This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
lesioni del midollo spinale (SCI) provoca in genere deficit neurologici devastanti, in particolare attraverso i danni alle fibre che discendono dal cervello al midollo spinale. Un importante attuale area di ricerca è focalizzata sui meccanismi di plasticità adattativa che sono alla base di recupero funzionale spontaneo o indotto dopo SCI. recupero funzionale spontanea è segnalato per essere più presto nella vita, sollevando domande interessanti su come i cambiamenti di plasticità adattativa come il midollo spinale si sviluppa. Per facilitare indagini di questa dinamica, abbiamo sviluppato un modello SCI nel topo neonatale. Il modello ha rilevanza per pediatrica SCI, che è troppo poco studiato. Perché plasticità neurale nell'adulto comporta alcuni degli stessi meccanismi come plasticità neurale nella vita in anticipo 1, questo modello potrebbe potenzialmente avere una certa rilevanza anche per l'adulto SCI. Qui si descrive l'intera procedura per la generazione di un infortunio riproducibile compressione del midollo spinale (SCC) nel topo neonatalecome già postnatale (P) giorno 1. SCC è ottenuto eseguendo una laminectomia ad un dato livello spinale (qui descritto a livelli toraciche 9-11) e quindi utilizzando una versione modificata Yasargil aneurisma mini-clip per comprimere e decomprimere rapidamente il midollo spinale . Come descritto in precedenza, i topi neonatale infortunato può essere testato per deficit comportamentali o sacrificato per ex vivo analisi fisiologica di connettività sinaptica utilizzando tecniche di registrazione ottica elettrofisiologici e high-throughput 1. Precedenti e in corso studi che utilizzano la valutazione comportamentale e fisiologica hanno dimostrato un drammatico, insufficienza acuta di arti posteriori motilità seguito da un recupero funzionale completo entro 2 settimane, e la prima prova di cambiamenti nella circuiteria funzionale a livello di identificate decrescente connessioni sinaptiche 1.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
In questo articolo vengono descritte le procedure per un infortunio SCC clip-generato nei topi P1. Le stesse procedure possono essere eseguite anche in fasi successive. Lesioni di compressione sono stati eseguiti con successo a P5, P7, P9 e P12 (Züchner, et al., Manoscritto in preparazione). In tutte le fasi postnatali, anestesia generale si ottiene con isofluorano vaporizzato in ossigeno puro, ma il risultato anestetico dipende molto dall'età. In tentativi iniziali P1-P4, prima dell'anestesia locale è stata introdotta nel protocollo, era difficile ottenere una sedazione profonda e prolungata causa di una stretta finestra dose-effetto tra la sedazione e sovradosaggio insufficiente. Inoltre, le preoccupazioni legate ad un effetto neurotossico di isoflurano negli animali appena nati sono stati sollevati 27-30. Una combinazione di isoflurano ei locali risultati anestetico Bupivacaine in anestesia profonda e più stabile pur permettendo una riduzione della dose isoflurano di un fattore 2-3. Diversi tipi di anestheSIA sono stati descritti per i roditori neonatale, compresi cryoanesthesia 31,32, ma una potenziale inconveniente di cryoanesthesia è il suo effetto neuroprotettivo (recensito da 33,34), che potrebbero complicare la generazione di un infortunio efficiente e riproducibile. Anestesia barbiturico-based è considerato di avere una minore efficienza in topi neonati a causa di bassi livelli di albumina sierica e il grasso corporeo rispetto agli adulti 35,36.
Anche se piuttosto invasiva e traumatica, una volta che la procedura è stabilito il tasso di mortalità durante l'intervento chirurgico è bassa. Tuttavia, ci sono passaggi critici durante la procedura che richiedono particolare attenzione per migliorare il recupero e la sopravvivenza dei topi operati. Un problema importante è quello di selezionare i cuccioli che avranno le migliori possibilità di sopravvivere alla chirurgia. Quando la lettiera è grande lo stato nutrizionale dei singoli cuccioli varia. Oltre al sanguinamento inevitabile che si verifica durante l'intervento chirurgico, cuccioli operati trascorrono ores lontano dalla madre, e spesso non bere latte prima del mattino successivo. È quindi un vantaggio per selezionare cuccioli che hanno già una certa quantità di latte nello stomaco. Questo è facilmente visibile attraverso la pelle addominale da P0 a P7.
Durante la prima notte il cucciolo operato è a grande rischio di essere cannibalizzato dalla madre. Durante lo sviluppo iniziale di questo modello più della metà dei topi operati mancavano la mattina seguente, con evidenti segni di sangue nella gabbia. Necrophagy, cannibalismo e infanticidio nei roditori sono stati studiati per decenni 37-40. In questo studio, il cannibalismo è stato testimoniato solo una volta, ma era considerata una spiegazione più probabile rispetto necrophagy perché i cuccioli che sono stati restituiti alla gabbia erano tipicamente così in forma che la morte per cause naturali durante la notte sembrava improbabile. Da qui l'idea di utilizzare un agente farmacologico reversibili come Diazepam per ridurre l'ansia e aggressività in la madre (rivisto da 41). iniezione intraperitoneale di Diazepam notevolmente migliorato la situazione, lasciando cadere la mortalità durante la prima notte da oltre il 60% a meno del 20%.
La riduzione delle dimensioni dei cuccioli da abbattimento e disturbare la lettiera il meno possibile dopo il ritorno post-operatorio sono elementi aggiuntivi che possono beneficiare gli animali operati. Tuttavia, lasciando cuccioli funzionare solo con la madre non è vantaggioso. Il miglior equilibrio tra gestite / cuccioli non operati possono variare a seconda della linea, ma per i topi ICR e SCID-ICR lasciando 4-5 cuccioli gestite (lesione o sham) insieme con 3-4 cuccioli non operato ha dato i migliori risultati.
In senso generale, il principale limite di questo modello SCI neonatale è che il midollo spinale neonatale differisce in molti aspetti dal midollo spinale adulto, e quindi non può fornire risultati sperimentali che sono paragonabili a quelli ottenuti dai modelli SCI adulti. Tali differenze includono la dimensione complessiva eil volume del midollo spinale, numero di cellulare, sottorappresentazione di tipi cellulari specifici come oligodendrociti, le risposte immunitarie immature e circuiti neuronali immature. Le conclusioni tratte da esperimenti in questo modello devono pertanto essere considerati con attenzione. D'altra parte, il modello è rilevante per lo scenario relativamente meno investigato di pediatrica SCI. Inoltre, la debolezza apparente rispetto ai modelli SCI adulti è anche un potenziale di forza in quanto può consentire il chiarimento dei meccanismi di plasticità che, anche se in minima parte ancora esistente nel midollo spinale adulto, potrebbero rappresentare un substrato terapeutica se reintegrato. È concepibile che il ripristino di condizioni neonatali o anche embrionali potrebbe essere attuato attraverso l'impianto di cellule meno sviluppati o tessuti o da un trattamento con reagenti che generano il tessuto adulto con caratteristiche evolutive precedenti. Usando enzimi per eliminare reti perineuronali è un esempio di quest'ultimo approccio 42,43.
<p class="Jove_content"> Un importante problema quando si stabilisce un modello animale per SCI è quello di ottenere un infortunio standardizzata. Questo è un aspetto importante che è stato affrontato in diversi modelli SCI, ad esempio, transezione, hemisection, martelli, compressione a palloncino, schiacciare pinze, la compressione peso statico, ecc Per quanto riguarda i dispositivi impatto, gli sforzi in questa direzione sono portato a modelli SCI in roditori adulti dove più parametri di impatto come la velocità, la forza e la durata possono essere manipolati (recensito da 44). Un altro approccio, coinvolgendo meno attrezzature, impiega una modifica del clip dell'aneurisma Kerr-Lougheed 45,46. Questi 2 approcci sono complementari in quanto dispositivo di simulazione imita un infortunio contusione mentre i imita clip di un infortunio alla compressione con un certo grado di ischemia concorrente. A causa dei vincoli sostanziali size e una maggiore vulnerabilità dei topi neonatali, la maggiore mortalità associata a interventi chirurgici più lunghi così come i costi di sviluppo attrezzature scala più piccola, si è scelto di sviluppare una compressione clip-generato, piuttosto che un approccio contusione d'urto generate. Ciò è stato realizzato adattando un aneurisma mini-clip disponibile in commercio per adattarsi alle dimensioni della colonna vertebrale di topi neonati 1. Aggiunta di un tappo garantisce una larghezza di compressione standard, e fintanto che la tensione del clip comprime al limite del tappo, la forza di compressione durante la fase statica alla larghezza minima dovrebbe variare poco. Ciò che non è standardizzato è la velocità di compressione durante la fase dinamica, poiché questa varia al variare della clip tensione durante la sua vita. Poiché la fase statica della compressione dura molto più lungo della fase dinamica, e c'è poco da suggerire che il tessuto del midollo spinale esercita più di una controforza contro le pale mini-etere, è probabile che la gravità delle lesioni è più dipendente fase statica. Questo, tuttavia, rimane da testare. feritagravità possa dipendere da fattori diversi, tra cui la forza statica di compressione e durata, la velocità di compressione e decompressione, la posizione del mini-clip, ed il numero di compressioni eseguite nello stesso sito. Così, la variazione combinatoria in questi parametri potrebbe causare la generazione di uno spettro di gravità lesioni da debole a grave. Nonostante il potenziale di variabilità, nel nostro studio precedentemente pubblicato 1 abbiamo ottenuto risultati coerenti a istologico, livelli fisiologici e comportamentali, quindi c'è poco da suggerire che la standardizzazione accettabile è difficile da raggiungere. Notiamo che in questo studio abbiamo utilizzato più metodi di validazione a ciascun livello, inclusi test comportamentali come aria passo, come mostrato in Figura 5.In questo modello SCI neonatale l'infortunio non risparmia una certa proporzione di assoni e, quindi, fornisce una situazione favorevole per suscitare la plasticità adattativa attraverso la ri-modeling di connessioni risparmiato e la formazione di nuovi circuiti. Inoltre, poiché il mouse neonatale è adatto per le indagini da molti metodi sperimentali, è possibile usare questo modello per studiare il recupero funzionale e la plasticità adattativa con un approccio integrato, inclusi test comportamentali, retrograda e anterograda tracing assonale, immunoistochimica, elettrofisiologia e alta registrazione ottica -throughput 1. A titolo di esempio, abbiamo approfittato di questo approccio integrativo per dimostrare la rete di ri-modellazione a livello di ingressi Discendente specifici utilizzando l'imaging di calcio ad alto rendimento in ex vivo preparati wholemount del tronco cerebrale e del midollo spinale danneggiato 1. Questo può essere spinto ulteriormente utilizzando strumenti di neuro-optogenetic e farmacologia optogenetic per valutare il rimodellamento delle connessioni sinaptiche tra sottopopolazioni specifici di neuroni spinali.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |