This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Rygmarvsskade (SCI) forårsager typisk ødelæggende neurologiske underskud, navnlig gennem skader på fibre faldende fra hjernen til rygmarven. En stor aktuel forskningsområde er fokuseret på de mekanismer, adaptive plasticitet, der ligger til grund for spontan eller induceret funktionel restitution efter SCI. Spontan funktionelle opsving er rapporteret at være større tidligt i livet, rejse interessante spørgsmål om, hvordan adaptive plasticitet ændringer rygmarven udvikler sig. For at lette undersøgelse af denne dynamiske, har vi udviklet et SCI-model i den neonatale mus. Modellen har relevans for pædiatrisk SCI, som er for lidt undersøgt. Fordi neurale plasticitet i den voksne involverer nogle af de samme mekanismer som neurale plasticitet tidligt i livet 1 kan denne model potentielt have en vis relevans også for voksne SCI. Her beskriver vi hele proceduren for at generere en reproducerbar rygmarvskompression (SCC) skade i neonatale musså tidligt som postnatal (P) dag 1. SCC opnås ved at udføre en laminektomi ved en given spinal niveau (her beskrevet på thorax niveauer 9-11) og derefter anvendelse af en modificeret Yasargil aneurisme mini-clip til hurtigt at komprimere og dekomprimere rygmarven . Som tidligere beskrevet kan den tilskadekomne neonatale mus testes for adfærdsmæssige mangler eller aflivet til ex vivo fysiologisk analyse af synaptisk forbindelse under anvendelse elektrofysiologiske og højt gennemløb optisk indspilningsteknikker 1. Tidligere og igangværende studier bruger adfærdsmæssige og fysiologiske vurdering har vist en dramatisk, akut svækkelse af bagben motilitet efterfulgt af en komplet funktionel genopretning inden for 2 uger, og det første tegn på ændringer i funktionel kredsløb på niveau med identificerede faldende synaptiske forbindelser 1.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
I denne artikel procedurerne for et klip-genereret SCC skade P1 mus er beskrevet. De samme fremgangsmåder kan også udføres på et senere tidspunkt. Compression skader blev udført med succes på P5, P7, P9 og P12 (Züchner, et al., Manuskript under udarbejdelse). På alle postnatale faser, er generel anæstesi opnås med isofluran fordampet i ren ilt, men det bedøvende resultat afhænger i høj grad af alder. I indledende forsøg på P1-P4, før lokalbedøvelse blev indført i protokollen, var det vanskeligt at opnå en dyb og langvarig sedation på grund af en smal dosis-effekt vindue mellem utilstrækkelig sedation og overdosis. Desuden har betænkeligheder med hensyn til en neurotoksisk effekt af isofluran hos nyfødte dyr blevet rejst 27-30. En kombination af isofluran og de lokale bedøvelsesmiddel Bupivacain giver en dybere og mere stabil anæstesi, mens tillader en isofluran dosisreduktion med en faktor 2-3. Forskellige typer af anesthesia er blevet beskrevet til neonatale gnavere, herunder cryoanesthesia 31,32, men en potentiel ulempe ved cryoanesthesia er dets neurobeskyttende virkning (gennemgået af 33,34), som kunne komplicere dannelsen af en effektiv og reproducerbar skade. Barbiturat-baseret anæstesi anses for at have lavere effektivitet i neonatale mus som følge af lavere niveauer af serum-albumin og kropsfedt end hos voksne 35,36.
Selvom helt invasive og traumatisk, når proceduren er etableret dødeligheden under operationen er lav. Men der er kritiske trin under proceduren, der kræver særlig opmærksomhed for at forbedre inddrivelsen og overlevelse af de opererede mus. Et vigtigt spørgsmål er at vælge hvalpe, der vil have den bedste chance for at overleve operationen. Når kuldet er stort den ernæringsmæssige tilstand af de enkelte hvalpe varierer. Ud over den uundgåelige blødning, der forekommer under kirurgi, der drives hvalpe tilbringer times væk fra moderen, og de ofte ikke drikke mælk før næste morgen. Det er således en fordel at vælge hvalpe, der allerede har en vis mængde mælk i maven. Dette er umiddelbart synlige gennem den abdominale hud fra P0 til P7.
Under den første nat det opererede hvalp er stor risiko for at blive cannibalized af moderen. Under den første udvikling af denne model mere end halvdelen af de opererede mus manglede den følgende morgen, med klare tegn på blod i buret. Necrophagy, kannibalisme og barnemord i gnavere er blevet studeret i årtier 37-40. I denne undersøgelse blev kannibalisme kun vidne én gang, men blev betragtet som en mere sandsynlig forklaring end necrophagy fordi hvalpene, der blev returneret til buret var typisk i så god form, at døden ved naturlige årsager i løbet af natten virkede usandsynlig. Det fik tanken om at bruge en reversibel farmakologisk middel, såsom Diazepam til at reducere angst og aggressivitet in moderen (gennemgået af 41). Intraperitoneal injektion af Diazepam væsentligt forbedret situationen, droppe dødelighed under første nat fra mere end 60% til mindre end 20%.
Reduktion kuldstørrelse ved nedslagning og forstyrre kuldet så lidt som muligt efter postoperativ afkast er yderligere elementer, der kan gavne de opererede dyr. Men så kun drives hvalpe med moderen er ikke gavnligt. Den bedste balance af betjente / ikke-opererede hvalpe kan variere afhængigt af den linje, men for ICR og SCID-ICR-mus forlader 4-5 betjente unger (skade eller fingeret) sammen med 3-4 ikke-opererede unger gav de bedste resultater.
I en generel forstand, den vigtigste begrænsning ved denne neonatal SCI model er, at den neonatale rygmarv afviger i mange henseender fra den voksne rygmarven, og kan således ikke give eksperimentelle resultater, som er sammenlignelige med dem opnået fra voksne SCI modeller. Sådanne forskelle omfatter samlede størrelse ogvolumen af rygmarven, celleantal, underrepræsentation af specifikke celletyper såsom oligodendrocytter, umodne immunreaktioner og umodne neuronale kredsløb. Konklusionerne fra forsøg i denne model skal derfor overvejes nøje. På den anden side, modellen er relevant for den relativt mindre undersøgte scenario pædiatrisk SCI. Desuden er tilsyneladende svaghed i forhold til voksne SCI-modeller er også en potentiel styrke, da det kan give belysning af plasticitet mekanismer, der, selv om minimalt eksisterede i den voksne rygmarven, kunne udgør en terapeutisk substrat hvis genindsat. Det er tænkeligt, at genindsættelse af neonatale eller endda embryonale forhold kan gennemføres ved implantation af mindre udviklede celler eller væv eller ved behandling med reagenser, der afføde den voksne væv med tidligere udviklingsmæssige karakteristika. Anvendelse af enzymer til at fjerne perineuronal redskaber er et eksempel på den sidstnævnte fremgangsmåde 42,43.
<p class="Jove_content"> Et stort problem, når oprettelse en dyremodel for SCI er at opnå en standardiseret skade. Dette er et vigtigt aspekt, der er blevet behandlet i flere SCI-modeller, f.eks transsektion, hemisektion, Slaglegemerne, ballon kompression, pincet knuse, statisk vægt kompression, etc. Med hensyn til at påvirke enheder, bestræbelser i denne retning har resulteret i SCI-modeller i voksne gnavere, hvor der kan manipuleres flere parametre af virkningen såsom hastighed, kraft og varighed (gennemgået af 44). En anden tilgang, der involverer mindre udstyr, beskæftiger en modifikation af Kerr-Lougheed aneurisme clips 45,46. Disse 2 tilgange supplerer hinanden som slaglegemet efterligner en kontusion skade mens klip efterligner en kompression skade med en vis grad af samtidig iskæmi. På grund af de betydelige størrelse begrænsninger og større sårbarhed neonatale mus, den højere dødelighed forbundet med længere operationer samt omkostningerne ved develvikle mindre udstyr skala, blev det valgt at udvikle et klip-genereret kompression i stedet for en attrappen-genereret kontusion tilgang. Dette blev opnået ved at tilpasse en kommercielt tilgængelig aneurisme mini-klip til at rumme størrelsen af rygsøjlen for neonatal mus 1. Tilføjelse af en prop sikrer en standardiseret kompression bredde, og så længe spændingen af klemmen komprimerer til grænsen af proppen, bør kraften af kompression under den statiske fase ved minimal bredde variere lidt. Hvad er ikke standardiseret, er hastigheden af komprimering under dens dynamiske fase, da dette vil variere, da clip spænding ændrer sig over dens levetid. Som den statiske fase af komprimering varer meget længere end den dynamiske fase, og der er lidt, der tyder på, at rygmarven væv udøver meget af en modkraft mod de mini-clips knive, er det sandsynligt, at sværhedsgraden af skade er mest afhængig af den statiske fase. Dette er dog endnu ikke afprøvet. Skadesværhedsgraden vil sandsynligvis afhænge af flere faktorer, herunder den statiske kompressionskraft og varighed, hastigheden af kompression og dekompression, positionen af den mini-klip, og antallet af kompressioner udføres på samme sted. Således kunne kombinatorisk variation i disse parametre resulterer i frembringelsen af et spektrum af skade sværhedsgrader fra svag til alvorlig. Trods potentialet for variabilitet i vores tidligere offentliggjorte undersøgelse 1 vi opnået ensartede resultater ved histologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige niveau, så der er lidt, der tyder på, at acceptabel standardisering er svært at opnå. Vi bemærker, at vi i denne undersøgelse bruges flere metoder til validering på hvert niveau, herunder adfærdsmæssige tests såsom air-stepping, som vist i figur 5.I denne neonatal SCI model skåner skaden en vis del af axoner og derved giver en situation gunstig for at fremkalde adaptiv plasticitet gennem re-modeling skånet forbindelser og dannelsen af nye kredsløb. Eftersom den neonatale mus er velegnet til undersøgelse af mange eksperimentelle metoder, er det muligt at bruge denne model til at studere funktionel genopretning og adaptiv plasticitet med en integrativ tilgang, herunder adfærdsmæssige tests, retrograd og anterograd axonal sporing, immunhistokemi, elektrofysiologi og høj -throughput optisk optagelse 1. Som et eksempel, tog vi fordel af denne integrativ tilgang til at demonstrere netværk re-modellering på niveau med specifikke faldende input ved hjælp af høj-throughput calcium imaging i ex vivo wholemount præparater af hjernestammen og sårede rygmarv 1. Dette kan skubbes yderligere ved hjælp af neuro-optogenetic og optogenetic farmakologi værktøjer til at vurdere ombygningen af synaptiske forbindelser blandt specifikke subpopulationer af spinal neuroner.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |