) PCD convencional, (B) RF-PCD, y el puerto central (no modificado) de RF-PCD (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7. Comparación de las señales obtenidas para la glicina (primer pico) y leucina (segundo pico) de PCD convencional (línea roja) y RF-PCD (trazo negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. Pico comparación anchura del pico debido al triptófano basado en (A) tiempo de retención y (B) el volumen de pico. El trazo negro muestra el método PCD convencional, el rastro rojo muestra el método de RF-PCD y la traza verde muestra el sin derivar la corriente desde el puerto central del método de RF-PCD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tienda "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 9
Figura 9. La separación cromatográfica de una muestra artificial. Los componentes incluyen fenol (P), 4-metoxifenol (M), p-cresol (C) y tocoferol (T), así como numerosos alquilbencenos, hidrocarburos polinucleares aromáticos, anisol, phentanole, cafeína, fenilalanina y benzamida. Los picos marcados i, ii y iii son alquilbencenos que inesperadamente respondieron al esquema de la derivación. El trazo negro representa la respuesta no modificado usando un detector UV a 254 nm, mientras que la línea roja representa la respuesta derivada a 500 nm. Nota para la claridad visual derivado de la respuesta ha sido invertida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10 Figura 10. Respuesta cromatográfico de p-cresol. El trazo negro representa la respuesta no modificado usando un detector UV a 254 nm, mientras que la línea roja representa la respuesta derivada (RF-PCD) a 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tipo de Reacción glicina leucina fenilalanina triptófano
LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm)
RF-PCD 6 25 10 100 25 250 50 250
Puerto central RF-PCD (no derivatizado) No detectado No detectado No detectado 1 10
PCD convencionales 10 100 50 500 50 500 100 500

Tabla 1. Los límites de detección y cuantificación de cuatro diferentes aminoácidos detectados por los diferentes sistemas de post-columna de derivatización utilizando fluorescamina como reactivo de derivatización después de la separación por HPLC.

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Discussion

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RF-PCD permite la mezcla eficiente del reactivo de derivatización con el efluente después de la columna de HPLC sin el uso de bobinas de reacción, reduciendo al mínimo los efectos de ensanchamiento de las bandas y la mejora de rendimiento de la separación. métodos RF-PCD también han demostrado mejoras en la respuesta de la señal con respecto al método de detección. Camenzuli et al. 28 fue el primero en reportar el uso de columnas de flujo de reacción con DPPH para la detección de ROS en una muestra de café espresso. El estudio incluyó el análisis y la optimización de las condiciones de FR para alcanzar el máximo rendimiento, poniendo a prueba una serie de DPPH concentraciones con diversas DPPH tasas de flujo de reactivo. Se concluyó que una concentración de DPPH de 0,1 mg ml -1 con un DPPH velocidad de flujo de reactivo de 0,5 ml min -1 era óptima para un rendimiento mejorado de separación (es decir, la eficiencia y sensibilidad) bajo RF-PCDcondiciones en comparación con el método convencional de PCD DPPH derivatización. figura 5 muestra dos cromatogramas que utilizan el DPPH ensayo de antioxidantes en una muestra de café espresso. Especialmente interesantes son los picos de alta intensidad con tiempos de retención de aproximadamente 5 min. Se puede observar que cuando se utiliza un bucle de reacción de 500 l, que es típico de DPPH métodos tradicionales de derivatización, un solo pico, ancho se puede observar. Sin embargo, cuando se utiliza el método de RF-PCD sin la necesidad de un bucle de reacción, se hace evidente que el único pico observado usando un bucle de 500 l es en realidad dos picos. Por otra parte, el detalle adicional puede ser visto después de 5,5 minutos cuando se utiliza la configuración RF-PCD. Por lo tanto, para el análisis de ROS en las muestras usando DPPH •, la técnica de RF-PCD demostrado ser superior a los métodos convencionales de análisis de ROS utilizando DPPH •.

RF-PCD conreactivo fluorescamina se ha utilizado para el análisis de los aminoácidos primarios y en comparación con las formas convencionales de PCD con fluorescamina 20. Desde la columna de la RF de herraje final también proporcionó una plataforma para la detección de multiplexado, el flujo central no derivatizado se controló a través de UV-Vis, mientras que la derivatización entre los efluentes y fluorescamina se llevó a cabo en la región exterior del herraje final RF y detecta a través de los rayos UV vis. Una serie de estándares de ensayo que contienen cuatro aminoácidos se analizaron en condiciones de RF-PCD multiplexados. La Figura 6 compara el perfil cromatográfico por el método convencional de PCD (Figura 6A) y RF-PCD (detección de derivatizado (Figura 6B) y no derivatizado (Figura 6C)) de la serie de aminoácidos. la figura 7 es una superposición de dos señales de aminoácidos obtenidos a través de PCD convencional y RF-PCD. Se puede observar que la separación observada más eficiente debido a tque la eliminación del bucle de reacción se ha llevado a una mayor respuesta de la señal, a pesar del hecho de que no todo el efluente de la columna se derivatizó. Además, el esquema más eficiente de mezcla de reactivo de derivatización resultó en ruido de línea de base inferior, aumentando aún más la relación señal a ruido. Este efecto se confirma en los límites inferiores de detección y cuantificación calculado para el método de RF-PCD en comparación con el método de PCD convencional en la Tabla 1. Esta tendencia también se puede ver en la Figura 5 donde la respuesta antioxidante para DPPH es mayor para el método RF-PCD en comparación con el método convencional PCD. deterioro pico significativo puede observarse en los cromatogramas donde se utilizó una configuración de PCD convencional que conduce a la respuesta de la señal más baja de este método.

La Figura 8 compara el perfil de picos de triptófano cuando se analizaron por RF-PCD (ambas corrientes en derivados y no derivados) y PCD convencionales. Cuando el perfil de pico se traza contra el tiempo las anchuras de los picos todos parecen ser muy similares (Figura 8A). Las mejoras que se encuentran en RF-PCD en comparación con la CPD convencional son evidentes cuando el perfil del pico se representa en función del volumen de pico (Figura 8B). Cuando se trazan en función del volumen pico, es evidente que mientras que el pico RF-PCD muestra una pequeña cantidad de degradación en comparación con el pico no derivatizado, la degradación, sin embargo, es mínima en comparación con la observada a partir del método PCD convencional. Las mejoras en la eficiencia de la separación de RF-PCD en comparación con la CPD convencional también se ponen de manifiesto en la Figura 7, que compara las formas de los picos de glicina y leucina después de derivación por tanto PCD convencionales y RF-PCD. Se puede observar que en el modo de PCD convencional los picos de glicina y leucina son apenas la línea de base separada, mientras que en el modo RF-PCD la señal está en la línea de base durante un período mucho más largo entre los dos picos.

Unbeneficio adicional de RF-PCD comparación con los métodos convencionales de PCD es la capacidad de controlar los efluentes no derivatizado desde el puerto central de la columna de la RF que permite la detección multiplexada. Esto es posible ya que el diseño de la frita dentro del accesorio terminal RF no permite el flujo en la región central radial para mezclar con el flujo en la región periférica de la final apropiado, lo que permite el monitoreo de la corriente derivada de la región externa de la instalación, así como el monitoreo de la corriente no derivado del puerto central. Esta capacidad se pone de relieve por los resultados obtenidos para el triptófano en la Tabla 1, que se sabe que tienen una pobre respuesta de la señal después de la derivatización por fluorescamina 20, sin embargo, a diferencia de los otros aminoácidos que muestra una respuesta a un detector de UV cuando no derivatizado (a 280 nm) . Para ambos sistemas de derivatización de los límites de detección y cuantificación eran relativamente alto, sin embargo de los límites de detección y cuantificación fueron mucho más bajos para tque no derivado corriente. El uso de la capacidad de supervisar tanto las corrientes efluentes derivatizadas y no derivadas de los parámetros de detección pueden ser optimizados para proporcionar el mayor nivel de rendimiento para cada aminoácido.

El diseño Multi del herraje final de RF permite el análisis de doble reactivo de derivatización. Selim et al. 23 investigó el rendimiento de dos reactivos (4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio) utilizando condiciones RF-PCD para el análisis de compuestos fenólicos en comparación con la técnica convencional de PCD utilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio. Este tipo de técnica PCD requiere dos bombas y los bucles de reacción para cada reactivo de derivatización en oposición a un bucle de la bomba y de reacción para DPPH •. Diversos compuestos fenólicos y de alquilbenceno se analizaron en condiciones convencionales y RF PCD. Curiosamente, los compuestos no fenólicos que no fueron detectados por el método convencional eran de hecho detecta ONUder condiciones RF-PCD. Figura 9 muestra la respuesta cromatográfica UV-Vis y la respuesta colorimétrica RF-PCD a una mezcla de ensayo estándar. RF-PCD proporciona una técnica PCD simplificado en términos de instrumentación, sin compromiso de rendimiento de separación como se observa en la Figura 10. Figura 10 compara el perfil de picos de p-cresol cuando se analizaron por RF-PCD y también sin derivatización. Se puede observar que la anchura del pico del cromatograma RF-PCD es muy similar a la del cromatograma no derivatizado. La principal diferencia entre los dos cromatogramas es que el cromatograma RF-PCD es ligeramente más ancho en la base. Esto demuestra que hay poca o ninguna dispersión pico debido a la técnica de RF-PCD. Se observó una respuesta similar en la Figura 9 que muestra que es no sólo el pico cresol p que tiene anchura de pico similar cuando derivatizado por RF-PCD en comparación con su pico no derivatizado, pero todos los fenoles y alkylbenzenes que respondieron al esquema de derivación mostraron la misma tendencia. Aunque, RF-PCD con el uso de dos reactivos de derivatización obtuvo un rendimiento de separación similar al método no derivatización convencional, el RF-PCD permitido para la detección selectiva de compuestos fenólicos, uno de los cuales que no se detectó en condiciones no derivatizados .

Como RF-PCD es un desarrollo de métodos de HPLC-PCD convencionales, todas las herramientas de ajuste disponibles en métodos de HPLC generales, tales como composición de la fase móvil y la velocidad de flujo, volumen de inyección y longitud de onda de análisis son aplicables a los métodos de RF-PCD. Además, herramientas de ajuste disponibles en métodos de HPLC-PCD convencionales, tales como la fase móvil a la proporción de velocidad de flujo de reactivo de PCD, así como la composición del reactivo PCD son aplicables a los métodos de RF-PCD. Una herramienta de ajuste adicional disponible cuando se utiliza RF-PCD que no está disponible en los métodos convencionales de PCD es la relación de los flujos procedentes de la central y periféricopuertos de la columna. Los flujos están controlados por la alteración de la presión de retorno relativa en cada una de las líneas mediante el control de la longitud y / o diámetro interno del detector post (o poste columna si no se detecta el flujo que viene desde el puerto central) tubo. La relación óptima de la central para los flujos de periféricos es dependiente de la reacción en cuestión, así como otros factores, tales como, si se detecta o no el puerto central. Una relación de flujo de 60% periférica y 40% central es a menudo un buen punto de partida.

Al igual que con los parámetros de ajuste, muchos de los problemas que pueden surgir con el uso de la columna de la RF-PCD también son comunes con los métodos convencionales de PCD. Un parámetro particular que el cromatógrafo tiene que ser consciente de la hora de realizar los análisis de RF-PCD es la estabilidad del flujo y la presión en el sistema, en particular el de la bomba (s) de reactivo. Si el flujo en el sistema no es estable, se puede causar por lo tanto la inestabilidad de línea de base la disminución de lala relación señal-ruido y, posteriormente, unos límites de cuantificación y detección.

cromatografía de RF-PCD se ha desarrollado para superar las dificultades en la adaptación de las reacciones de PCD a columnas de HPLC modernas y sistemas. La principal ventaja de RF-PCD comparación con los métodos convencionales de PCD es una mezcla más eficiente debido a que tienen lugar dentro de una frita en el accesorio en el extremo de la columna de RF, y esta mezcla está en un poco mayor contrapresión. Esto permite la minimización o incluso la eliminación de los bucles de reacción volumen grandes que se utilizan en muchos métodos de PCD convencionales. Con esta reducción al mínimo de la columna posterior volumen muerto, separaciones más eficientes con mayor resolución cromatográfica se pueden realizar.

modo RF-PCD ha dado lugar a mejoras en la eficiencia de la separación, la forma del pico y de señal a ruido en comparación con los métodos convencionales de PCD. Sin embargo, es importante observar que las mejoras de señal dependen detector. Por ejemplo, los detectoresque cantidad de muestra dependiente no puede presentar un aumento de la respuesta de la señal en condiciones RF-PCD en comparación con los métodos convencionales. Esto es así porque en virtud de los métodos convencionales se detecta 100% de la columna de la muestra, donde en condiciones RF-PCD sólo un cierto porcentaje de la muestra en la columna se detecta en función de la relación de segmentación. Se sin embargo, prevé que las reacciones de RF-PCD serán capaces de adaptarse a cualquier uno o dos reactivos (siempre que ambos reactivos se añaden al mismo tiempo) reacción PCD con un mínimo de re-optimización y que los beneficios observados para los tres reacciones hasta ahora probados se traducirá a todas las demás reacciones de PCD.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

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Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta
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Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

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