This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Ryggmärgsskada (SCI) orsakar vanligtvis förödande neurologiska underskott, i synnerhet genom skador på fibrer som härstammar från hjärnan till ryggmärgen. En stor aktuell forskningsområde är inriktat på mekanismer för adaptiv plasticitet som ligger till grund för spontan eller inducerad funktionell återhämtning efter SCI. Spontan funktionell återhämtning rapporteras vara större tidigt i livet, lyfta intressanta frågor om hur adaptiv plasticitet förändringar som ryggmärgen utvecklas. För att underlätta utredningen av denna dynamiska, har vi utvecklat en SCI modell i den neonatala musen. Modellen har relevans för pediatrisk SCI, som är alltför lite studeras. Eftersom neural plasticitet i den vuxna innebär några av samma mekanismer som neural plasticitet i början av livet en, kan denna modell potentiellt ha en viss relevans även för vuxna SCI. Här beskriver vi hela förfarandet för att generera en reproducerbar ryggmärgskompression (SCC) skada i neonatal musså tidigt som postnatal (P) dag 1. SCC uppnås genom att utföra en laminektomi vid en given spinal nivå (här beskrivs i bröstkorg nivåer 9-11) och sedan använda en modifierad Yasargil aneurysm mini-klämma för att snabbt komprimera och dekomprimera ryggmärgen . Som tidigare beskrivits, kan den skadade neonatala möss testas för beteendestörningar eller offras för ex vivo fysiologiska analys av synaptiska anslutningar med hjälp av elektrofysiologiska och hög kapacitet optisk inspelningstekniker 1. Tidigare och pågående studier med beteendemässiga och fysiologiska bedömning har visat en dramatisk, akut försämring av bakdelen rörlighet följt av en fullständig funktionell återhämtning inom 2 veckor, och det första beviset på förändringar i funktionell kretsar på samma nivå som identifierade fallande synapsförbindelser 1.
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
I den här artikeln förfarandena för ett klipp genererat SCC skada i P1 möss beskrivs. Samma förfaranden kan även utföras i senare skeden. Kompressionsskador utfördes framgångsrikt på P5, P7, P9 och P12 (Züchner, et al., Manuskript under utarbetande). Vid alla efter födseln, är narkos uppnås med isofluran förångas i rent syre, men anestesi utfallet beror i hög grad på ålder. I första försök till P1-P4, innan lokalbedövning infördes i protokollet, var det svårt att få en djup och långvarig sedering på grund av en smal dos-effekt fönster mellan otillräcklig sedering och överdosering. Dessutom har oro i samband med en neurotoxiska effekten av isofluran hos nyfödda djur höjts 27-30. En kombination av isofluran och lokalbedövningsmedlet bupivakain resulterar i en djupare och mer stabil anestesi samtidigt tillåter en isofluran dosreduktion med en faktor av 2-3. Olika typer av anestesisia har beskrivits för nyfödda gnagare, inklusive cryoanesthesia 31,32, men en potentiell olägenhet av cryoanesthesia är dess neuroprotektiva effekt (granskas av 33,34), vilket kan försvåra bildandet av en effektiv och reproducerbar skada. Barbiturat-baserade anestesi anses ha lägre effektivitet i neonatala möss på grund av lägre nivåer av serum albumin och kroppsfett än hos vuxna 35,36.
Även om ganska invasiv och traumatiska, är låg när förfarandet är etablerad dödligheten under operation. Men det finns kritiska steg under förfarandet som kräver särskild uppmärksamhet för att förbättra återvinningen och överlevnad av de drivs möss. En viktig fråga är att välja valpar som kommer att ha störst chans att överleva operationen. När kullen är stor näringstillstånd för de enskilda valpar varierar. Förutom den oundvikliga blödning som uppstår under operation, som drivs pups bringar timmeär borta från modern, och de ofta inte dricker mjölk innan nästa morgon. Det är således en fördel att välja valpar som redan har en viss mängd mjölk i magen. Detta är väl synlig genom bukhuden från P0 till P7.
Under den första natten drivs valp är stor risk att bli cannibalized av mamman. Under den initiala utvecklingen av denna modell mer än hälften av det opererade möss saknade följande morgon, med tydliga tecken på blod i buren. Necrophagy, kannibalism och barnamord i gnagare har studerats under decennier 37-40. I denna studie var kannibalism bara sett en gång, men ansågs vara en mer trolig förklaring än necrophagy eftersom valparna som återvände till buren var typiskt i så god form att döden av naturliga orsaker under natten verkade osannolikt. Detta föranledde idén att använda en reversibel farmakologiskt medel såsom diazepam att minska ångest och aggressivitet in mamman (översikt av 41). Intraperitoneal injektion av Diazepam avsevärt förbättrat situationen, släppa dödligheten under den första natten från mer än 60% till mindre än 20%.
Minska kullstorleken genom utgallring och störa kullen så lite som möjligt efter postoperativ avkastning är ytterligare faktorer som kan gynna drivs djuren. Men vilket innebär att endast drivs valpar med mamman är inte bra. Den bästa balansen mellan drivs / oanvänd valpar kan variera beroende på linjen, men för ICR och SCID-ICR-möss lämnar 4-5 drivs valpar (skada eller sken) tillsammans med 3-4 oanvänd valpar gav de bästa resultaten.
I en allmän mening, är den främsta begränsningen av denna neonatal SCI modell som neonatal ryggmärgen skiljer sig i många avseenden från den vuxna ryggmärgen, och kan således inte tillhandahålla experimentella resultat som är jämförbara med de som erhölls från vuxna SCI modeller. Sådana skillnader inkluderar totala storlek ochvolym av ryggmärgen, mobilnummer, underrepresentation av specifika celltyper såsom oligodendrocyter, omogna immunsvar och omogna neuronala kretsar. De slutsatser som dras från försök i denna modell måste därför övervägas noga. Å andra sidan, är den modell som är relevant för den relativt mindre undersökta scenariot med pediatrisk SCI. Dessutom är den skenbara svaghet när det gäller vuxna SCI modeller också en potentiell styrka eftersom det kan tillåta att klarlägga plasticitet mekanismer som, trots minimalt bevarade i den vuxna ryggmärgen, skulle kunna utgöra en terapeutisk substratet om återinföras. Det är tänkbart att återställande av neonatala eller embryonala tillstånd kan genomföras genom implantation av mindre utvecklade celler eller vävnad eller genom behandling med reagens som alstrar den vuxen vävnad med tidigare egenskaper utvecklings. Användning av enzymer för att eliminera perineuronal nät är ett exempel på det senare tillvägagångssättet 42,43.
<p class="Jove_content"> En viktig fråga när man fastställer en djurmodell för SCI är att få en standardiserad skada. Detta är en viktig aspekt som har tagits upp i flera SCI modeller, till exempel tran, hemisection, slag, ballong kompression, pincett krossa, statisk vikt kompression, etc. När det gäller att påverka enheter insatser i denna riktning har lett till SCI modeller vuxna gnagare där flera parametrar av påverkan såsom hastighet, kraft och längd kan manipuleras (granskas av 44). En annan metod, som innebär mindre utrustning, använder en modifiering av Kerr-Lougheed aneurysm klämma 45,46. Dessa 2 metoder kompletterar som kroppen härmar en kontusion skada medan klipp härmar en kompressionsskada med en viss grad av samtidig ischemi. På grund av de betydande begränsningar storlek och ökad sårbarhet neonatala möss, desto högre dödlighet i samband med längre operationer samt kostnaderna för developing mindre skala utrustning, var det valt att utveckla ett klipp genererad kompression snarare än en kroppen genererade blåmärken strategi. Detta åstadkoms genom att anpassa en kommersiellt tillgänglig aneurysm mini-klämma för att rymma storleken på ryggraden av neonatala möss en. Lägga till en propp säkerställer en standardiserad komprimerings bredd, och så länge som spänningen på klämman komprimerar till gränsen av proppen, bör kraften av kompression under den statiska fasen på minimal bredd variera lite. Vad är inte standardiserad är hastigheten av kompressionen under dess dynamiska fasen, eftersom detta kommer att variera när klipp spänningsförändringar över dess livstid. Som den statiska fasen av kompressions varar mycket längre än den dynamiska fasen, och det finns mycket som tyder på att den ryggmärg utövar mycket av en motkraft mot mini-klipp blad, är det troligt att graden av skada är mest beroende av den statiska fasen. Detta är dock återstår att testas. Skadasvårighetsgraden är sannolikt att bero på flera faktorer, bland annat den statiska tryckkraften och varaktighet, hastighet komprimering och dekomprimering, placeringen av mini-klippet och antalet kompressioner som utförs på samma plats. Sålunda kunde kombinato variation i dessa parametrar resulterar i generering av ett spektrum av skadesvårighetsgrader från svag till svår. Trots risken för variabilitet i vår tidigare publicerad studie 1 vi fått konsekventa resultat på histologiska, fysiologiska och beteendemässiga nivåer, så det finns mycket som tyder på att godtagbar standardisering är svårt att uppnå. Vi noterar att vi i denna studie använde flera metoder för validering på varje nivå, inklusive beteendetester såsom luft stepping som visas i Figur 5.I denna neonatal SCI modell skadan reservdelar en viss andel av axoner och därmed ger en situation gynnsamt för att framkalla adaptiva plasticitet genom åter modeling skonas anslutningar och bildandet av nya kretsar. Eftersom den neonatala musen är väl lämpad för undersökning av många experimentella metoder är det möjligt att använda denna modell för att studera funktionell återhämtning och adaptiv plasticitet med en integrerad strategi, inklusive beteendetester, bakåtsträvande och antero axonal spårning, immunohistokemi, elektrofysiologi och hög -throughput optisk registrering 1. Som ett exempel, vi drog fördel av denna integrerad strategi för att visa nätverks omformning i nivå med särskilda fallande ingångar med hög genomströmning kalcium avbildning i ex vivo wholemount förberedelser i hjärnstammen och skadade ryggmärgen 1. Detta kan skjutas ytterligare genom att använda neuro optogenetic och optogenetic farmakologiska verktyg för att bedöma den ombyggnad av synaptiska kopplingar mellan specifika subpopulationer av spinal nervceller.
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |