This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Ruggenmergletsel (SCI) veroorzaakt meestal verwoestende neurologische stoornissen, met name door schade aan vezels afdalen van de hersenen naar het ruggenmerg. Een belangrijke huidige gebied van onderzoek is gericht op de mechanismen van adaptieve plasticiteit die spontane of geïnduceerde functioneel herstel na SCI ten grondslag liggen. Spontane functioneel herstel is gemeld grotere vroeg in het leven te zijn, het verhogen interessante vragen over hoe adaptieve plasticiteit verandert als het ruggenmerg zich ontwikkelt. Het onderzoek van deze dynamische vergemakkelijken, hebben we een SCI model in de neonatale muis ontwikkeld. Het model heeft relevantie voor pediatrisch SCI, die te weinig bestudeerd. Omdat neurale plasticiteit in het volwassen impliceert een aantal van dezelfde mechanismen als neurale plasticiteit in het begin van het leven 1, kan dit model mogelijk wel enige relevantie ook voor volwassen SCI. Hier de gehele procedure beschrijven we voor het genereren van een reproduceerbare ruggenmerg compressie (SCC) schade in de neonatale muisal postnatale (P) dag 1. SCC wordt bereikt door het uitvoeren van een laminectomie op een bepaald ruggenmergniveau (hier beschreven thoracale niveaus 9-11) en vervolgens met behulp van een gemodificeerde Yasargil aneurysma mini-clip snel comprimeren en decomprimeren van het ruggenmerg . Zoals eerder beschreven, kan de benadeelde neonatale muizen worden getest afwijkend gedrag of opgeofferd ex vivo fysiologische analyse van synaptische connectiviteit gebruik elektrofysiologische en zeer snelle optische opnametechniek 1. Eerdere en lopende onderzoeken met gedrags- en fysiologische beoordeling hebben een dramatische, acute verminderde motiliteit achterbeen gevolgd door een volledig functioneel herstel binnen 2 weken, en het eerste bewijs van veranderingen in de functionele schakelingen op het niveau herkende aflopend synaptische verbindingen 1 getoond.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
In dit artikel worden de procedures voor een clip-gegenereerde SCC letsel bij P1 muizen worden beschreven. Dezelfde procedure kan ook worden uitgevoerd in een latere fase. Compressie verwondingen werden met succes uitgevoerd bij P5, P7, P9 en P12 (Züchner, et al., Manuscript in voorbereiding). Bij alle postnatale fase, wordt algemene anesthesie verkregen met isofluraan verdampt in zuivere zuurstof, maar de verdoving resultaat is sterk afhankelijk van de leeftijd. In eerste pogingen tot P1-P4, voordat de plaatselijke verdoving werd in het protocol, was het moeilijk om een diepe en verlengde sedatie verkrijgen door een smalle dosis-effect window tussen onvoldoende sedatie en overdosis. Daarnaast is bezorgdheid met betrekking tot een neurotoxisch effect van isofluraan in pasgeboren dieren verhoogd 27-30. Een combinatie van isofluraan en de plaatselijke verdoving Bupivacaine resulteert in een diepere en meer stabiele anesthesie terwijl het toelaten van een isofluraan dosis reductie met een factor 2-3. Verschillende soorten anesthesia beschreven neonatale knaagdieren, waaronder cryoanesthesia 31,32, maar één potentiële ongemak van cryoanesthesia is het neuroprotectieve effect (beoordeeld door 33,34), die de vorming kan bemoeilijken van een efficiënt en reproduceerbaar letsel. -Barbituraat gebaseerde anesthesie wordt beschouwd als lagere efficiëntie in neonatale muizen hebben als gevolg van lagere niveaus van serumalbumine en lichaamsvet dan bij volwassenen 35,36.
Hoewel vrij invasief en traumatisch, zodra de procedure het sterftecijfer wordt vastgesteld tijdens de operatie is laag. Er zijn echter kritische stappen in de procedure die extra aandacht voor het herstel en de overleving van de geopereerde muizen verbeteren. Een belangrijk punt is voor pups die de beste kans om de operatie te overleven zal selecteren. Wanneer het nest groot is de voedingstoestand van de individuele pups varieert. Naast de onvermijdelijke bloeden die optreedt tijdens de operatie, uitgevoerd pups brengen uurs uit de buurt van de moeder, en ze vaak niet drinken melk voor de volgende ochtend. Het is dus een voordeel pups die reeds een bepaalde hoeveelheid melk in de maag te selecteren. Dit is direct zichtbaar door de buikhuid van P0 tot P7.
Tijdens de eerste nacht de geopereerde pup is een groot risico te worden gekannibaliseerd door de moeder. Tijdens de initiële ontwikkeling van dit model meer dan de helft van de geopereerde muizen misten de volgende ochtend, met duidelijke tekenen van bloed in de kooi. Necrophagy, kannibalisme en kindermoord bij knaagdieren zijn onderzocht tientallen jaren 37-40. In deze studie werd kannibalisme eenmaal getuige, maar werd beschouwd als een meer waarschijnlijke verklaring dan Necrophagy omdat de pups die werden aan de kooi kenmerkend waren in zo'n goede staat dat natuurlijke dood tijdens de nacht leek onwaarschijnlijk. Dit leidde tot het idee om een omkeerbare farmacologisch middel zoals Diazepam angst en agressiviteit i verminderenn de moeder (beoordeeld door 41). Intraperitoneale injectie van diazepam sterk verbeterde de situatie vallen mortaliteit gedurende de eerste nacht meer dan 60% tot minder dan 20%.
Het verminderen van worpgrootte door het ruimen en het verstoren van de kattenbak zo weinig mogelijk volgende postoperatieve terugkeer zijn bijkomende elementen die kunnen profiteren van de geopereerde dieren. Echter, waardoor alleen bediend pups met de moeder is niet gunstig. De beste balans tussen gebruikt / niet geopereerde pups kan variëren afhankelijk van de lijn, maar voor ICR en SCID-ICR-muizen verlaten 4-5 bediend pups (letsel of sham) samen met 3-4 geopereerde pups gaf de beste resultaten.
In algemene zin is de belangrijkste beperking van deze neonatale SCI model is dat de neonatale ruggenmerg verschilt in meerdere opzichten van de volwassen ruggenmerg, en kan dus niet experimentele resultaten die vergelijkbaar zijn met die verkregen uit volwassen SCI modellen leveren. Dergelijke verschillen omvatten totale omvang envolume van het ruggenmerg, celgetal, ondervertegenwoordigd specifieke celtypen zoals oligodendrocyten, onrijpe immuunsysteem en onvolwassen neuronale circuits. Conclusies uit experimenten op dit model moeten daarom zorgvuldig worden overwogen. Anderzijds is het model relevant voor de relatief minder onderzochte scenario pediatrische SCI. Bovendien is de schijnbare zwakheid met betrekking tot volwassen SCI modellen is een potentiële kracht omdat de opheldering van mechanismen die plasticiteit, hoewel minimaal bestaande in het volwassen ruggenmerg, kan een therapeutisch substraat vertegenwoordigen als hersteld kunnen toestaan. Het is denkbaar dat herstel van neonatale of embryonale voorwaarden kan worden uitgevoerd door implantatie van minder ontwikkelde cellen of weefsel of door behandeling met reagentia die de volwassen weefsel met eerdere ontwikkelingskenmerken veroorzaken. Gebruik enzymen perineuronal netten elimineren is een voorbeeld van de laatste aanpak 42,43.
<p class="Jove_content"> Een belangrijke kwestie bij de vaststelling van een diermodel voor SCI is een gestandaardiseerde letsel te verkrijgen. Dit is een belangrijk aspect dat in meerdere SCI modellen heeft gericht is, bijvoorbeeld doorsnijding, hemisectie, kloppers, ballon compressie, tangen verbrijzeling, statisch gewicht compressie, enz. Met betrekking tot de invloed apparaten, de inspanningen in deze richting hebben geleid tot SCI modellen in volwassen knaagdieren waarbij meerdere parameters van het effect zoals snelheid, kracht en duur kan worden gemanipuleerd (overzicht door 44). Een andere benadering, waarbij minder apparatuur, biedt werk aan een wijziging van het Kerr-Lougheed aneurysmaclip 45,46. Deze 2 benaderingen zijn complementair als de impactor bootst een contusie letsel, terwijl de clip bootst een compressie letsel met een zekere mate van gelijktijdige ischemie. Vanwege de aanzienlijke omvang beperkingen en grotere kwetsbaarheid van neonatale muizen, de hogere sterfte langere operaties alsmede de kosten van ontoping kleinere schaal apparatuur werd gekozen om een clip-gegenereerde compressie te ontwikkelen in plaats van een-impactor gegenereerd kneuzing aanpak. Dit werd bewerkstelligd door het aanpassen van een commercieel verkrijgbare aneurysma mini-clip om de grootte van de wervelkolom van neonatale muizen 1 tegemoet. Toevoegen van een stop verzekert een gestandaardiseerde compressie breedte, en zolang de spanning van de klem comprimeert tot de grens van de stop, moet de kracht van de druk in de statische fase bij minimale breedte variëren weinig. Wat niet gestandaardiseerd is de snelheid van de druk tijdens de dynamische fase, aangezien dit zal variëren terwijl de stapel spanning verandert gedurende de levensduur. Aangezien de statische fase van de compressie veel langer dan de dynamische fase duurt en er helemaal niet zeker dat het ruggenmerg weefsel oefent veel als een tegenkracht tegen de mini-clip blades, is het waarschijnlijk dat de ernst van schade meest afhankelijk de statische fase. Dit is echter nog worden getest. Letselernst hangt waarschijnlijk af van meerdere factoren, waaronder de statische compressiekracht en duur, de snelheid van de compressie en decompressie, de positie van de mini-klem, en het aantal compressies uitgevoerd op dezelfde locatie. Zo zou combinatorische variatie van deze parameters leiden tot het genereren van een spectrum schade ernst van zwak tot ernstig. Ondanks de mogelijke variabiliteit in ons eerder gepubliceerde studie 1 verkregen we consistente resultaten op histologische, fysiologische en gedragsmatige niveaus, zodat er weinig te suggereren dat aanvaardbaar normalisatie is moeilijk te bereiken. We merken dat in deze studie gebruikte we meerdere methoden validatie op elk niveau, inclusief gedragstesten zoals lucht-stepping zie figuur 5.In deze neonatale SCI model spaart de verwonding een bepaald deel van axonen en verschaft daardoor een gunstige situatie voor het opwekken adaptieve plasticiteit via re-modeling gespaard verbindingen en de vorming van nieuwe circuits. Aangezien de neonatale muis goed geschikt voor onderzoek door vele experimentele methoden, is het mogelijk om dit model voor functioneel herstel en adaptieve plasticiteit met een geïntegreerde benadering, zoals gedragstesten, retrograde en anterograde axonale tracing, immunohistochemie, elektrofysiologie en hoge bestuderen -throughput optische registratiemedium 1. Als voorbeeld hebben we voordeel van deze geïntegreerde benadering van netwerk hermodelleren aangetoond op het niveau van specifieke aflopend inputs met high-throughput calcium beeldvorming in ex vivo wholemount preparaten van de hersenstam en ruggemerg 1. Dit kan verder worden geduwd door het gebruik van neuro-optogenetic en optogenetic farmacologie tools om de herinrichting van synaptische verbindingen tussen specifieke subpopulaties van spinale neuronen te beoordelen.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |