Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من جامعة فرجينيا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام.
ملاحظة: يبين الشكل 1 عرضا عاما للإجراءات التجريبية.
1. إعداد البويضات
- X. قبل رئيس المورق الإناث مع 150 U من الحوامل ماري المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) أسبوع واحد تقريبا في وقت مبكر من بويضة والعزلة. حقن 1 مل 150 U / مل PMSG في ظهري الليمفاوية الكيس مع 1 سم مكعب محقنة معقمة مع 29 G الإبرة.
- إعداد الحلول لحقن البويضة والبويضة والحيوان قبعة الفحص.
- إعداد كا ++ / مغ ++ خالية OR2 (OR2-): 82 مم كلوريد الصوديوم، و 2.5 ملي بوكل، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 و 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.2.
- إعداد OR2: OR2- زائد 1 ملم CaCl 2 و 1 ملي MgCl 2.
- إعداد OCM: 60٪ يبوفيتش L15، 0.4 ملغ / مل BSA، 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، ودرجة الحموضة 7.8.
- قبلحلج 1X MBS: 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 0.7 ملي CaCl 2، 1 ملي MgSO 4، 5 ملي HEPES (درجة الحموضة 7.8)، و 2.5 ملي NaHCO 3.
- إعداد 3٪ Ficoll في 1X MBS.
- إعداد 1X حركة عدم الانحياز: 110 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملي كا (NO 3) 2، 1 ملي MgSO 4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم NaHCO 3، 2 ملي نا 3 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4.
- تخدير الأنثى في حل 0،03٪ من إيثيل الملح methanesulfonate 3-أمينوبنزوات (MS222) في 0.1X MBS (أولا حل 0.3 غرام MS222 في 10 مل 95٪ من الإيثانول، ثم تمييع في 1 L 0.1X MBS) عن طريق وضع الضفدع في حل ل 10-15 دقيقة أو حتى لا تستجيب.
- تأكد من أن التخدير اكتمال التي تحول الضفدع تخدير على ظهرها للتأكد من أنه لا يستجيب (غير كامل الضفادع تخدير تتحرك أطرافه أو تحويل الجسم أكثر من ذلك).
- عزل جراحيا شظايا المبيض عن طريق شق البطن خلال الجلد وجدار الجسم مع شفرة مشرط، عزل أنسجة المبيض مع ملقطوالمقص. وضع شظايا المبيض إلى OR2-. إغلاق جدار الجسم مع خياطة 3-0 الحرير على 24 ملم إبرة مقوسة وإغلاق الجلد بشكل منفصل مع نفس الغرز. السماح باستعادة الإناث في 1 غرام / لتر ماء الملح في الماء.
- باستخدام ملقط غرامة، أنسجة المبيض المسيل للدموع إلى أقسام صغيرة (10-20 البويضات) قطع ونقل إلى OR2- الطازجة.
- شظايا المبيض Defolliculate في 2.0 ملغ / مل كولاجيناز A في OR2- من خلال استثارة بلطف على شاكر لمدة 1 ساعة، ونقل إلى كولاجيناز الطازجة والتحريض على ساعة إضافية واحدة.
- غسل البويضات 10 مرات في OR2 [التي تحتوي على الكالسيوم ++ / مغ ++]، ونبذ البويضات أصغر.
- غسل البويضات في OCM مرتين ونقل إلى OCM الطازجة. عزل البويضات المرحلة السادسة من حيث الحجم على الفحص البصري وتجاهل غير ناضجة (أصغر) البويضات: البويضات المرحلة السادسة هي أكبر من البويضات غير الناضجة حتى مع تصبغ في نصف الكرة الحيوانية وما يقرب من 1،2-1،4 مم في القطر.
- الحفاظ على البويضات في 18-20 ° C طن OCM قبل الحقن. ملاحظة: يمكن استخدام أطباق بتري الاغاروز المغلفة لتقليل التصاق البويضات إلى طبق.
2. حقن مكتبة النصوص
- إعداد مكتبة [كدنا اتجاهي 15 باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج في مرحلة مناسبة للتنمية (على سبيل المثال، لوحة العصبية المرحلة 14 10). شراء مكتبة كدنا] أو إنشاء واحد باستخدام مجموعة تجارية في نظرة عامة في الخطوات الأربع التالية.
- عزل ما يقرب من 5 ميكروغرام مرنا باستخدام منتج لإثراء للبولي (A) + RNA (انظر الجدول المواد) وبعد تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: النصوص المستخدمة في إنتاج مكتبة [كدنا يجوز تقييد إلى الأنسجة حمل (مثل لوحة العصبية، بعد تسليخ مجهري من النسيج المطلوب)، أو قد تكون من أجنة كاملة في مرحلة معينة.
- إنتاج كدنا] مع مجموعة تجارية، في أعقاب توجيهات المصنع.
- Ligate ما يقرب من 20 نانوغرام [كدنا إلى vectoص تضمينها مع مجموعة تجارية أو ناقلات أخرى مناسبة. يتضمن ناقلات البلازميد المناسب تسلسل للاستقرار مرنا مثل 5 "β-غلوبين و 3 بولي (A) تسلسل (pCS2 +، pTnT، pCS105).
- تحويل ربط إلى الخلايا البكتيرية المختصة باستخدام بروتوكول المورد الموصى بها للتحول الصدمة الحرارية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، مجموعة من إطار القراءة المفتوح (ORFeome) استنساخ متاح تجاريا، ويمكن استخدامه لتوليد النصوص للحقن.
- إعداد 10 برك من البلازميدات من 10 مارس - 10 أبريل التعقيد (10 أبريل - 10 مايو الكلي التعقيد). وهذا يمثل 10 مع لوحات 1000 - 10000 المستعمرات لكل منهما.
- مكتبة وحة الثقافة على 10 لوحات 15 سم LB-الأمبيسلين، وتنمو 12-18 ساعة عند 37 ج، وجمع المستعمرات من كل بواسطة ضغط لطيف مع رش الزجاج في 7 مل LB.
- إعداد المخزون الجلسرين من 0.5 مل (إضافة إلى 0.2 مل الجلسرين العقيمة وتخزينها في -20 &# 730؛ C)، واستخدم مل 6.5 المتبقية لإعداد DNA مع المعايير المتاحة تجاريا عدة DNA miniprep التالية توجيهات المصنع.
- خطي DNA البلازميد المجمعة (1،0-2،0 ميكروغرام) مع تقييد انزيم الهضم المناسب 16 في 37 مئوية لمدة 1-1،5 ساعة. عزل DNA خطي مع استخراج الفينول / كلوروفورم تليها هطول الأمطار الإيثانول وإعادة تعليق في الماء فقا لمواصفات عدة RNA البلمرة المستخدمة. توليف الشعور RNA مع مجموعة RNA البلمرة التجارية التالية توجيهات المصنع.
- تعد الإبر ل microinjection (باستخدام إبرة مجتذب مع أنابيب الزجاج الشعرية) ما يقرب من 20 ميكرون قطر. قياس نصائح إبرة في المجهر المركب مع ميكرومتر بصري معايرة. ملاحظة: يجب أن تكون إعدادات مجتذب إبرة العزم تجريبيا لإنتاج إبرة مع طرف ما يرام بحيث عندما كسر مع ملقط غرامة تعطي حجم غيض المطلوب.
- استعد (دفع الطين إلىطبقة موحدة على الجزء السفلي من طبق) 35 × 10 مم أطباق بتري مع الأخاديد موازية لعقد البويضات في المكان خلال microinjection مبطنة الطين. إنتاج الأخاديد مع لجنة التحقيق مول أو ماصة باستير تنصهر في الطرف في اللهب. كبديل للطين، وإعداد أطباق الاغاروز مما يجعل المسافات البادئة مع قالب المطاط الصناعي 17. نقل البويضات مع ماصة واسعة الجوف إلى 3٪ Ficoll في 1X MBS (حوالي 2 مل) في الصفوف في أطباق مبطنة الطين.
- باستخدام microinjector، وملء إبرة مع 1 نانوغرام / RNA نيكولا لانغ وضبط التوازن لإنتاج ضغط إيجابي طفيف (لمنع وضع بويضة من السيتوبلازم).
- حقن البويضات مع ما يقرب من 20 RNA نيكولا لانغ في المنطقة الاستوائية. السماح 1 ساعة لحقن البويضات للبقاء في Ficoll MBS-ثم نقل بلطف ل1X MBS. احتضان لمدة 8-24 ساعة عند 20 درجة مئوية قبل الغطاء الحيواني الفحص.
3. الحيوان كاب الفحص
- إعداد 3 / 4X حركة عدم الانحياز والحصول على ملقط غرامة، حلقة الشعر، شظايا ساترة المنحنية، ديس مبطنة الطين[هس مع المسافات البادئة على شكل كوب لعقد البويضات. جعل شظايا ساترة المنحنية التي تفكك coverslips الزجاج إلى أجزاء صغيرة (حوالي 1-2 مم × 2-4 ملم) ومرورا اللهب حتى حواف البولندية وتدلى، وتنتج قطعة المنحني.
- تسميد X. المورق البيض 18 في المختبر من خلال التزاوج أو الطبيعي والثقافة لالمعيدة مراحل (10-11 ساعة بعد الإخصاب في RT) في 0.1X MBS قبل الفرز حسب المرحلة؛ جمع منتصف المعيدة (المرحلة 11-11،5) 10 الأجنة.
- ونقل الأجنة إلى طبق بتري ما يقرب من نصف كامل مع 3 / 4X حركة عدم الانحياز. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، وإزالة الإخصاب (المحي) غشاء من gastrulae.
- نقل البويضات إلى 3 / 4X NAM (حوالي 2 مل) في أطباق مبطنة الطين وشل في عدد مرات الظهور الفردية في الطين، وإنتاج الانطباعات لاستيعاب الأجنة الفردية كما وصفت الأخاديد أعلاه.
- ونقل الأجنة إلى أطباق مبطنة الطين وقطع القبعات الحيوان ز قبالةastrulae باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة. احرص على عزل سقف الأديم الظاهر الحيوانية فقط وليس الأنسجة الاستوائية 18.
- وضع الغطاء الحيواني في نصف الكرة الحيوانات من كل بويضة مع السطح الداخلي للغطاء الحيوان الاتصال البويضة. عقد recombinants معا من خلال تطبيق الزجاج المنحني ساترة جزء والضغط النزولي على الزجاج، تسطيح الأديم الظاهر مثل الاتصالات ساترة الطين (القبعات الحيوان يمكن أن تظل مفتوحة مع الطبقة الداخلية تتعرض لسطح البويضة ل6-8 ساعة أو أكثر ).
ملاحظة: بدلا من ذلك، ضع الغطاء الحيواني الى تسنن الطين مع سطحه الداخلي التي تواجه صعودا ووضع البويضة على الغطاء. تأمين المؤتلف مع ملحقات صغيرة من الطين. - الثقافة عند 20 درجة مئوية حتى الأجنة السيطرة تصل إلى المستوى المطلوب للمرحلة الفحص.
- المؤتلف منفصل عن طريق إزالة ساترة / الطين وعزل الأديم الظاهر مع ملقط وحلقة الشعر.
- إصلاح شظايا الأدمة لمدة 1 ساعة في MEMFA (3.8٪الفورمالديهايد في MEM [0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.4، 2 مم EGTA، و 1 ملي MgSO 4]).
- شظايا نقل (والأجنة السيطرة) من MEMFA إلى إيثانول وتخزينها في -20 مئوية.
4. تحليل الاستجابة في الأدمة من قبل في الموقع التهجين (ISH)
- إعداد الحلول لISH.
- إعداد برنامج تلفزيوني 1X: 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة، كلوريد الصوديوم 0.138 M، ودرجة الحموضة 7.4
- إعداد برنامج تلفزيوني توين (PTW) ما يلي: 1X PBS، 0.1٪ توين-20
- يعد حل 100X Denhart في: 2٪ BSA، 2٪ بوفيدون، 2٪ Ficoll
- إعداد التهجين العازلة: 50٪ الفورماميد، 5X SSC، 1 ملغ / مل بالمستخفيات الخميرة RNA، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين، والحل 1X Denhart، وبنسبة 0.1٪ 0.1٪ CHAPS، 10 ملي EDTA توين-20، DEPC-H 2 O
- إعداد حمض المالئيك العازلة (MAB): 100 ملم حمض الماليك، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5
- إعداد MAB + كتلة: MAB، 2٪ عرقلة كاشف (الحرارة إلى 60 مئوية إلى حل)
- إعداد الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) العازلة: 100 ملي تريسدرجة الحموضة 9.5، 50 ملي MgCl 2، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين، درهم 2 O
- إعداد RNA التحقيق.
- استخدام عدة RNA البلمرة التجارية وحفر-NTP المزيج، إضافة إلى أنبوب 1.5 مل (50 ميكرولتر رد فعل): 25.5 ميكرولتر DEPC-H 2 O، 10 ميكرولتر 5X النسخ الاحتياطي، 2.5 ميكرولتر 10X حفر-NTP المزيج، 5 ميكرولتر 100 ملي DTT، 2 ميكرولتر RNAsin، 2 ميكرولتر قالب DNA خطي (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 3 ميكرولتر RNA البلمرة واحتضان 37 مئوية لمدة 90 دقيقة.
- إضافة 2 ميكرولتر RNA البلمرة واحتضان 37 مئوية لمدة 60 دقيقة.
- تحقق 2 ميكرولتر من رد فعل على 1٪ agarose هلام.
- إضافة 1 ميكرولتر RQ1-ريبونوكلياز مجانا الدناز واحتضان 37 مئوية لمدة 20 دقيقة.
- يعجل التحقيق بإضافة 50 ميكرولتر DEPC-H 2 O، 25 ميكرولتر 10 M الأمونيوم خلات و 313 ميكرولتر الايثانول. مخزن في -20 مئوية خلال الليل (يا / N) ثم استعادة RNA بواسطة الطرد المركزي في 13800 x ج لمدة 20 دقيقة. يغسل مع 500 ميكرولتر الايثانول 75٪، وتدور لفترة وجيزة، وإزالةالإيثانول والسماح بيليه الهواء الجاف. إضافة 50 ميكرولتر DEPC-H 2 O.
- إضافة التهجين العازلة للتركيز النهائي من ~ 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
- إعداد الأنسجة لالتهجين. ما لم يذكر خلاف ذلك، وملء قارورة إلى الأعلى مع كل تغيير الحل هو موضح (حوالي 4 مل).
- إزالة الإيثانول من قوارير ونقل الأجنة إلى 75٪ من الإيثانول / PTW، ثم 50٪ من الإيثانول / PTW لمدة 10 دقيقة لكل منهما، أفقيا على الروك.
- يغسل ثلاث مرات في PTW لمدة 5 دقائق كل يوم الروك.
- نقل إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر بروتين K العلاج في PTW. أنابيب الصخور عموديا 15 دقيقة.
- شطف مرتين كل 10 دقيقة في 0.1 M ترايثولامين درجة الحموضة 7.8 - أنابيب الصخور عموديا.
- إضافة 12.5 ميكرولتر أنهيدريد الخل إلى أنابيب والصخور عموديا 5 دقائق. كرر مع إضافي 12.5 ميكرولتر أنهيدريد الخل لمدة 5 دقائق.
- يغسل في PTW 5 دقائق عموديا على الروك.
- Refix في 4٪ امتصاص العرق 20 دقيقة على الروك. الحرارة التهجين العازلةإلى 60 مئوية.
- يغسل ثلاث مرات في PTW لمدة 5 دقائق كل يوم الروك.
- إزالة كافة ولكن ~ 1 مل من PTW من كل أنبوب وإضافة 250 ميكرولتر HYB العازلة. دوامة بلطف أنابيب لخلط. أنابيب الصخور عموديا 5 دقائق.
- استبدال 60 ج HYB العازلة (0.5 مل)، وتستنهض الهمم بلطف في 60 ج 10 دقيقة. استبدال الطازجة HYB العازلة وتستنهض الهمم في 60 ج سنتين إلى 4 ساعات.
- مسبار الحرارة (1 مل عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في HYB الواق) إلى 60 ج (3 دقائق). إزالة HYB العازلة وإضافة التحقيق لأنابيب. تستنهض الهمم بلطف O / N عند 60 مئوية.
- إعداد الأنسجة لجسم.
- دافئ HYB العازلة و2X SSC + 0.1٪ توين-20 حلول ل60 مئوية.
- استبدال حل التحقيق مع HYB العازلة (حفظ تحقيقات في -20 مئوية لمدة 2 - 3X إعادة الاستخدام). يغسل في 60 مئوية لمدة 10 دقيقة.
- يغسل ثلاث مرات في 60 مئوية في 2X SSC-توين (20 دقيقة لكل منهما مع الإثارة).
- يغسل ثلاث مرات في 60 مئوية في 0.2x SSC-توين (20 دقيقة لكل منهما مع الإثارة).
- يغسل مرتين في MAB (RT) لمدة 15 دقيقة لكل منهما أفقيا على الروك.
- إضافة 1 مل MAB + كتلة. غسل 2 ساعة عموديا على الروك.
- نقل إلى 1 مل MAB + كتلة تحتوي على 1/2000 لمكافحة digoxygenin-AP. صخرة عموديا في 4 CO / N.
- إعداد الأنسجة لاللون الكاشف.
- استبدال حل الأجسام المضادة مع MAB؛ يغسل ثلاث مرات في MAB 5 دقائق كل أفقيا على الروك.
- يغسل ثلاث مرات في MAB 1 ساعة كل أفقيا على الروك.
- يغسل مرتين في AP العازلة 10 دقيقة كل أفقيا على الروك.
- نقل الأنسجة لعدة جيدا علبة من البلاستيك، وإزالة AP العازلة وإضافة BM كاشف الأرجواني (~ 1 مل). السماح رد فعل على المضي قدما في الظلام 5 دقائق لO / N.
- عندما يتحقق تلطيخ المناسب، ونقل الأنسجة إلى قارورة من PTW. غسل مرتين كل 10 دقيقة في PTW على الروك.
- إصلاح في حل بوان في 4 CO / N على الروك.
- تغسل في بوين مع ثلاثة الايثانول 70٪ / 30٪ PTW يغسل في RT. المضي قدما رس التقاط الصور باستخدام برنامج التحصين الموسع في الإضاءة والكاميرا محمولة على المجهر، وتبيض إذا لزم الأمر 18.
5. السيب اختيار والاستنساخ
- حدد التجمع مع أعلى نشاط (أعظم استجابة في أنسجة الأدمة).
- عاير (تمييع مع LB الكثافة المناسبة) الأسهم الجلسرين لتجمع وفقا لأعلى نشاط ولوحة من لوحات عشر الجديدة مع ما يقرب من واحد على عشرة المستعمرات من الخطوة السابقة (باستخدام الجزء 2 في بروتوكول أعلاه).
- تقليل حجم تجمع حتى يتم تتبع النشاط إلى مستعمرة واحدة.
- الحصول على تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات القياسية في ناقلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ردا على التعبير مرنا حقنها في البويضات، والاستجابة الأنسجة الغطاء الحيواني ويعاير للتعبير عن otx2 بواسطة التهجين الموضعي (الشكل 2 والجدول 1) في؛ وأعرب otx2 في الأديم الظاهر عدسة الظني (PLE) من العصبية إغلاق الأنبوب من خلال عدسة اللوحاء سماكة 19. ومع ذلك، منذ يتم التعبير عن otx2 أيضا في الأديم الظاهر العصبي الأمامي وكذلك غير العصبي رئيس الأديم الظاهر خارج PLE، ويرتبط ذلك مع كل من العصبية واستجابات placodal. استخدام foxe3 إلى الشاشة المكتبة لمنتج الجين قادر على إنتاج استجابة عدسة الاستقرائي في عدسة المختصة الغطاء الحيواني الأديم الظاهر يسمح نهج أكثر تحديدا للهدف الاستنساخ التعبير، حيث يتم التعبير عن foxe3 في PLE من لوحة العصبية مراحل وطوال عدسة تشكيل حويصلة 20، موجودة في المناطق المجاورة placodal لكن غائبة عن neuroectoder م. باستخدام التعبير الاستنساخ وبروتوكول اختيار السيب أعلاه وحقن برك من النصوص مكتبة والجينات قادرة على إنتاج التعبير foxe3 في القبعات الحيوان تم عزل (الجدول 2). بعد عزل استنساخ، تم فحص 179 إضافية المقايسات الغطاء الحيواني باستخدام البويضات حقن مع النصوص مكتبة للتعبير عن foxe3. 50 كان إيجابيا (28٪). 140 قطعة الغطاء الحيواني وضعت على البويضات uninjected، 0 كانت إيجابية (الشكل 3).
الشكل 1. البويضة والحيوان كاب الفحص والتعبير الاستنساخ نظرة تخطيطية للبروتوكول: يتم إعداد محاضر من مكتبة استنساخ وحقنها في البويضات، وكأب الحيوان الأديم الظاهر هو مثقف مع البويضات ومن ثم يعاير لالناجم عن التعبير الجيني بواسطة التهجين في الموقع. د / 53518 / 53518fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نتائج نموذجية من كاب الحيوان الفحص التالية حقن مرنا والتهجين الموقع لOtx2 في (AB) نتيجة التمثيلية للاستجابة الاستقرائي لdorsalized المرحلة 14 بولي (A) + RNA في مباراة دولية الحيوان، يعاير لotx2 التعبير جبل بأكمله في الموقع تهجين. (A) القبعات الحيوان وضعت على البويضات uninjected في مرحلة 10.5 ومثقف لمرحلة 25. (B) المرحلة 10.5 القبعات الحيوان وضعت على البويضات حقن مع 10 نانوغرام RNA ومثقف لمرحلة 25. otx2 لاحظ التعبير في 6/7 الحالات، وأشار من قبل النصال. بار = 500 ميكرون. "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. نتائج نموذجية من كاب الحيوان الفحص التالية التهجين الموقع لFoxe3 في (AC) القبعات الحيوان التمثيلية من المقايسات سقف البويضة والحيوان، واختبارها للتعبير عن foxe3 بواسطة التهجين في الموقع. يشار إلى (A) المرحلة 11-11،5 القبعات الحيوان وضعت على البويضات حقن ldb1 ومثقف لمرحلة 23. foxe3 التعبير النصال. (B) المرحلة 11-11،5 القبعات الحيوان وضعت على البويضات uninjected ومثقف لمرحلة 23؛ الكشف عن أي تعبير foxe3. (C) القسم من خلال foxe3 -positive الناجم عن الغطاء الحيواني من تعبير تظهر في الطبقات الداخلية والخارجية من الأديم الظاهر. قضبان = 500 ميكرون.و = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| RNA حقن | حالات إيجابية | جين | ٪ |
| المرحلة 14 مرنا dorsalized، 10 نانوغرام | 12/24 | otx2 | 50 |
| حمامات مكتبة من 10 5 استنساخ، 20 نانوغرام | 09/03 | otx2 | 33 |
| حمامات مكتبة 05-10 أكتوبر 0 نسيلة وفاق، 20 نانوغرام | 50/179 | foxe3 | 28 |
| لا شيء | 0/140 | foxe3 | 0 |
الجدول 1. البويضة والحيوان كاب الفحص النتائج نتائج الغطاء الحيواني فحص المقررة من قبل الموقع التهجين مع otx2 وfoxe3 في، وذلك باستخدام البويضات حقن مرنا أو مع النصوص توليفها من حمامات مكتبة كدنا]؛ أو البويضات uninjected.
| RNA حقن | تجمع التعيين / الاختيار | إيجابي foxe3 التعبير |
| ا | 04/02 | |
| ب* | 28/04 | |
| C | 4/44 | |
| حمامات مكتبة من 10 4 استنساخ، 20 نانوغرام | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 14/03 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 20/01 | |
| 7 | 23/03 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 20/05 | |
| حمامات مكتبة 5000 الحيوانات المستنسخة، 20 نانوغرام | 1 | 0/7 |
| 2 * | 16/05 | |
| 3 | 07/01 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 26/08 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| حمامات مكتبة 70-200 المستعمرات، 20 نانوغرام | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 10/01 | |
| 4 * | 10/01 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| حمامات مكتبة 20 المستعمرات، 20 نانوغرام | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 21/07 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6، L1 | 0/10 | |
| L2-6، M7 | 0/10 | |
| M8-12، N7-8 | 0/10 | |
| K5-6، L1-4 | 10/01 | |
| L5-6، M7-10 | 0/10 | |
| M11-12، N7-8، K2-4 | 0/10 | |
| K2، K5، L2، L5، M8، M11 | 0/10 | |
| K3، K6، L3، L6، M9، M12 | 0/9 | |
| K4، L1، L4، M7، M10، N7، N8 | 09/01 | |
| الرنا المكتبة، 20 نانوغرام | K6 | 0/10 |
| L1 * | 10/03 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| RNA مكتبة، 20 نانوغرام | L1 (ldb1) تأكيدا | 50/179 |
| * تشير إلى تجمع المختارين |
الجدول 2. السيب اختيار وExpression استنساخ النتائج. وقد تم اختيار حوض السباحة مع أعلى مستوى الاستجابة في كل فحص الغطاء الحيواني (تتراوح بين 10٪ و 36٪ إيجابية لfoxe3 التعبير) لاستخدامها في التجربة المقبلة لتضييق النشاط لاستنساخ واحدة. تشير النجمة تجمع المختارين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموضحة هنا لاستنساخ وظيفي من الجينات قادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختصة يمكن أن تستخدم لتحديد مجموعة واسعة من المنتجات الجينات. توسع هذه الطريقة على عمل في الماضي من خلال الجمع بين المقايسات الذي يحفز الأنسجة مع تقنيات الاستنساخ التعبير. نحن الاستفادة من المسارات الأيضية من البويضة القيطم كمصدر للإنتاج يحفز عوامل، بشكل مباشر أو غير مباشر، بعد حقن الحمض النووي الريبي. هذا، جنبا إلى جنب مع استخدام الأساليب التي أنشئت لاستنساخ الجينات في المصالح 6،7 باستخدام تعبير عن النصوص الناتجة عن مكتبة [كدنا أو مجموعة أخرى من الحيوانات المستنسخة، يوفر نهجا قيما لأولئك الذين يسعون إلى تحديد الجينات التي تهم جديدة تشارك في الجنينية الحث. على التطبيق الواسع لهذه الطريقة لتحديد الوظيفي للجينات جديدة هي تكملة مفيدة لنهج الجينية العكسية جديدة ومثيرة، ويمكن أن تستخدم أيضا لوظيفيا النصوص الاختبار التي تم تحديدها باستخدام عالية عبتي-oughput الأساليب (مثل RNA وما يليها) 21.
ضوابط حاسمة في رصد وظيفة التمثيل الغذائي من البويضات المستخدمة في فحص الغطاء. وذلك لضمان صحة كل دفعة من البويضات وتحديد جدوى هذا النظام للكشف عن محاضر منخفضة وفرة، وتركيزات مرنا للمحفز الأديم المتوسط تم اختبار INHBB متفاوتة. هذا الجين لا علاقة لمسار عدسة الاستقراء، وهو مراقبة مستقلة موثقة جيدا 14. نشاط العضلات المسببة لل، يعاير عن طريق التعبير عن مستضدات عضلة معينة في الغطاء الحيواني الأديم الظاهر مع الأجسام المضادة 12/101، لوحظ مع 2-200 خريج INHBB مرنا، حتى في ظل وجود 500 أضعاف الفائض المرحلة 14 بولي (A) + RNA. هذا النظام هو بالتالي من المفيد أكثر من مجموعة واسعة جدا من حقن كمية RNA، والبويضات قادرة على إنتاج مستقر البروتين وتبقى قابلة للحياة بعد الحقن هيولي من حجم 50 NL والتعليم العالي.
اعتبار واحد لشذاتها من مكتبة [كدنا في هذا البروتوكول هو ضرورة لطول كامل أو ما يقرب من استنساخ كامل طول. قبل استخدامها في البروتوكول، ينبغي أن تدرس المكتبة عن طريق تحليل الشمالي لتحديد حجم النصوص المعروفة في المكتبة، وبالتالي خفض احتمال أن آثار المهيمنة سلبية يتم الحصول عليها من المحتمل اقتطاع النصوص حقن. منذ حمام سباحة على طول كامل [كدنا مهم، واستخدام الحيوانات المستنسخة EST 22 أو على النحو الأمثل، والقيطم ORFeome 23 (الذي يوفر مجموعة كاملة من التحقق من صحة الحيوانات المستنسخة بالطول) ويفضل إلى مكتبة [كدنا التقليدية ما لم stage- ونسيجيا وسعى المصدر المحدد للكدنا] واستخدامها لبناء المكتبة. وهناك اعتبار آخر هو وجود تسلسل في ناقلات مكتبة تهدف إلى زيادة الاستقرار مرنا في محاضر حقن β-غلوبين وبولي (A). في حين أن هذا أمر مرغوب فيه لزيادة كمية البروتين المستخرج من مرنا الاصطناعية حقن، فإنه يثير أيضا possibilإيتي لإحداث تأثير مهيمن سلبية من مرنا التي هي أعلى في الاستقرار والنشاط مما كانت عليه في الجسم الحي. عدد نسخ منخفضة مرنا قد لا تمارس نفس آثار النظير الذاتية في خلفية مجموعة كبيرة من النصوص؛ واحد هو أن استقرت في عملية الاستنساخ والنسخ قد تستمر لإتاحة الكشف في فحص الغطاء. والمسألة الثالثة هي حجم تجمع. وقد أظهرت انخفاض كبير في حجم تجمع (10 استنساخ أو أقل) ليكون من المفيد في مشاريع الفرز الأخيرة مكاسب من وظيفة في الأجنة 24، ومن المرجح أن تقدم نتائج أكثر وضوحا وسهولة التعرف على الجينات المرشحة. A حجم تجمع أقل من 10 مارس - 10 أبريل الموصى بها في هذا البروتوكول هو تحقيق إذا التعقيد الكلي للمجموعة من الحيوانات المستنسخة هو أقل من 10 4، كما هو الحال مع ORFeome 23؛ يمكن للمرء أن فحص الحيوانات المستنسخة ~ 9000 ابتداء من 10 برك من 900، على الرغم من أنه قد يكون باهظه والعمل المكثف لمعالجة أكثر من 10 حمامات في تجربة.
تحديد نوع الجين المنتج (عن طريق تحليل تسلسل) التي أدلى بها الجينات التي تم تحديدها في الشاشة يحدد طبيعة الاختبارات وظيفتها. منذ تم التعرف على العامل المساعد النسخي النووي في الشاشة لدينا 8، كان لا بد من تأكيد دور النواة في عملية استقرائية الناجمة عن إدخال ldb1. البويضات منزوعة النواة التي لها آلية الاصطناعية البروتين يعمل بشكل كامل وقابلة للتطبيق وقادرة على إنتاج العوامل يفرز من النصوص حقن. ومع ذلك، فإن عدم وجود نواة تلغي أداء عوامل النسخ، العوامل المساعدة، أو غيرها من المنتجات الجينات تتصرف بشكل غير مباشر. وتشمل التحليلات اللاحقة من الجينات التي تم تحديدها في شاشة تحديد نمط التعبير التنموي من خلال التهجين في الموقع وكسب من وظيفة والخسارة من وظيفة الاختبارات. Overexpression عن طريق الحقن من RNA إلى بيضات ملقحة أو عن طريق الحد من الحقن ليرة سوريةعن Blastomeres ecific لتقييد آثارها على مناطق معينة من الجنين يمكن أن توفر رؤى، وكذلك ضربة قاضية من وظيفة الجين من خلال حقن أليغنوكليوتيد] morpholino موجها ضد نص في الجسم الحي.
رؤية مباشرة للتأثير حثي في الاستجابة الغطاء الحيواني الأديم الظاهر باستخدام خط المعدلة وراثيا مع جين مراسل (مثل GFP) قد تعجل كثيرا من عملية الفرز والتخلص من الحاجة لتحليل التعبير RNA عن طريق التهجين في الموقع. وبالمثل، فإن استخدام الأجسام المضادة كوسيلة أسرع من الفحص أمر مرغوب فيه إذا كان الجسم المضاد المناسب (مثل 12/101 للاستجابة العضلات التي نوقشت أعلاه) هو متاح. ويمكن استخدام الأجنة البيضاء للالقبعات الحيوان، والتي على الرغم من صعوبة المرحلة بدقة في المراحل المعيدة، تبسيط عملية التهجين في الموقع من خلال القضاء على الحاجة إلى أي تبيض البرية من نوع تصبغ لتصور أفضل همز رد فعل اللونUCT.
وأخيرا، من المهم أن نعتبر أن لعدة أسباب، قد تحتاج إلى عدد كبير من التجارب التي ستجرى لتحديد جينة معينة. لأحد، وعدد الحالات يجوز لأحد أن عملية معقولة في محاكمة معينة ومحدودة من تطوير (والخسارة في نهاية المطاف من الكفاءة) الذي يحدث مع مرور الوقت حتى يعطى دفعة كبيرة من الأجنة ومجموعة من درجات الحرارة التي لثقافة لهم، كما كذلك الخسارة التي قد تحدث من قطع صغيرة من الأديم الظاهر في المعالجة. ومن ناحية أخرى، قد تكون معدلات نجاح تعبير عن علامة المختار في الأديم الظاهر منخفضة للغاية وتتطلب كثير من الحالات لمراقبة تأثير ذو دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
