Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kolon sonrası türevlendirme (PCD) ile birleştirilen yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analiz laboratuarda bir dizi konu çözümünde yararlı olan güçlü bir araçtır. Bu, 1,2 uygun dedektörler paketi ile başka bir tespit edilemeyen bileşikler tespit seçici saptanması ve nicelenmesi 3-5 alt sınırları sağlar veya hedef analitin sinyal geliştirmek için kullanılabilir önlemek için bir hedef analitin türetmek matriks etkileri 6. Yaygın olarak kullanılan PCD reaksiyonları 9,10 veya floreskamin 11,12, 2,2-difenil-ile reaktif oksijen türlerinin türetme (ROS) ninhidrin orto-phthaladehyde 7-9 olan amino asitler gibi aminlerin reaksiyonu içerir 1-picrylhydrazil kökü (DPPH) 13,14 veya 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) 15,16 ve sülfür c türetmek için iyodid-azit belirteci kullanılmasıiçeren gruptur bileşikler 17,18.

HPLC sistemleri 6 PCD reaksiyonlarının kullanılması ile pek çok dezavantajları, ancak vardır. Prensip olarak, bu arasında karıştırılması ve reaksiyon, 8 oluşması için zaman tanımak türetme reajan (lar) ve dedektör, ilave alanına arasındaki reaksiyon, rulo kullanılmasıdır. Bu reaksiyon genellikle HPLC sistemi 19 geri kalan hacmi ile karşılaştırıldığında önemli 500 ul ya da daha fazla, hacimleri var döngüler. Bu yüksek hacim, reaksiyon bölgesinin kullanımı Reaksiyon bağın varlığı olmaksızın gözlenebilir etkilere kıyasla artırılmış tepe genişletilmesi sonuçları döngüler. Bu kantitatif ve algılama yüksek sınırları var kısa, daha geniş zirveleri ile sonuçlanır ve olumsuz kromatografik çözünürlüğü etkiler. 1 Rakamlar ve 2 farklı sonrası kolon reaksiyon döngü hacimlerinin yanı sıra kaynaklanan pik şeklinin bozulmasını vurgulayın. Bu analiz,bir cep 94% metanol faz bileşimi ve% 6 Milli-Q su ile yapıldı. Hareketli fazın akış oranı 1 ml / dak, enjeksiyon hacmi 20 ul ve analiz dalga boyu 265 nm idi. 20 ul 1.000 ul ölü hacimleri değişen Rulo sütun ve PCD yöntemleri reaksiyon döngü ölü hacim etkilerini simüle etmek için dedektör arasına yerleştirildi. Bu ilmekler, 0.5 mm iç çapa sahip, paslanmaz çelik boru hazırlandı. Deney, denetleyici (SCL-10AVP) 'den oluşan bir HPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir, bir düşük basınç Gradyan Vana (FCL-10ALVP), bir pompa (LC-20AD), bir enjektör (SIL-10ADVP) ve PDA dedektör ( SPD-M10ADVP). Mobil faz önce HPLC sistemine sokulmadan bir faz giderme yoluyla pompalanmıştır. Ayırma 250 mm x 4.6 mm İD 5 um kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Deney koşulları en son literatürde yayınlanmıştır PCD reaksiyonlar tipik olarak seçilmiştir.

En basit, en yaygın sonrası kolon reaktör kurulum etkili bir sıvı akabilir ve reaksiyon gerçekleşebilir hangi aracılığıyla uzun, ince bir tüp olmayan bir parçalı boru şeklinde reaktör denir. Bu sistem, zirve genişleme sadece sisteme eklenen ölü hacim değil, aynı zamanda lijima ve arkadaşları. 8 tarafından belirtildiği gibi borunun iç çapına bağlıdır. Ayrıca, bobin geometrisi gözlenen marka genişlemesi bir rol oynar. Reaktörün sarma ölü hacim minimize edilebilir, yani daha iyi bir karıştırma sonucu, ikincil akış profilleri değiştirir Stewart 20 belirtti. 21 bobin örme açık boru şeklinde kullanırken pik genişlemesi önemli olmadığı ifade edilmiştir. Pik genişletilmesi aşırı büyük olduğunda, başka reaktör tipleri de 20,22 düşünülebilir. Bunlar yatak reaktörleri veya parçalı akış reaktörleri içerebilir. Bu reaktörler, ki bunlar aksi takdirde requir olur yavaş reaksiyonlar için özellikle yararlı olane'nin büyük tepki döngüler. olmayan parçalı boru şeklinde reaktörler PCD uygulamalarında kullanılan reaktörlerin en yaygın türleri, reaktör kurulum bu tür ile bu makalede fırsatlar geri kalanı gibi.

Reaksiyon akışı (RF) sütunun tasarımı mobil faz dış bulunan radyal merkez kolonun bölge veya üç limanlarında bulunan tek bir bağlantı noktası aracılığıyla ya sütunu çıkmak (veya girmek) için izin veren bir çok portlu sonu uydurma içermektedir sütunun duvar kısmı (bakınız Şekil 3). Bu iki akım deliklerden dışarı uzanan bir dış gözenekli cam malzeme ile çevrili da bir su geçirmez halka tarafından çevrelenen bir merkezi gözenekli cam malzeme ihtiva eden bir uç teçhizatı kullanılarak ayrılır. Santral geçirmeyen bir halka çapraz akışına iki gözenekli bölgeler arasında mümkün değildir.

Reaksiyon akış kromatografisi sırasında, türetme reaktif (ler) bir veya TW olarak mobil faz akış yönüne karşı pompalanırReaksiyon akış sütunun dış limanlarından o. Elüsyon maddesi serbest bir dış port üzerinden dış frit türetme reajan (lar) ile karıştırılmış ve dedektör geçirilir. Reaksiyon akımı ya tek reaktif türetme için kullanılabilir ya da ikili bir madde sistemi (türevlendirme reaktifleri 2 portu ve 1 bağlantı noktası (türetme reaktifin 1 bağlantı noktasına 1 bağlantı dedektörü ve 1 bağlantı bloke kolon eluent geçmek için) ) dedektöre sütun eluent geçmektedir. Merkezi akıştan akış ya da türetilmemiş Elüsyon maddesi etkin çoklayıcı algılama 23 ya da atık geçer tespit etmek için kullanılabilir.

RF-PCD kromatografisi çalışan santral ve periferik akımlarının oranı olduğunda kullanılabilir bir büyük ayar tekniği. Her bir türetme için en uygun oranı, merkezi akış tespit edilmesi veya atık geçilecek olmadığı gibi bir dizi faktöre bağlıdır. Bu nedenle, optimum oranı tespit edildikten sonra, Doğru akım oranı her çalışma gerçekleştirildiğini önce elde edilir sağlanmalıdır.

Bir cam hamuru kullanımı Elüsyon maddesi akışı ve tipik olarak sıfır ölü hacim T parçasını ya da düşük bir ölü hacmi kullanılması, geleneksel karıştırma teknikleri ile karşılaştırıldığında, daha etkili karıştırma RF-PCD sonuçlarında türetme reaktif karışımı olduğu bulunmuştur W- parça iki akışları karıştırmak için. Bu nispeten küçük Reaksiyon döngüleri kullanımı için izin verilen ya da tamamen reaksiyon, döngünün bile ortadan kaldırılması yer alır. Geleneksel sonrası sütun türevlendirme yöntemlerine göre daha keskin zirveleri reaksiyon döngü boyutu sonuçlarının azaltılması. Bu, tüm sütun elüsyon türetilmiş olmasına rağmen, gürültü oranı daha büyük bir sinyal gözlenir ve saptanması ve nicelenmesi dolayısıyla alt sınırları elde edilebilir olduğu anlamına gelir.

Reaksiyon akış kromatografisi PCD reaksiyon adaptasyonu ile zorlukların üstesinden gelmek için geliştirilmiştirnedeniyle büyük hacimli reaksiyon döngüler istihdam ihtiyacı nedeniyle büyük yazılan sütun ölü hacimleri modern HPLC kolon ve sistemleri, genişletilmesi bant kaynaklanan verimlilik özellikle kaybına s. Geleneksel PCD göre RF-PCD daha verimli karıştırma işlemleri daha az, reaksiyon döngüsü hacimleri gözlenen ayırma veriminde bir artışa yol kullanılabilir anlamına gelir. Ayrıca, RF-PCD kromatografisi her iki sinyal artan geleneksel PCD yöntemlerine göre saptanması ve nicelenmesi alt sınırları ile sonuçlanan klasik PCD tekniklere kıyasla gürültü azalması gösterir. Geleneksel PCD yöntemlerine göre RF PCD ilave bir avantajı, RF sütun merkez noktası olarak kolonun çevre bölgesinde elute olur türevlendirilmiş akımından ayrılır be türetilmemiş akışı izleme yeteneği. RF-PSD geleneksel PCD yöntemlerine göre birçok avantaj görüntüler nispeten yeni ama gelecek vaat eden bir tekniktir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrollerinin uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı parmak ayakkabı) kullanımını sağlamak.

Not: Bu protokol, ilgi konusu bir kimyasal bileşiğin doğası özgü, farklı bir reaktif ile reaksiyonu akış kolon sonrası türevlendirme 3 yöntem (RF-PCD) teknikleri açıklanmaktadır. ROS analizi için "floreskamin kullanarak birincil aminler 2. Tespiti" bölümüne bakın birincil aminler analizi için, "ROS 1. Tespit DPPH kullanarak" bölümüne gidin ve fenolik bileşiklerin analizi için bölüm "3 gidin . fenollerin algılama4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürünü "seçeneğini kullanarak. boyunca ultra saf su (örneğin, Milli-Q su) kullanınız.

Not: RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz.

1. ROS Algılama DPPH Kullanımı

  1. HPLC aletinin kurmak
    1. A hattı% 100 su ve mobil faz olarak, B hattı üzerindeki% 100 metanol ile HPLC aleti hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompaları temizleyin.
    2. HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın.
    3. 520 nm'lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın.
  2. Kadar ayarlayınRF sütunu
    1. HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın.
    2. RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın.
    3. 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü bir çıkış çevre portunu.
    4. RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına DPPH Pompa hattı bağlayın.
    5. Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin.
    6. 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı B -% 100 metanol.
    7. Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 metanol hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklenebilir olmalıdır.
  3. DPPH ayıracın hazırlanması
    1. Metanol DPPH bir 0.1 mg / ml çözelti hazırlayın. 10 dakika boyunca DPPH reaktifı ihtiva eden şişenin sonikasyon.
    2. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo balon örtün.
    3. Üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanan DPPH reaktif ile DPPH Pompayı temizleyin.
  4. RF kolon çıkışı Tuning
    1. Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin.
    2. 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak.
    3. merkez liman gemi yeniden tartmak ve aşağıdaki gibi merkezi bağlantı noktasından akışının ağırlığı hesaplamak:
      Merkez Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Merkez Port (g) Ağırlık Orta Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık =
    4. Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve periferik liman gemisi olarak ağırlığını hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 1.4.2 ve 1.4.3 adımlarıaşağıdaki gibidir:
      Periferik Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Çevresel Port (g) Ağırlık Periferik Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık =
    5. aşağıdaki şekilde, merkezi ve periferik bağlantı noktaları gelen akış yüzdesini hesaplayın:
      % Merkezi Port Central Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100
      % Periferik Liman Periferik Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100
    6. merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 30:70 (: periferik santral) 'dir. orta akış% 30 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. merkezi akış% 30 altında ise merkez limanından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır.
    7. (: Periferik santral) elde edilir 30:70 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 1.4.1 1.4.6 için.
    8. D akış hızını ayarlama0.5 ml dk -1 PPK reaktif pompası.
      Not: DPPH reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir.
  5. Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları
    1. Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme reaktif pompa akışını durdurun.
    2. Periferik bağlantı noktasından DPPH reaktif pompa satırını kaldırın ve bağlantı noktası tıpalayın.
    3. Mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika için izin depolanacak olan mobil faz ile sütun dengelenmesi.
    4. HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun.
    5. Metanol ile DPPH reaktifi değiştirin ve ilave pompa temizlemek.
      Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir.

Fluoresc kullanılarak primer aminlerin 2. Tespitamin

  1. Mobil faz hazırlanması
    1. hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0'a çözeltinin pH'ının ayarlanmasını, 10 mM amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın.
    2. 95:05 (: ACN tamponu) bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon asetonitril (ACN) ve 52.6 ml ilave edilir.
  2. HPLC aletinin kurmak
    1. mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompayı temizleyin.
    2. HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın.
    3. türetme pompasına bir darbe dampener bobin takın.
    4. Ayar floresans dedektörü (FLD) 475 nm 390 nm ve emisyon dalga bir eksitasyon dalga boyu ile.
  3. RF sütunun kurmak
    1. th bağlayınHPLC aleti RF sütunun e girişi.
    2. RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın.
    3. 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak FLD detektöre RF sütunu bir çıkış çevre portunu.
    4. RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına türetme pompa hattı bağlayın.
    5. Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin.
    6. 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 ACN ile önceden karıştırılmış, 10 mM amonyum asetat tampon pH 9.
    7. Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir.
  4. Floreskamin ayıracın hazırlanması
    1. Bir 0.1 mg mi -1 floreskamin reaktif 100 ml olun.
    2. <1 dakika boyunca li> sonikasyon.
    3. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün.
    4. üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış floreskamin reaktif ile reaktif pompasını temizleyin.
  5. RF kolon çıkışı Tuning
    1. Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin.
    2. 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak.
    3. Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak.
    4. Tekrarlayın RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu FLD çıkan atığın için 2.5.3 için 2.5.2 adımları.
    5. Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın.
    6. merkezi akış ve periferik arasındaki segmentasyon oranını sağlamakAkış 43:57 (: periferik santral) 'dir. orta akış% 43 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. orta akış% 43 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır.
    7. (: Periferik santral) elde edilir 43:57 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 2.5.1 2.5.6 için.
    8. 0.7 mi dakika mobil faz pompa akış hızını ayarlama -1.
    9. 0.1 ml dk akış türetme pompa ayarlama -1.
      Not: floreskamin reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir.
  6. Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları
    1. Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme pompayı durdurun.
    2. Periferik liman ve stoper gelen türetme pompa hattını sökün.
    3. mobil fazda ile kolon dengeyebu da mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa.
    4. mobil faz pompanın akışını durdurun.
    5. asetonitril ile floreskamin reaktifi değiştirin ve türetme pompasını temizlemek.
      Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir.

4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanür kullanılması Fenollerin 3. Algılama

  1. Mobil faz hazırlanması
    1. hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0'a çözeltinin pH'ının ayarlanmasını, 100 mM bir amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın.
    2. (: Metanol tamponu) 5: 95 bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon metanol 52.6 ml ekleyin.
  2. HPLC aletinin kurmak
    1. mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üretici başına kadar pompayı Temizle '; S gereksinimleri.
    2. HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4B'de gösterildiği gibi iki ilave belirteci pompaları ayarlayın.
    3. reaktif pompalarının her birine bir darbe dampener bobin takın.
    4. 500 nm'lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın.
  3. RF sütunun kurmak
    1. HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın.
    2. RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın.
    3. 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü RF sütunu bir çıkış çevre portunu.
    4. Her reaktifi (yani, 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürle) RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına pompa hattı bağlayın.
    5. 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 metanol ile önceden 100 mM amonyum asetat tampon pH 9.
    6. w sütunu dengeyeBir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı mobil faz i. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir.
  4. 4-aminoantipiren ayıracın hazırlanması
    1. adım 3.1.1 izleyerek 9 bir pH değerine sahip bir amonyum asetat tamponu hazırlayın.
    2. 150 mg kadar 4-aminoantipiren tartılır ve hazırlanan amonyum asetat tamponu (pH 9), 100 ml içinde çözülür.
    3. 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
    4. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün.
    5. üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış 4-aminoantipiren reaktif ile ilk reaktif pompasını temizleyin.
  5. Potasyum ferrisiyanür ayıracın hazırlanması
    1. potasyum ferrisiyanür 150 mg ağırlığında ve adım 3.1.1 göre hazırlanan amonyum asetat tamponu, 100 ml (pH 9) içinde çözülür.
    2. 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
    3. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo örtün.
    4. Purgüreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış potasyum ferrisiyanür reaktif ile e ikinci reaktif pompası.
  6. RF sütunun Tuning
    1. Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin.
    2. 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak.
    3. Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak.
    4. Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 3.6.3 için 3.6.2 adımları.
    5. Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın.
    6. merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 50:50 (: periferik santral) 'dir. orta akış% 50 üzerinde ise, azaltmakçıkış, merkezi noktasına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarı. orta akış% 50 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır.
    7. (: Periferik santral) elde edilir 50:50 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 3.6.1 3.6.6 için.
    8. 0.5 mi dakika 4-aminoantipiren pompa akış hızını ayarlama -1.
    9. 0.25 mi dk potasyum ferrisiyanür pompa akış hızını ayarlama -1.
      Not: İki bileşenli reaktif kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir.
  7. Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları
    1. Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten bittikten çalışma enjekte edildikten sonra, reaktif pompaları hem dur.
    2. Periferik limanlarından reaktif pompa satırları kaldırın ve 0,13 mm boru 15 cm parça ile değiştirin.
    3. WHI mobil faz ile sütun dengeyeCH mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa.
    4. HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun.
    5. Değiştir hem ayıraç reaktifler metanol ile pompa ve üretici şartının gibi ek pompaları temizlemek.
      Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RF-PSD tarafından kullanılmak üzere uyarlanmıştır ilk PCD yöntemi 2,2-difenil-1-picrylhydrazil kökü (DPPH) 24 ile antioksidanların türetilmesi olmuştur. Bu reaksiyon. Koleva ve ark 25 tanıtıldı ve yaygın beri kullanılmaktadır. Algılama, reaktif oksijen türlerinin varlığında, radikal DPPH renksizleşme, gözlenen absorbans bir damla antioksidanlar sonuçlar dolayısıyla varlığına dayanır. DPPH Reaksiyon genellikle 500 ul veya 13-15 daha büyük bir reaksiyon döngüleri kullanır, ancak RF-PCD kolonu kullanıldığında hiç bir reaksiyon döngüsü gerekli olduğu bulunmuştur. Şekil 5 ile türetilmiş Ristretto kahve örnek iki kromatogramlar gösterir geleneksel PCD ve RF-PCD enstrümantasyon ikisini de kullanarak DPPH radikali.

RF-PSD kullanımı için adapte edilmiş ikinci bir PSD yöntemi der olantüretme reaktif 23 olarak floreskamin kullanılarak dört amino asit (glisin, lösin, fenilalanin ve triptofanın oluşturduğu gruptan) bir ivatization. Yöntem, RF sütunlar ile kullanım için optimize mobil faz bileşimi, floreskamin konsantrasyonu ve floreskamin akış hızıyla Udenfriend ve ark., 11 tarafından gerçekleştirilen çalışmadan adapte edilmiştir. Geleneksel yöntem, pH 9.0 tampon maddesi önceden tamponlu bir mobil faz kullanılan RF-PCD yöntemi iken, floreskamin maddenin eklenmesinden önce, atık akımına ilave edildi, iki reaktif türetme sistemi, bu şekilde, sadece tek bir reaktif türetme sistemi kullanılmaktadır ihtiyaç vardı. Bu uygulama için türetilmiş akış floresan saptama için kullanılan dalgaboyu için karşılık gelen bir UV-Görünür detektörü kullanılarak 390 nm'de analiz edilmiştir. türetilmiş akım gürültü daha sinyalini veren ve algılama ve kant dolayısıyla alt sınırları, bir floresan dedektör kullanılarak tespit edilebiliryağışa, UdenFriend ve ark., 11 ile iş başına kadar. Ayrıca, RF PCD kurulum merkez noktasına gelen yıkama sıvısı ikinci bir UV-Görünür detektör kullanılarak izlenmiştir.

Amino asitlerin türetme için RF-PCD yönteminin performansı, geleneksel PCD yöntemi. Tablo RF-PCD ve konvansiyonel PCD modlarında analiz amino asitlerin her biri için kantitatif ve algılama 1'de hesaplanan sınırları karşılaştırılmıştır. Saptama sınırı nicelendirme limiti, 10 gürültü oranına bir sinyal elde edilmiştir konsantrasyon olarak tanımlandı ise 2 gürültü oranına bir sinyal elde edildi konsantrasyon olarak tanımlandı. Şekil 6 dört bir kromatogramı göstermektedir amino asitler, geleneksel PCD yöntemi, RF PCD yöntem ve RF-PCD yönteminden türetilmemiş akışı kullanılarak analiz edildi. 7 bezelye için elde edilen sinyal arasında bir karşılaştırma ŞekilGeleneksel PSD yöntemi ve RF-PCD yöntemi her ikisini de kullanarak glisin ve lösin nedeniyle ks. Rf = konvansiyonel PCD yöntemi, RF-PCD yöntemi ve türetilmemiş akışı kullanarak analiz ederken 8 triptofan tepe tepe genişliği karşılaştırır Şekil PCD yöntemi.

RF-PCD 26 tarafından kullanım için adapte edilmiştir Nihai PCD yöntemin dört fenoller (fenil, 4-metoksifenol, s kresol ve tokoferol) derivatize edildiği safhadır. Yöntem, RF sütunlar ile kullanım için bir yöntem optimize etmek için küçük değişikliklerle Bigley ve Grob 27 tarafından gerçekleştirilen çalışmadan adapte edilmiştir. Bu çalışma, iki 4-amionantiprine ve potasyum ferrisiyanür çözeltileri RF kolonunun son montaj de kolon, elüsyon için ilave edildi, iki bileşenli bir türetme reaksiyonu kullanılmıştır. Bu tepkime için bir RF kolonu kullanılarak gerektiğinde ek Kolon sonrası, reaksiyon döngüler kullanılacak olduğu bulunmuştur. Şekil 9, bir kromatogram burada bir örneğini göstermektedirBir türetme şemasına tepki ve ayrıldı, türetilmiş ve (siyah iz) tespit edilmiştir olmayan bazı gösteren bazı bileşenleri ihtiva eden bir 21-bileşenli test örneği. Aynı karışım da ayrılmış ve karşılaştırma (kırmızı iz) için türetilmemiş tespit edildi. Şekil 9, RF-PCD yanıtı Şekil 10. Kolay görsel ayrım (edilen detektör yanıt pozitif) için negatif bir tepki olarak gösterilir p tepe şeklinde bir karşılaştırmasını göstermektedir edilmiş kresol hem RF PCD kolonu kullanılarak türetilmiş ve türetilmemiş.

Şekil 1
Şekil 1. Kromatografik kolon ve dedektör arasına eklenen çeşitli ölü hacimleri ile bir HPLC sistemine enjekte hexylbenzene bir bindirme. Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2. toluen, etilbenzen ve sütun ve detektör arasındaki eklenen çeşitli ölü hacimleri ile bir HPLC sistemine enjekte propilbenzenin kromatografik bindirme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil Reaksiyon Akış kolon tasarımı 3. İllüstrasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg "/>
Şekil 4. Enstrümental RF-PSD kurdu. (A) Tek reaktif (yani, DPPH veya floreskamin türetme reaktif) ve (B) çift reaktif (yani, 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürle türevlendirme reaktifleri). Tıklayınız görüntülemek için Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şekil 5,
Şekil kullanıldığı sonradan sütun türetme sonrasında algılama Ristretto kahve ayrılması 5. kromatogramları 2,2-difenil-1-picrylhydrazil kökü (DPPH) •. Türetme, bir 500 ul reaksiyon borusu ile bir geleneksel kolonu kullanılarak gerçekleştirildi (A) ve bir reaksiyon akış sütunu (B )> Rong. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Dört amino asidinin Şekil 6. Kromatografik katlamalı (glisin (G), lösin (L), fenilalanin (P) ve triptofan (T)), bir PSD reaktifı olarak floreskamin kullanılarak Kolon sonrası derivatizasyon ile tespit 10 ile 1000 ppm aralığında HPLC ile ayırma. (A) geleneksel PCD, (B), RF-PCD, ve (C), RF-PCD merkez (türetilmemiş) bağlantı noktası. Şöyle kromatogramları olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

_upload / 53462 / 53462fig7.jpg "/>
Glisin (ilk zirve) ve konvansiyonel PCD (kırmızı iz) ve RF-PSD (siyah iz) den lösin (ikinci zirve) için elde edilen sinyallerin Şekil 7. karşılaştırılması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Nedeniyle (A) alıkoyma süresi ve (B) pik hacmine dayalı triptofan ile zirve Şekil 8. Tepe genişliği karşılaştırılması. Siyah iz geleneksel PCD yöntemi gösterir, kırmızı iz RF-PCD yöntemi gösterir ve yeşil iz gösterir RF-PCD yöntemin merkezi limanından türetilmemiş akışı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "çadır Şekil 9,
Yapay numune Şekil 9. Kromatografik ayırma. Bileşenleri fenol (P), 4-metoksifenol (M), s kresol (C) ve tokoferol (T) ve çok sayıda alkilbenzenler, polinükleer aromatik hidrokarbonlar, anisol, phentanole, kafein, fenilalanin ve benzamid. doruklarına ii, i etiketli ve iii beklenmedik türetme şeması yanıt alkilbenzenler vardır. siyah iz kırmızı iz 500 nm'de türetilmiş tepkiyi temsil ederken 254 nm UV dedektörü kullanılarak türetilmemiş yanıttır. Türetilmiş tepki ters olmuştur Görsel netlik için unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 10, Kırmızı iz 500 nm'de türetilmiş (RF-PCD) yanıtı temsil ederken Şekil 10. p kresol kromatografik tepkisi. Siyah iz 254 nm'de UV dedektörü kullanılarak türetilmemiş yanıttır. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.

reaksiyon tipi glisin lösin fenilalanin triptofan
LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm)
RF-PCD 6 25 10 100 25 250 50 250
RF-PCD merkezi bağlantı noktası (türetilmemiş) Algılanmadı Algılanmadı Algılanmadı 1 10
geleneksel PSD 10 100 50 500 50 500 100 500

Tablo tespiti ve HPLC ile ayrılmasından sonra türetme maddesi olarak floreskamin kullanılarak farklı Kolon sonrası türevlendirme sistemleri ile tespit dört farklı amino asit nicelendirme 1. Limit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RF-PCD bant genişletilmesi etkilerinin en aza indirilmesi ve ayırma performansını artırmak, reaksiyon bobinler kullanılmadan HPLC atık sonrası sütun ile türetme reaktif verimli karıştırma sağlar. RF-PCD yöntemler de tespit yöntemi ile ilgili olarak, sinyal yanıt olarak iyileşme göstermiştir. Camenzuli ve ark., 28 espresso kahve numunesinde ROS tespiti için DPPH reaksiyon akış sütun kullandığını rapor için ilk oldu. Yaptıkları çalışmada çeşitli DPPH reaktif akış oranları ile DPPH konsantrasyonları bir dizi test, maksimum performans elde etmek için analiz ve RF koşullarının optimizasyonu çıkıyor. Bu, 0.1 mg ml -1 0.5 mi dk'lık bir DPPH reaktif akış oranı ile bir DPPH konsantrasyonu -1 RF-PCD altında geliştirilmiş bir ayırma performansı (yani, etkinlik ve duyarlılık) için en uygun olduğu sonucuna varılmıştırkoşulları DPPH türetme geleneksel PCD yöntemine göre. 5 espresso kahve numunesinin antioksidan DPPH deneyi kullanılarak iki kromatogramları göstermektedir. Özellikle ilginç yaklaşık 5 dakika tutma süreleri ile yüksek yoğunluklu zirveleri. Geleneksel DPPH türetme yöntemleri tipik bir 500 ul reaksiyon döngü, kullanıldığında, tek bir geniş tepe gözlenebilir olduğu görülebilir. RF-PCD yöntemi bir reaksiyon döngüsü gerek kalmadan kullanılır, ancak, bu tek tepe noktasının, 500 ul döngü aslında iki adet tepe noktasına kullanıldığı görülmektedir açık hale gelir. RF-PCD kurulumu kullanırken Ayrıca, ek detay 5.5 dakika sonra görülebilir. Bu nedenle, DPPH RF-PSD tekniği kullanılarak örneklerde ROS analizi için DPPH kullanarak, ROS analizi geleneksel yöntemlere göre daha üstün olduğunu kanıtlamıştır.

RF-PCDfloreskamin reaktif primer amino asitlerin analizi için kullanılan ve floreskaminle 20 PCD geleneksel formlara kıyasla olmuştur. atık ve floreskaminle arasındaki türetme UV- aracılığıyla RF sonu uydurma dış bölgesinde gerçekleştirilen ve tespit edilirken, RF sütununda uç parçası multiplekslenmiş tespiti için bir platform sağladı ayrıca bu yana, türetilmemiş merkezi akış, UV-Vis yoluyla izlendi Vis. Dört amino asidi içeren test standartları serisi 6 PCD (Şekil 6A) ve RF-PSD (türetilmiş saptanması (Şekil 6B), geleneksel yöntemle kromatografik profil karşılaştırır Şekil. Çoğaltılmış çok katlı RF PCD koşullar altında analiz edildi ve türetilmemiş (Şekil 6C)) amino asit dizisinin. 7 geleneksel bir PSD ve RF-PCD aracılığıyla elde edilen iki amino asit sinyal bir bindirme bir şekil. Görülecektir ki t nedeniyle daha etkili gözlenen ayrılmasıReaksiyon döngü de çıkarılması tüm sütundan çıkan türetilmiş olmasına rağmen, daha büyük sinyal yanıt sağlamıştır. Bundan başka, daha etkili türetme reaktif karıştırma düzeni daha sinyal gürültü oranını artırmak, düşük baz gürültü ile sonuçlanmıştır. Bu etki, Tablo 1 'deki klasik PCD yöntemine göre RF-PCD yöntemi için hesaplanan saptanması ve nicelenmesi alt limitler olarak ortaya konmaktadır. Bu eğilim, DPPH: • antioksidan yanıt için daha yüksek olan Şekil 5'te görülebileceği geleneksel PCD yöntemine göre RF-PCD yöntemi. Önemli pik bozulması, geleneksel bir PSD kurulum bu yöntemin daha düşük sinyal yanıtına yol açan kullanılan kromatogramlar gözlenebilir.

RF-PCD (hem türetilmiş ve türetilmemiş akışları) ve konvansiyonel PSD tarafından analiz edildiğinde Şekil 8 triptofan zirve profilini karşılaştırır. Pik profili zamana karşı çizilen zaman pik genişliği, tüm büyük ölçüde benzer (Şekil 8A) olduğu görülmektedir. Pik profil tepe hacmi (Şekil 8B) karşı çizilmiştir edildiğinde, geleneksel PCD göre RF-PCD bulunan gelişmeler açıktır. pik hacim karşı çizilmiştir, RF PCD pik türetilmemiş tepe göre bozunma az miktarda gösterirken, bozulma, Bununla birlikte, geleneksel PCD yöntemi gözlenene kıyasla az olduğu açıktır. Geleneksel PSD göre RF-PSD ayırma verimliliğindeki gelişmeler de hem geleneksel PSD ve RF-PSD tarafından türetme sonra glisin ve lösin zirve şekilleri karşılaştırır Şekil 7'de gösterilmiştir. RF-PCD modunda sinyal iki pik arasında daha uzun bir süre için temel olan konvansiyonel PCD modunda glisin ve lösin tepe bazal zar zor ayrı olduğu görülür.

birGeleneksel PCD yöntemlerine göre RF PCD ek yarar birden fazla mesaj saptama sağlayan RF sütunu merkezi limanından türetilmemiş çıkış maddesinin izleme yeteneği. RF uç fitingi içinde frit tasarımı radyal merkezi bölgesinde akış uç teçhizatının çevre bölgesinde akışı ile karıştırmak için izin vermediğinden, bu mümkündür, bu şekilde dış bölgesinden türetilmiş akışının izlenmesini sağlayan uydurma yanı sıra merkez limanından türetilmemiş akımının izlenmesi. (280 nm'de) türetilmemiş Bu yetenek floreskamin 20 ile türetme sonrasında zayıf sinyal yanıt sahip olduğu bilinmektedir, Tablo 1 'de triptofan için elde edilen sonuçlar ile vurgulanır, bununla birlikte, diğer amino asitler aksine, bir UV detektörü bir cevap göstermektedir . algılama ve kantitatif sınırları nispeten yüksek olduğu, hem türetme sistemleri, algılama ve kantitatif ancak sınırları t çok daha düşük olduğuO akışı türetilmemiş. yeteneği kullanılarak tespit parametreleri, her bir amino asit için performans yüksek düzeyde vermek için optimize edilebilir, her iki türevlendirilmiş ve türevlendirilmemiş atık akımları izlemek için.

RF sonu montaj birden çok tasarım ikili türetme reaktif analizi için izin verir. Selim ve ark., 23 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanür kullanarak PCD geleneksel teknik ile karşılaştırıldığında fenolik bileşiklerin analizinde RF-PCD koşulları kullanılarak, iki reaktif (4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanür) performansını incelenmiştir. PCD tekniğinin Bu tip iki pompa gerektirir ve reaksiyon DPPH için bir pompa ve reaksiyon döngüsüne karşı her türetme reaktif döngüler. Çeşitli fenolik ve alkilbenzen bileşikleri, geleneksel ve RF PCD koşullar altında analiz edilmiştir. Aslında un tespit İlginç, geleneksel yöntemle altında tespit edilmedi olmayan fenolik bileşikler vardıder RF-PCD koşulları. Şekil 9 UV-Vis kromatografik tepki ve standart bir test karışımı RF-PSD kolorimetrik tepki gösterir. Şekil 10'da görüldüğü gibi, RF-PCD ayırma performansı ödün vermeden, enstrümantasyon açısından basitleştirilmiş PCD tekniği sağladı. Türetme olmadan RF-PCD ile analiz edildi ve bir adet 10 p-kresolün pik profilini karşılaştırır Şekil. RF-PCD kromatogram zirve genişliği türetilmemiş kromatogramın çok benzer olduğu görülmektedir. İki Kromatogramlarda arasındaki en önemli fark RF-PCD kromatogram üssünde biraz daha geniş olmasıdır. Bunun nedeni, RF-PCD tekniğe hiçbir zirve dağılımına az olduğunu göstermektedir. Benzer bir tepki değil sadece türetilmemiş zirve ile karşılaştırıldığında RF-PSD tarafından türetilmiş benzer zirve genişliğe sahip p-krezot zirve olduğunu gösterir Şekil 9'da görülen, fakat tüm fenoller ve alkiltüretme şeması yanıt lbenzenes aynı eğilimi gösterdi. İki türevlendirme reaktiflerin kullanımı ile RF PCD olmayan geleneksel türetme yöntemine benzer bir ayırma performansını elde da, RF-PCD dışı türetilmiş koşullar altında tespit edilmedi biri, fenolik bileşiklerin selektif saptanması için izin verilen .

RF-PCD geleneksel bir HPLC-PCD yöntemlerinin geliştirilmesi, örneğin mobil faz bileşimi genel HPLC yöntemleri uygun ayar araçları her ve akış oranı gibi, enjeksiyon hacmi ve analiz dalga RF-PCD yöntemler için geçerlidir. Ayrıca, bu tür PCD reaktif akış oranı rasyosu mobil faz olarak PCD reaktif bileşimi gibi geleneksel HPLC PCD yöntemler, uygun ayar araçları, RF-PCD yöntemler için geçerlidir. Geleneksel PSD yöntemleri mevcut değildir kullanılabilir bir ek ayarlama aracı RF-PCD kullanarak santral ve periferik gelen akım oranıSütunun limanlar. akışları sonrası dedektör uzunluğunu ve / veya iç çapı kontrol ederek hatların her birinde göreli arka baskı değiştirilerek kontrol (veya merkezi bağlantı noktasından gelen akışı tespit ediliyor değilse sütun sonrası) boru vardır. Periferik akımlarının merkezi optimal oranı, merkezi bağlantı noktası tespit ya da olup olmadığını, söz konusu reaksiyon, hem de bu gibi diğer faktörlere bağlıdır. periferik% 60 ve% 40 orta bir akış oranı genellikle iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.

ayar parametreleri ile olduğu gibi, RF-PCD sütunun kullanımı ile ortaya çıkabilecek sorunların çoğu da geleneksel PCD yöntemleri ile ortaktır. kromatografya RF-PCD analizi yaparken dikkat edilmesi gereken bir Belirli bir parametre reaktifi pompası (ler) in, özellikle sistemde akış ve basınç stabilitesi olmasıdır. sisteminde akış sabit değilse, bu taban instabilite nedenle azalan neden olabilirSinyalin sese oranı, ve kantitatif ve algılama ardından sınırlar.

RF-PCD kromatografisi, modern HPLC sütunları ve sistemlere PCD tepkileri adapte zorlukları aşmak için geliştirilmiştir. Geleneksel PCD yöntemleriyle karşılaştırıldığında RF PCD önemli avantaj, RF sütun sonu montaj içindeki bir cam hamuru içinde yer alan daha etkili karıştırma ve bu karışım geri biraz daha yüksek bir basınçtadır. Bu azaltılması veya birçok klasik PCD yöntemlerinde kullanılan büyük hacimli Reaksiyon ilmeklerin da elimine eder. Kolon sonrası ölü hacim bu azaltılması sayesinde, daha fazla kromatografik çözünürlüğü daha verimli ayırma gerçekleştirilebilir.

RF-PCD modu, geleneksel PCD yöntemlere kıyasla gürültü ayırma verimliliği, en yüksek şekil ve sinyal gelişmelere yol açmıştır. Bununla birlikte, sinyal iyileştirme dedektör bağlıdır dikkat etmek önemlidir. örnek dedektörleribağlıdır bu da numune miktarı geleneksel yöntemlere göre RF-PCD koşullarında sinyal yanıt olarak bir artış sergiler olmayabilir. Bu sütunda numune% 100 burada RF-PCD koşulları: kolon üzerine numunenin sadece belirli bir yüzdesinin altında bölütleme oranına bağlı olarak tespit edilir, tespit edilir, çünkü, geleneksel yöntemlere göre böyledir. Ancak, RF PCD reaksiyonları (sürece hem reaktifler aynı anda ilave edildiği gibidir) minimum yeniden optimizasyonu ile PCD Reaksiyon, herhangi bir ya da iki reaktif adapte edilmesi mümkün olacağı tahmin edilmektedir ve faydaları üçü için gözlenen reaksiyonlar şimdiye kadar tüm diğer PCD reaksiyonlarına çevirir test edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. (Accepted Manuscript) (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter