This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Ryggmargsskade (SCI) fører vanligvis ødeleggende nevrologiske utfall, særlig gjennom skade fibrene synkende fra hjernen til ryggmargen. En stor aktuell forskningsområde er fokusert på mekanismer for adaptive plastisitet som ligger bak spontan eller indusert funksjonell restitusjon etter SCI. Spontan funksjonelle utvinning er rapportert å være større tidlig i livet, heve interessante spørsmål om hvordan adaptive plastisitet endringer som ryggmargen utvikler seg. For å lette etterforskningen av denne dynamiske, har vi utviklet en SCI modell i neonatal mus. Modellen har relevans for pediatrisk SCI, som er for lite studert. Fordi nevrale plastisitet i den voksne involverer noen av de samme mekanismene som nevral plastisitet tidlig i livet en, kan denne modellen potensielt ha noen relevans også for voksne SCI. Her beskriver vi hele prosedyren for å generere en reproduserbar ryggmargskompresjon (SCC) skade på neonatal musså tidlig som postnatal (P) dag 1. SCC oppnås ved å utføre en laminektomi på et gitt spinal nivå (her beskrevet på thorax nivå 9-11) og deretter ved hjelp av en modifisert Yasargil aneurisme mini-klipp til raskt å komprimere og dekomprimere ryggmargen . Som tidligere beskrevet, kan den skadde neonatale mus testes for adferdsmessige mangler eller ofres for ex vivo fysiologisk analyse av synaptisk tilkobling ved hjelp av elektrofysiologiske og high-throughput optisk opptak teknikker 1. Tidligere og pågående studier ved hjelp av atferdsmessige og fysiologiske vurdering har vist en dramatisk, akutt nedsatt bakben motilitet etterfulgt av en fullstendig funksjonell bedring innen 2 uker, og det første tegn på endringer i funksjonelle kretser på nivå med identifiserte synkende synaptiske forbindelser 1.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
I denne artikkelen prosedyrene for et klipp generert SCC skader i P1 mus er beskrevet. De samme fremgangsmåter kan også utføres på senere stadier. Kompresjons skader ble utført med hell på P5, P7, P9 og P12 (Züchner, et al., Manuskript under forberedelse). På alle postnatal stadier, er generell anestesi oppnås med isofluran fordampet i ren oksygen, men bedøvelsen utfallet avhenger mye av alder. I innledende forsøk på P1-P4, før lokal anestesi ble innført i protokollen, var det vanskelig å oppnå en dyp og langvarig sedasjon på grunn av en smal dose-effekt vindu mellom utilstrekkelig sedasjon og overdose. I tillegg har bekymring i forbindelse med en neurotoksisk virkning av isofluran i nyfødte dyr blitt hevet 27-30. En kombinasjon av isofluran og de lokale bedøvende bupivakain gir en dypere og mer stabil anestesi mens den tillater en isofluran dosereduksjon med en faktor på 2-3. Ulike typer anesthesia har blitt beskrevet for neonatale gnagere, inkludert cryoanesthesia 31,32, men en potensiell ulempe av cryoanesthesia er dens nervecellene effekt (gjennomgått av 33,34), noe som kan komplisere generering av en effektiv og reproduserbar skade. Barbiturat-baserte anestesi antas å ha lavere effektivitet i neonatale mus på grunn av lavere nivåer av serum-albumin og kroppsfett enn hos voksne 35,36.
Selv om ganske invasiv og traumatisk, når prosedyren er etablert dødeligheten under operasjonen er lav. Det er imidlertid kritiske trinn i løpet av prosedyren som krever spesiell oppmerksomhet for å øke utvinningen og overlevelse av de opererte mus. En viktig sak er å velge unger som vil ha best sjanse til å overleve operasjonen. Når kullet er stort ernæringstilstanden til de enkelte valpene varierer. I tillegg til den uunngåelige blødning som forekommer under operasjonen, som drives pups bruke times bort fra moren, og de ofte ikke drikker melk før neste morgen. Det er således en fordel å velge unger som allerede har en viss mengde melk i magen. Dette er lett synlig gjennom abdominal hud fra P0 til P7.
Under den første natten operert valpen er i stor fare for å bli cannibalized av moren. Under første utviklingen av denne modellen mer enn halvparten av de opererte mus manglet i formiddag, med klare tegn til blod i buret. Necrophagy, kannibalisme og barnedrap i gnagere har blitt studert i flere tiår 37-40. I denne studien kannibalisme ble bare sett en gang, men ble ansett som en mer sannsynlig forklaring enn necrophagy fordi valpene som ble returnert til buret var typisk i så god form som døde av naturlige årsaker i løpet av natten virket usannsynlig. Dette fikk ideen om å bruke en reversibel farmakologisk middel som Diazepam å redusere angst og aggressivitet in mor (anmeldt av 41). Intraperitoneal injeksjon av Diazepam sterkt forbedret situasjonen, slippe dødelighet i løpet av den første natten fra mer enn 60% til mindre enn 20%.
Redusere kullstørrelse ved culling og forstyrre kullet så lite som mulig etter postoperativ avkastning er flere elementer som kan dra de opererte dyr. Men, slik at bare drives valper med moren er ikke gunstig. Den beste balansen mellom opererte / unoperated valper kan variere i henhold til linjen, men for ICR og SCID-ICR mus forlater 4-5 opererte unger (skader eller simulert) sammen med 3-4 unoperated unger ga de beste resultatene.
I en generell betydning, er den viktigste begrensning av denne neonatale SCI modellen er at den neonatale ryggmarg skiller seg på mange måter fra den voksen ryggmarg, og kan således ikke gi eksperimentelle resultater som er sammenlignbare med dem som ble oppnådd fra voksne SCI modeller. Slike forskjeller inkluderer totale størrelse ogvolum av ryggmargen, celle nummer, underrepresentasjon av spesifikke celletyper som for eksempel oligodendrocytter, umoden immunresponser og umodne nevrale kretser. Konklusjonene fra forsøkene i denne modellen må derfor vurderes nøye. På den annen side, er modellen relevant for den relativt mindre undersøkt scenario for pediatrisk SCI. Videre er tydelig svakhet i forhold til voksne SCI modeller er også en potensiell styrke som det kan gi klarlegging av plastisitet mekanismer som, selv om minimal bevart i den voksne ryggmargen, kan representere en terapeutisk underlaget hvis gjeninnsatt. Det kan tenkes at gjeninnføringen av nyfødte eller embryonale vilkår blir implementert gjennom implantering av mindre utviklede celler eller vev eller ved behandling med reagenser som skape den voksne vev med tidligere utviklingstrekk. Ved hjelp av enzymer for å eliminere perineuronal garn er et eksempel på sistnevnte tilnærming 42,43.
<p class="Jove_content"> Et stort problem ved etablering av en dyremodell for SCI er å oppnå en standardisert skade. Dette er et viktig aspekt som har vært behandlet i flere SCI modeller, for eksempel tran, hemisection, impactors, ballong komprimering, tang knuse, statisk vekt komprimering, etc. Med hensyn til å påvirke enheter innsats i denne retningen har resultert i SCI modeller voksen gnagere der flere parametre av virkningen som hastighet, styrke og varighet kan manipuleres (gjennomgått av 44). En annen tilnærming, som involverer mindre utstyr, benytter en modifikasjon av Kerr-Lougheed aneurisme klippet 45,46. Disse 2 tilnærminger er komplementære som anslagsligner en kontusjon skade mens klippet etterligner en kompresjonsskade med en viss grad av samtidige iskemi. På grunn av de betydelige størrelse begrensninger og større sårbarhet for neonatale mus, jo høyere dødelighet assosiert med lengre operasjoner samt kostnader til utvikoping mindre skala utstyr, ble det valgt å utvikle et klipp generert kompresjon i stedet for en anslagsgenerert kontusjon tilnærming. Dette ble oppnådd ved å tilpasse et kommersielt tilgjengelig aneurisme mini-klips for å tilpasse størrelsen på virvelsøylen av neonatale mus 1. Tilsetning av en propp sikrer en standardisert kompresjon bredde, og så lenge som spenningen på klemmen komprimerer til grensen av stopperen, må kraften av kompresjons under statiske fasen ved minimal bredde varierer lite. Det som ikke er standardisert er hastigheten av kompresjons under dets dynamiske fase, siden dette vil variere ettersom klips spenningsendringer i løpet av levetiden. Som den statiske fasen av komprimering varer mye lenger enn den dynamiske fase, og det er lite som tyder på at ryggmargen vev utøver mye av en motkraft mot mini-klipp bladene, er det sannsynlig at alvorlighetsgraden av skaden er mest avhengig av den statiske fase. Dette er imidlertid gjenstår å bli testet. SkadeAlvorlighetsgraden vil sannsynligvis avhenge av flere faktorer, innbefattet den statiske kompresjonskraft og varighet, hastigheten av kompresjon og dekompresjon, posisjonen til den mini klippet, og antall kompresjoner som utføres på samme sted. Således kunne kombinatorisk variasjon i disse parametre resultere i generering av et spektrum av skadegradene fra svak til alvorlig. Til tross for potensialet for variasjon, i vår tidligere publisert studie en vi fått konsistente resultater på histologisk, fysiologiske og atferdsmessige nivåer, så det er lite som tyder på at akseptabelt standardisering er vanskelig å oppnå. Vi merker oss at i den undersøkelsen vi brukte flere metoder for validering på hvert nivå, blant annet atferdstester som air-stepping, som vist i figur 5.I denne neonatale SCI modellen skaden deler en viss andel av aksoner og derved tilveiebringer en situasjon gunstig for utløsning adaptiv plastisitet gjennom re-modeling spart tilkoblinger og dannelse av nye kretser. Dessuten, siden den neonatale mus er godt egnet for undersøkelse av mange eksperimentelle metoder, er det mulig å anvende denne modell for å studere funksjonell bedring og adaptiv plastisitet med en integrerende tilnærming med adferdstester, retrograd og antero aksonal tracing, immunhistokjemi, elektrofysiologi og høy -throughput optisk innspilling 1. Som et eksempel, tok vi nytte av denne integrerende tilnærming til å demonstrere nettverk re-modellering på nivået av spesifikke synkende innganger med høy gjennomstrømming kalsium bildebehandling i ex vivo wholemount preparater av hjernestammen og skadet ryggmarg en. Dette kan skyves ytterligere ved hjelp av nevro optogenetic og optogenetic farmakologi verktøy for å vurdere ombygging av synaptiske forbindelser mellom spesifikke subpopulasjoner av spinal nevroner.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |