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Developmental Biology

功能性克隆使用 doi: 10.3791/53518 Published: January 30, 2016

Protocol

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所有的实验程序都经弗吉尼亚机构动物护理和使用委员会的大学。

注意: 图1示出的实验步骤的示意图。

1.准备卵母细胞

  1. 前总理X.蟾女性,150ü孕马血清促性腺激素(PMSG)大约提前一个星期的卵母细胞隔离。注射1毫升150单位/毫升PMSG到背部淋巴囊有1毫升无菌注射器用29克针。
  2. 准备注入卵母细胞和卵母细胞动物帽检测解决方案。
    1. 制备的Ca ++ / Mg ++的-free OR2(OR2-):82 mM氯化钠,2.5mM的氯化钾,1.5mM的钠2 HPO 4,50mM的HEPES pH7.2的。
    2. 准备OR 2:OR2-加1毫米氯化钙2和1毫米氯化镁2。
    3. 制备OCM:60%的Leibovitz L15,0.4毫克/毫升BSA,100μg/ ml的庆大霉素,pH值7.8。
    4. 预削1×MBS:88 mM氯化钠,1mM的氯化钾,0.7毫米氯化钙2,1mMMgSO 4干燥,5mM的HEPES(pH值7.8),2.5毫碳酸氢钠。
    5. 准备3%聚蔗糖在1X MBS。
    6. 制备1×NAM:110 mM氯化钠,2mM的氯化钾,1毫米的Ca(NO 3)2,1mM的MgSO 4干燥,0.1毫摩尔EDTA,1毫碳酸氢钠 ,2毫的Na 3 PO 4,pH 7.4中。
  3. 麻醉雌性在3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐在0.1倍的MBS 0.03%溶液(MS222)通过将蛙在溶液中(第一溶解在10ml 95%乙醇0.3克MS222,然后稀释在1升0.1×MBS) 10 - 15分钟或直到反应迟钝。
    1. 检查麻醉完成后转动麻醉青蛙到它的后面,以确保它不会响应(不完全麻醉的青蛙四肢移动或转动身体以上)。
  4. 手术通过穿过皮肤和体壁与手术刀片腹部切口,分离卵巢组织钳分离卵巢片段和剪刀。将卵巢碎片进入OR2-。收身的墙上用3-0丝线在一个24mm弯针,并分别与相同缝合关闭皮肤。允许女性的恢复在1克/升鱼缸盐水。
  5. 用细镊子,撕裂卵巢组织成小(10 - 20卵母细胞)件,转移至新鲜OR2-。
  6. 在OR2- 2.0毫克/毫升胶原酶甲Defolliculate卵巢片段轻轻搅动在摇床上1小时,转移到新鲜胶原酶和搅拌一小时。
  7. 洗卵母细胞的10倍OR 2 [含Ca ++ / Mg ++的],舍弃小卵母细胞。
  8. 在OCM洗卵母细胞的两倍,并转移到新鲜OCM。在目视检查隔离第六阶段的卵母细胞通过尺寸和丢弃未成熟(较小)的卵母细胞:第六阶段的卵母细胞是大于未成熟卵母细胞即使色素沉着动物半球和大约1.2-1.4毫米的直径。
  9. 卵母细胞保持在18 - 20°C IñOCM注射前。注意:琼脂糖包被的培养皿中,可以使用最小化的卵母细胞的粘附抛出。

2.注射图书馆成绩单

  1. 制备定向cDNA文库15使用RNA在发展的适当阶段(例如,神经板级14 10)萃取。购买的cDNA文库,或者使用下面的四个步骤每概览​​商品化试剂盒构造之一。
    1. 通过使用产品以富集多聚(A)+ RNA(见表材料)和下列制造商的说明分离约5微克的mRNA。注意:要使用的转录物产生的cDNA文库可以被限制为一个诱导的组织(如神经板,以下所需组织的显微切割),或者可以是从全胚胎在特定阶段。
    2. 产生的cDNA用市售试剂盒,按照制造商的指示。
    3. 结扎大约20纳克的cDNA到vectoř附带市售试剂盒或其他合适的载体中。合适的质粒载体包括用于mRNA稳定性如5'β珠蛋白和3多聚(A)序列(PCS2 + pTnT,pCS105)序列。
    4. 转换连接入使用供应商推荐的协议,用于热休克转化能力的细菌细胞。
      注意:可替换地,开放阅读框(ORFeome)克隆的集合是可​​商购,并且可以用于产生转录物用于注射。
  2. 制备的10 3的质粒的10池10 4复杂性(10 4〜10 5的总的复杂性)。这代表10板的1000 - 每套1殖民地。
    1. 板库培养到10 15厘米LB-氨苄青霉素板,成长12 - 18小时在37℃,并收集从每个用一个玻璃吊具温和的压力菌落在7ml LB.
    2. 从0.5毫升准备甘油股票(添加到0.2毫升无菌甘油并储存在-20℃#730; C)中,并用剩余的6.5 ml至与标准制备DNA市售的DNA miniprep试剂依照制造商的指示。
  3. 线性合并的质粒DNA(1.0 - 2.0微克)用合适的限制性酶消化16在37℃,1 - 1.5小时。隔离用苯酚/氯仿提取,随后用乙醇沉淀和再悬浮在每所使用的RNA聚合酶试剂盒的规格水的线性化的DNA。合成有义RNA用市售RNA聚合酶试剂盒按照生产商的指示。
  4. 制备约20微米的直径的针显微注射(使用针拔出器与玻璃毛细管);衡量一个复合式显微镜与校准的目镜测微尺针尖。注:针拔出器设置必须根据经验确定生产针用细尖,这样当用细镊子破碎产生期望的针尖大小。
  5. 准备(粘土推入在培养皿底部)均匀一层黏土衬里35×10毫米,平行的凹槽显微注射期间举行的地方卵母细胞培养皿中;产生的凹槽与融合在火焰尖端商场探头或巴斯德吸管。作为一种替代粘土,准备做的压痕的弹性 17琼脂糖菜肴。转移的卵母细胞用宽口移液管至3%聚蔗糖在1X MBS(约2毫升)中的粘土内衬菜肴行。
  6. 用微量注射器,填补针1毫微克/ NL RNA和调整平衡,产生轻微的正压力(以防止制订卵母细胞胞浆内)。
  7. 注入的卵母细胞,在赤道区域大约20 NL核糖核酸。允许1小时的注入卵母细胞留在菲-MBS,然后轻轻地转移到1X MBS。在20℃之前动物帽测定24小时 - 孵育8。

3.动物帽化验

  1. 准备3/4倍不结盟运动和获得细镊子,发圈​​,弯曲盖玻片碎片,黏土衬里的DISHES杯状凹陷举行的卵母细胞。 ( - 2毫米×2 - 4 mm产品大约1),并穿过火焰直到边缘抛光和下垂,产生弯曲片通过分解盖玻片成小片段,使弯曲盖玻片片段。
  2. 施肥X.蟾18通过在体外或自然交配和文化的原肠胚阶段-在0.1倍MBS(10 11小时受精后在室温)之前逐步排序;收集中期原肠胚(阶段11 - 11.5)10胚胎。
  3. 转移到胚的培养皿大约半满与3/4×NAM。使用两对细镊子,从原肠胚取出施肥(卵黄)膜。
  4. 卵母细胞转移到3/4倍NAM(约2毫升)的粘土成荫的菜肴和固定在粘土个人的印象,产生的印象,以适应单个胚胎的凹槽中如上所述。
  5. 转移胚胎到粘土内衬菜切动物帽关克使用两对细镊子的astrulae。小心分离的动物帽外胚层,而不是只赤道组织18。
  6. 放在每个卵母细胞与动物帽接触卵母细胞的内表面形式的动物用半球动物帽。 8小时或更长的时间 - 通过将弯曲的玻璃盖玻片片段并施加向下的压力施加到玻璃,压扁外胚层作为盖玻片接触粘土(动物帽可以保持与暴露于卵母细胞为6的表面内层开放保持重组体一起)。
    注意:可替换地,将动物帽成粘土压痕与它的内表面朝上,并放置在盖的卵母细胞;保护与粘土的小扩展重组。
  7. 文化在20°C,直到控制胚胎达到所需要的阶段检测。
  8. 分离重组去除盖玻片/粘土和外胚层分离钳和吹风循环。
  9. 修复外胚层片段1小时的MEMFA(3.8%甲醛在MEM [0.1M的MOPS pH为7.4,2mM的EGTA,和1mM MgSO 4干燥])。
  10. 转移片段(和控制胚胎)从MEMFA成乙醇和储存在-20℃。

反应在外胚层原位杂交4.分析(ISH)

  1. 准备ISH的解决方案。
    1. 制备的1×PBS:0.01M磷酸盐缓冲盐水,氯化钠0.138男,pH 7.4的
    2. 制备PBS-吐温(PTW):1×PBS,0.1%Tween-20的
    3. 准备100X Denhart的解决方案:2%BSA,2%的聚乙烯吡咯烷酮,2%聚蔗糖
    4. 制备杂交缓冲液:50%甲酰胺,5×SSC,1毫克/毫升圆酵母RNA,1微克/毫升肝素,1×Denhart溶液,0.1%吐温-20,0.1%CHAPS,10毫摩尔EDTA,DEPC-H 2 O的
    5. 准备马来酸缓冲器(MAB):100毫米马来酸,150毫米氯化钠,pH值7.5
    6. 准备MAB +块:MAB,2%封闭试剂(加热至60℃溶解)
    7. 准备碱性磷酸酶(AP)缓冲液:100毫米的TrispH值9.5,50毫米氯化镁2,100毫米氯化钠,0.1%吐温,卫生署2 O
  2. 准备RNA探针。
    1. 用市售RNA聚合酶试剂盒,挖-NTP混合物,添加到1.5ml试管(50微升反应):25.5微升DEPC-H 2 O,10微升5X转录缓冲液,2.5微升10X掏-NTP混合物,5微升100毫DTT,2微升的RNasin,2微升线性DNA模板(约1微克/微升),3μl的核糖核酸聚合酶,孵育37℃90分钟。
    2. 添加2微升的RNA聚合酶,孵育37℃60分钟。
    3. 检查2微升反应的1%琼脂糖凝胶。
    4. 加入1μlRQ1无RNA的DNA酶孵育37℃20分钟。
    5. 通过加入50μlDEPC-H 2 O,25微升10μM的乙酸铵和313微升乙醇沉淀探头。储存在-20℃过夜(O / N),然后通过离心分离回收的RNA在13800×g离心20分钟。用500微升75%乙醇洗涤,短暂离心,去掉乙醇并允许沉淀风干。加入50微升DEPC-H 2 O
    6. 添加杂交缓冲液至0.5微克/微升〜的终浓度。
  3. 准备组织进行杂交。除非另有说明,填充小瓶与每个解变化描述(约4毫升)中的顶部。
    1. 除去从小瓶和移植胚乙醇到75%乙醇/ PTW,然后用50%的乙醇/ PTW,每次10分钟,水平方向上的摇杆。
    2. 在PTW每个摇杆上的5分钟洗三次。
    3. 转移到10微克/微升蛋白酶K处理的PTW;岩管垂直15分钟。
    4. 岩管垂直 - 在0.1M三乙醇胺pH值7.8冲洗两次,每次10分钟。
    5. 添加12.5微升乙酸酐到管和岩石竖直5分钟。重复用另外的12.5微升乙酸酐5分钟。
    6. 在PTW 5分钟垂直于摇杆清洗。
    7. Refix在4%多聚甲醛20分钟的摇杆。热杂交缓冲液到60℃。
    8. 在PTW每个摇杆上的5分钟洗三次。
    9. 从各管中取出PTW的所有,但约1毫升加250微升HYB缓冲;轻轻摇动管混匀。岩管竖直5分钟。
    10. 替换60℃HYB缓冲液(0.5毫升)和轻轻搅动在60℃10分钟。更换新鲜HYB缓冲器和搅在60℃两至4小时。
    11. 热探针(1混合物在0.5微克/微升在HYB缓冲液)到60℃(3分钟)。删除HYB缓冲区,并添加探头管。轻轻搅动O / N在60℃。
  4. 准备组织的抗体。
    1. 温暖HYB缓冲器和2x SSC + 0.1%Tween-20的溶液至60℃。
    2. 更换HYB缓冲探针溶液(保存探头在-20℃下2 - 3倍重用)。在60℃10分钟洗净。
    3. 在60℃在2×SSC-吐温(每个搅拌20分钟)洗涤三次。
    4. 在60℃在0.2×SSC-吐温(每个搅拌20分钟)洗涤三次。
    5. 在生物圈(RT)搅拌15分钟,各水平上摇杆洗两次。
    6. 加入1毫升MAB +块。在摇杆垂直洗2小时。
    7. 转移至1ml MAB +模块包含一个1 / 2,000抗洋地黄毒苷-AP。垂直岩石在4 CO / N。
  5. 准备组织的显色剂。
    1. 更换单克隆抗体的解​​决方案;在人与生物圈洗三次,每次5分钟水平上的摇杆。
    2. 人与生物圈1小时,各水平上的摇杆洗三次。
    3. 在AP缓冲液10分钟,各水平上摇臂洗两次。
    4. 转移组织到多个孔塑料托盘,取出AP缓冲液,并添加BM紫试剂(〜1毫升)中。允许反应进行在黑暗5分钟,O / N。
    5. 在适当的时候染色来实现,组织转移到PTW的小瓶。在摇杆的PTW洗两次,每次10分钟。
    6. 修正了布安的4 CO / N在摇杆的解决方案。
    7. 洗出布安的三个70%乙醇/ 30%PTW洗涤在室温。继续牛逼Ø图像采集使用的外部照明,并在显微镜安装摄像头,漂白如有必要,18。

5.同胞选择和克隆

  1. 最高的活动选择池(外胚层组织中最大的响应)。
  2. 滴定(的LB稀释至合适的密度)的甘油原液用于与活性最高的池和积垢10的新板用大约十分之一从(使用协议部2的上方)上一步骤的菌落。
  3. 减少池大小,直到活动被追踪到单一的殖民地。
  4. 使用标准的引物中的载体得到的DNA序列。

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Representative Results

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响应于mRNA的注入卵母细胞,响应动物帽组织表达测定为OTX2的表达通过原位杂交( 图2和表1); OTX2通过透镜placode表达在推定透镜外胚层(PLE)从神经管闭合增厚19。然而,由于OTX2也表达于前神经外胚层以及PLE外非神经外胚层头,它与这两个神经和placodal应答有关。使用foxe3筛选文库为能够产生在透镜感受态动物帽外胚层透镜感应响应允许一个更具体的方法来表达克隆的目标基因产物,因为foxe3从神经板中表达的PLE阶段和整个镜头囊泡形成20,目前在相邻的placodal地区但从neuroectoder缺席米使用表达克隆和同胞选择协议之上和注入库转录的池,能够产生foxe3表达在动物帽的基因分离出来( 表2)。继克隆的分离,采用卵母细胞注射库笔录179额外的动物帽检测中筛选出的foxe3表达; 50为阳性(28%)。 140动物帽片放置在未注射的卵母细胞,0为阳性图3)。

图1
图1.卵母细胞,动物第测定和表达克隆的协议的示意图概述转录物从克隆文库制备和注入的卵母细胞,动物帽外胚层与卵母细胞培养,然后通过原位杂交测定诱导的基因表达。 D / 53518 / 53518fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
动物帽化验以下基因注入和原位杂交 OTX2 图2.典型的结果 。(AB)感性反应代表结果dorsalized阶段14的poly(A)+ RNA在动物帽,检测通过整装原位 OTX2表达杂交。 一)动物帽放置在未注入卵母细胞的阶段10.5和培养,以期25(B)第一阶段10.5动物帽放置在卵母细胞注射10毫微克的RNA和培养,以期在25 6/7病例OTX2表达观察,并指出通过箭头。酒吧= 500微米。 “目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
动物第测定下列中的原位杂交 Foxe3 卵母细胞的动物帽测定法, 原位杂交测试foxe3的表达图3的典型结果 。(AC)的代表性动物帽。置于ldb1注射的卵母细胞,并培养至台23 foxe3 (A)阶段11-11.5动物帽是由箭头指示。 (b)第二阶段放置在未注射的卵母细胞和11-11.5动物帽培养上演23;没有foxe3表达检测。通过foxe3(c)阳性从外胚层的内层和外层是显示表达诱发动物帽。酒吧= 500微米。F =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

注入RNA 阳性病例 基因
第一阶段14 dorsalized基因,10纳克 12/24 OTX2 50
10 5个克隆库库,20纳克 3/9 OTX2 33
10 5到10 0酷龙库池 ES,20纳克一百七十九分之五十零 foxe3 28
0/140 foxe3 0

表1.卵母细胞,动物帽化验结果的动物帽化验结果 OTX2foxe3 原位杂交技术评估的,采用卵母细胞的mRNA或成绩单从cDNA文库池合成或者未注射的卵母细胞。

八:24PX;“> 10 5个克隆库库,20纳克HT:21px;“> 400个克隆库池,20纳克高度=“21”的风格=“HEIGHT:21px;”> 6图书馆池 - 7殖民地,20纳克1px的;“>
注入RNA 池指定/选择 正foxe3表达
一个 2/4
B * 4/28
C 4/44
10 4个克隆库池,20纳克 1 0/11
2 0/10
3 3/14
4 0/12
0/15
6 1/20
7 3/23
8 0/16
9 0/16
10 * 5/20
5000克隆库池,20纳克 1 0/7
2 * 5/16
3 1/7
4 0/7
0/7
1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 0/10
5 * 8/26
6 0/11
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/8
70-200殖民地库池,20纳克 1 0/8
2 0/10
3 * 1/10
4 * 1/10
0/10
6 0/9
7 0/10
8 0/10
20个殖民地库池,20纳克 1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 * 7/21
0/10
6 0/10
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/10
K2-6,L1 0/10
L2-6,M7 0/10
M8-12,N7-8 0/10
K5-6,L1-4 1/10
L5-6,M7-10 0/10
M11-12,N7-8,K2-4 0/10
K2,K5,L2,L5,M8,M11 0/10
K3,K6,L3,L6,M9,M12 0/9
K4,L1,L4,M7,M10,N7,N8 1/9
图书馆的RNA,20纳克 K6 0/10
L1 * 3/10
L3 0/10
L4 0/10
图书馆RNA,20纳克 L1(ldb1)确认一百七十九分之五十零
*表示选择的池

表2.同胞选择和Expre裂变克隆结果。与响应在每个动物帽测定法(10%至36%为阳性foxe3表达测距)的最高水平的池被选择用于下一个实验活动缩小到一个克隆。星号表示所选池。

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Discussion

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此处描述的基因能够诱导在主管外胚层的响应的功能性克隆的方法可以用于鉴定范围广泛的基因产物。该方法通过将组织诱导试验用表达克隆技术扩展了过去的工作。我们利用爪蟾卵母细胞的代谢途径如生产诱发因素,直接或间接地,以下的RNA注射的来源。此,在与使用已建立的方法进行克隆目的6,7-使用从cDNA文库或其他集合克隆的产生转录物表达的基因组合,提供了一个有价值的方法为那些寻求鉴定参与胚胎新兴趣的基因感应。此方法的新基因功能鉴定的广泛适用性是一个有益的补充激动人心的新的反向遗传方法,并且也可用于在功能上使用高苏氨酸鉴定测试转录oughput方法(如核糖核酸-SEQ)21。

控制是在监测在盖测定中使用的卵母细胞的代谢功能的关键。既要保证每一批卵母细胞,并建立该系统能够检测低丰度转录的有用的健康,改变中胚层诱导INHBB测试的mRNA的浓度;这种基因是无 ​​关的透镜诱导途径和是证据充分的独立控制14。肌肉诱导活性,通过在动物帽外胚层与一百零一分之一十二抗体肌肉特异性抗原的表达测定,观察到与2 - 200皮克INHBB表达,甚至在存在500倍过量的级14的poly(A) + RNA。该系统因而在非常宽的范围内注入的RNA量的有用的,并且卵母细胞都能够稳定地生产蛋白质和保持存活以下细胞质注射50 n1和更高卷。

其中一个考虑的U在这个协议中的cDNA文库本身是必要的全长或接近全长克隆。之前在要使用的协议,库应该通过Northern分析进行检查,以确定在库已知转录物的大小,因此降低了显性负效应从潜在地截断注射转录获得的可能性。自全长cDNA库是重要的,使用EST克隆的22或最佳地, 蟾ORFeome 23(它提供了一套完整的验证全长克隆的)是优选的,以传统的cDNA文库,除非一个stage-子和组织cDNA的具体来源是寻求并用于文库构建。另一个考虑是β珠蛋白和多聚(A)在所述文库载体旨在增强mRNA稳定性在注射转录序列的存在。虽然这是希望增加从注射的合成的mRNA产生的蛋白质的量,这也提高了possibil性产生的mRNA显性负效应是较高的稳定性和活性比在体内 。低拷贝数的mRNA可能不会产生相同的效果,在成绩单济济的背景下其内在的对应;一个稳定的克隆和转录过程可能持续以允许检测在盖检测。第三个问题是池的大小;相当大的减少池大小(10个克隆或更少的)已被证明是有利的,在胚胎24最近获得功能的筛选项目,并有可能提供更清晰的效果,更容易鉴定候选基因。比10 3的较小池大小- 10 4中建议的该协议是可以实现的,如果克隆的集合的总复杂度小于10 4中,与所述ORFeome 23的情况下;人们可以筛选〜9000个克隆为900 10池开始,虽然它可能是令人望而却步劳动密集型向处理在一个实验超过10个池。

通过在屏幕中确定的基因制成基因产物(通过序列分析)的类型的测定决定了它的功能的测试的性质。因为核转录辅助因子是在我们的屏幕8识别,有必要确认细胞核中通过引入ldb1的触发感应过程中的作用。去核卵母都充分发挥作用的蛋白质合成机器是可行的,能够从注射成绩单产生分泌的因素。然而,由于没有细胞核的将取消的转录因子,辅因子,或其它间接作用的基因产物运作。随后,在筛选中鉴定的基因的分析包括确定发育表达图案的原位杂交和增益的函数和丧失功能的测试。通过过表达的RNA注射到受精卵或通过限制注入用上ecific卵裂球,以限制其影响胚胎的特定区域可以通过注射针对体内转录吗啉代寡核苷酸提供的见解,以及基因功能的击倒。

直接可视化在响应动物帽外胚层使用与报告基因(如GFP)的转基因系可以大大加快筛选过程,不再需要用于RNA表达的分析通过原位杂交的感应作用。同样,使用抗体作为筛选更快装置是可取的,如果适当的抗体(如101分之12以上讨论的肌肉反应)是可用的。白化的胚胎可用于动物帽,这虽然更加难以准确地阶段在原肠胚阶段,通过省去了野生型色素任何漂白,以更好地可视化的显色反应督促精简原位杂交过程UCT。

最后,要考虑到以下几个原因,一个大量的实验中,可能需要进行以识别给定基因是重要的。为一体,例1的数目可以合理地处理在给定的试验是由发生随着时间的推移,即使给定的大批量的胚胎和一定温度范围内,在其上培养它们的发展(和能力的最终丧失)的限制,因为以及可能发生的在处理小件外胚层的损失。另一个原因是,一个选择的标记物,在外胚层表达的成功率可能非常低,并需要很多情况下观察到统计学上显著效果。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12/101 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 12/101 Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer Sigma S6639 for ISH
Acetic anhydride Sigma A6404 for ISH
Anti-Dig-AP Roche 11093274910 for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit Bio-Rad 732-6400 Plasmid DNA purification
Blocking Reagent Roche 11096176001 for ISH
BM Purple Roche 11442074001 for ISH
Boekel Hybridization Oven Fisher Scientific 13-245-121 for ISH
Bouin's Solution Sigma HT10132 for ISH
BSA Sigma A9647 for OCM
CHAPS Sigma C3023 for ISH
Collagenase A Roche 10103578001 Defolliculation of oocytes
Cysteine Sigma C121800 Dejelly embryos
DEPC-H2O Fisher Scientific BP5611 for ISH
Dig-RNA Labeling Mix Roche 11277073910 for ISH probes
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 500233 for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate Sigma A5040 MS222 anesthetic
Ficoll PM 400 Sigma F4375 for Injection media
Formamide Sigma F9037 for ISH
Gentamicin sulfate Sigma G1914 for OCM
Glass capillaries World Precision Instruments 4878 3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials Fisher Scientific 06-408B for ISH
Hair loop Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt Sigma H4784 for ISH
Injector Nanoliter 2010 World Precision Instruments Nanoliter 2010 Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean Carolina 972433 Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA Source Bioscience 989_IRBG cDNA library 
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin Teknova L5004 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth Teknova L8650 LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit New England BioLabs S1550S for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid Sigma M0375 for ISH
Manual Microfil Micromanipulator World Precision Instruments M3310R Manual micromanipulator
Nutating Mixer Fisher Scientific 22-363-152 Rocker for ISH
Permoplast Nasco SB33495M Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline Sigma P5368 for ISH
PMSG Sigma G4877 to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP40 for ISH
Programmable Puller World Precision Instruments PUL-1000 Micropipette needle puller
Proteinase K Sigma P6556 for ISH
pTnT Vector Promega L5610 cDNA library construction
Riboprobe Combination System Promega P1450 in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit Life Technologies 18248013 kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk Fisher Scientific 19-037-516 Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA Sigma R3629 for ISH
Triethanolamine Sigma T1502 for ISH
Tween 20 Sigma P9416 for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System Promega C4360 alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration Source Bioscience 5055_XenORFeome ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells Agilent Technologies 200150 cells for transformation of cDNA library

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References

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功能性克隆使用<em&gt;爪</em&gt;卵母细胞表达系统
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Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).More

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).

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