This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Травма спинного мозга (SCI), как правило, вызывает разрушительные неврологические дефициты, в частности, путем повреждения волокон, наследующих от головного мозга к спинному мозгу. Важным направлением тока исследований сосредоточено на механизмах адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного или индуцированного функционального восстановления после SCI. Спонтанное функциональное восстановление, как сообщается, в жизни больше рано, поднимая интересные вопросы о том, как адаптивные изменения пластичности по мере развития спинного мозга. Для того, чтобы облегчить изучение этой динамики, мы разработали модель SCI в неонатальном мыши. Модель имеет отношение к детской ТСМ, который слишком мало изучен. Поскольку нейронная пластичность у взрослого человека включает в себя некоторые из тех же механизмов , как пластичности нейронов в раннем периоде жизни 1, эта модель может потенциально иметь некоторое отношение также и для взрослых ТСМ. Здесь мы опишем всю процедуру генерирования воспроизводимой компрессии спинного мозга (SCC) травмы в неонатальном мышиуже в послеродовом (Р) день 1. SCC достигается путем выполнения ламинэктомии на заданном уровне спинного (здесь описано на грудном уровнях 9-11), а затем с помощью модифицированного Yasargil аневризмы мини-клип, чтобы быстро сжимать и разжимать спинной мозг , Как было описано выше, раненых неонатального мышей могут быть проверены на поведенческих дефицитов или приносится в жертву экс естественных условиях физиологического анализа синаптической связи с использованием электрофизиологических и высокой пропускной способности методов оптической записи 1. Более ранние и продолжающиеся исследования с использованием поведенческие и физиологические оценки показали резкое, острое нарушение моторики задних конечностей с последующим полным функционального восстановления в течение 2 -х недель, и первое доказательство изменений функциональной схемы на уровне идентифицированных нисходящей синаптические связи 1.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
В этой статье процедуры клипа генерируемые травмы SCC в P1 мышей описаны. Те же самые процедуры, также могут быть выполнены на более поздних этапах. Компрессионные травмы были успешно выполнены в Р5, Р7, Р9 и Р12 (Züchner, и др., Рукописи в процессе подготовки). На всех этапах постнатального развития, общей анестезии получается с изофлуран испарившейся в чистом кислороде, но анестезирующий результат во многом зависит от возраста. В начальных попытках P1-P4, перед тем местная анестезия была введена в протокол, было трудно получить глубокий и продолжительный седативный эффект из-за узкого окна доза-эффект между недостаточной седации и передозировки. Кроме того, проблемы , связанные с нейротоксическом эффект изофлюрана у новорожденных животных были повышены 27-30. Сочетание изофлуран и результаты местного анестетика бупивакаина в более глубоком и более стабильной анестезии, обеспечивая при этом в изофлуран снижение дозы на 2-3 раза. Различные типы anestheSIA были описаны для новорожденных грызунов, в том числе cryoanesthesia 31,32, но один потенциальный неудобство cryoanesthesia является его нейропротекторное действие (обзор 33,34), что может осложнить генерацию эффективной и воспроизводимой травмы. Барбитурата на основе анестезии считается, имеют более низкую эффективность у новорожденных мышей из – за снижения уровня сывороточного альбумина и жира , чем у взрослых 35,36.
Хотя довольно агрессивен и травматическое, как только процедура установлена смертность во время операции низка. Тем не менее, существуют критические шаги в ходе процедуры, которые требуют особого внимания для улучшения восстановления и выживаемости оперированных мышей. Одним из важных вопросов является выбор щенков, которые будут иметь наилучшие шансы пережить операцию. Когда помет велико состояние питания отдельных щенков меняется. В дополнение к неизбежным кровотечение, которое происходит во время операции, управляемые щенками проводят часS от матери, и они часто не пьют молоко до следующего утра. Таким образом, преимущество, чтобы выбрать щенкам, которые уже имеют определенное количество молока в желудке. Это хорошо видно через кожу живота от P0 до P7.
В первую ночь оперированное щенок на большой риск быть разобраны матерью. Во время первоначальной разработки этой модели более половины прооперированных мышей отсутствовали на следующее утро, с явными признаками крови в клетке. Necrophagy, людоедство и детоубийство у грызунов были изучены в течение многих десятилетий 37-40. В этом исследовании, каннибализм был только свидетелем один раз, но считался более вероятным объяснением, чем necrophagy потому что детенышей, которые были возвращены в клетке, как правило, были в такой хорошей форме, что смерть от естественных причин в течение ночи казалось невероятным. Это побудило идею использования обратимого фармакологического агента, такого как диазепам, чтобы уменьшить беспокойство и агрессивность яп мать (обзор 41). Внутрибрюшинный инъекции диазепама значительно улучшили ситуацию, понизив смертность в течение первой ночи с более чем 60% до менее чем на 20%.
Уменьшение размера помета путем выбраковки и мешая помет как можно меньше следующие послеоперационного возврата дополнительные элементы, которые могут принести пользу оперируемые животных. Тем не менее, оставив только эксплуатируемые щенков с матерью не выгодно. Лучший баланс эксплуатируемых / неоперированных щенками может варьироваться в зависимости от линии, но для ICR и SCID-ICR мышей, оставляя 4-5 эксплуатируемые щенков (травма или мнимые) вместе с 3-4 неоперированных щенкам дали лучшие результаты.
В общем смысле, основным недостатком этой модели новорожденных SCI является то, что неонатальный спинного мозга во многом отличается от взрослого спинного мозга, и, таким образом, не может обеспечить экспериментальные результаты, сравнимые с результатами, полученными от взрослых моделей с повреждением спинного мозга. Такие различия включают общий размер иобъем спинного мозга, число клеток, недопредставленность специфических типов клеток, таких как олигодендроциты, незрелые иммунные ответы и незрелых нервных цепей. Выводы, сделанные из экспериментов в этой модели, следовательно, должны быть тщательно продуманы. С другой стороны, модель имеет отношение к относительно менее исследованной сценария педиатрического SCI. К тому же, что видимая слабость в отношении взрослых моделей с повреждением спинного мозга также потенциальная сила, поскольку это может позволить выяснению пластическими механизмов, которые, хотя и минимально сохранившийся во взрослом спинном мозге, может представлять собой терапевтический субстрат, если восстановлен. Вполне возможно, что восстановление неонатальных или даже эмбриональных условиях могут быть реализованы путем имплантации менее развитых клеток или тканей или обработкой реагентами, которые порождают взрослую ткань с более ранними характеристиками развития. Использование ферментов для устранения перинейронное сетей является примером последнего подхода 42,43.
<p class="Jove_content"> Одной из основных проблем при создании животной модели для ТСМ является получение стандартизированного травмы. Это очень важный аспект , который был рассмотрен в нескольких моделях с повреждением спинного мозга, например, рассечение, гемисекция, молотки, сжатия воздушного шара, пинцет давка, статическое сжатие веса и т.д. Что касается влияния на устройства, усилия в этом направлении привели к моделям с повреждением спинного мозга в взрослых грызунов , где можно манипулировать несколькими параметрами воздействия , такие как скорость, сила и продолжительность (обзор 44). Другой подход, включающий меньше оборудования, использует модификацию аневризмы клипа Керр-Lougheed 45,46. Эти 2 подхода дополняют друг друга, как ударник имитирует травму ушиб в то время как клип имитирует травмы сжатия с некоторой степенью сопутствующей ишемии. Из-за существенных ограничений по размеру и большей уязвимости новорожденных мышей, тем выше смертность, связанная с более длительными хирургических операций, а также расходы на развиработке меньшего масштаба оборудования, она была выбрана для разработки клипа сгенерированных сжатия, а не ушиба подхода ударника сгенерированные. Это было достигнуто за счет адаптации коммерчески доступного аневризмы мини-клип , чтобы приспособить размер позвоночного столба у новорожденных мышей 1. Добавление стопор обеспечивает стандартизированный ширину сжатия, и до тех пор пока напряжение клипа сжимается до предела стопора, сила сжатия во время статической фазы при минимальной ширине должна немного изменяться. То, что не нормируется является скорость сжатия во время его динамической фазы, так как это будет меняться по мере изменения клипа напряжения в течение всего срока службы. Поскольку статическая фаза сжатия длится гораздо дольше, чем динамическая фаза, и есть немного, чтобы предположить, что ткани спинного мозга оказывает большую часть противодействующей против мини-клип лезвий, вполне вероятно, что тяжесть травмы наибольшей степени зависит от статическая фаза. Это, однако, еще предстоит проверить. травмаТяжесть, вероятно, зависеть от множества факторов, в том числе статической силы сжатия и длительности, скорости компрессии и декомпрессии, положение мини-клипа, а также количество сжатий, выполненных в том же самом месте. Таким образом, комбинаторное изменение этих параметров может привести к генерации спектра травмы важностей от слабой до тяжелой. Несмотря на потенциал изменчивости, в нашем ранее опубликованном исследовании 1 мы получили устойчивые результаты при гистологических, физиологических и поведенческих уровнях, так что есть немного , чтобы предположить , что приемлемая стандартизация трудно достичь. Отметим , что в этом исследовании мы использовали несколько методов проверки на каждом уровне, включая поведенческие тесты , такие как воздушно-степпинг , как показано на рисунке 5.В этой модели новорожденных SCI травма щадит определенную часть аксонов и тем самым обеспечивает ситуацию благоприятной для выявляя адаптивной пластичности за счет повторного modelinг избавлены соединений и образование новых схем. Кроме того, поскольку неонатальной мыши хорошо подходит для исследования многими экспериментальными методами, можно использовать эту модель для изучения функционального восстановления и адаптивной пластичности с интегративного подхода, в том числе поведенческие тесты, ретроградной и антероградного аксонов копировальная, иммуногистохимии, электрофизиологии и высокая -throughput оптической записи 1. В качестве примера, мы воспользовались этим интегративного подхода , чтобы продемонстрировать сети ремоделирования на уровне удельных нисходящих с использованием высокой пропускной способностью визуализации кальция в естественных условиях бывших Wholemount препаратах ствола мозга и травму спинного мозга 1. Это может быть отодвинута еще дальше с помощью нейро-оптогенетика и оптогенетика фармакологические инструменты для оценки ремоделирования синаптических связей между специфическими субпопуляциями нейронов спинного мозга.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |