Abstract
질량 분석 (MS)의 대부분은 단백질 분석 방법은 일반적으로 트립신, 검출 효소 분해 단계 전에 수반 기반. 이 단계는 질량 분석 기기의 유효 주사 범위 내에 MW <3,000-4,000 다 함께 일반적으로 분자량이 작은 펩타이드의 생성을 위해 필요하다. 종래의 프로토콜은 37 ºC에서 O / N 효소 소화를 포함한다. 최근 발전은 전형적으로 예를 들면, 전자 렌지 나 고 고정화 효소 또는 몇 분에 단백질 가수 분해에 필요한 시간을 단축 상보 물리적 처리 (범위의 마이크로 리액터의 이용을 포함하는 다양한 전략의 개발을 주도 압력). 본 연구에서는 단백질을 빠르게 분해 효소를 달성하기 위해 임의의 실험실에서 구현 될 수있는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단백질 (또는 단백질의 혼합물)은 결합 된 C18 역상 높은 퍼포에 흡착모세관 컬럼에서 사전로드 된 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 실리카 입자를 필요치 않는, 수성 완충액 트립신은 짧은 시간 동안 입자를 통해 주입된다. 온라인 MS 검출을 사용하려면 트립신 펩티드는 MS 이온 소스에 직접 증가 유기물 함량과 용매 시스템과 용출된다. 이 방법은 고가의 고정화 효소 입자의 사용을 회피하고, 처리를 완료하는 처치를 필요로하지 않는다. 단백질 소화 완전한 샘플 분석은 각각 ~ 30 분 이하 ~ 3 분 이상으로 달성 될 수있다.
Introduction
정제 된 단백질의 동정 및 특성화 자주 MS 기술을 사용함으로써 달성된다. 단백질은 효소로 분해되고 그 펩티드는 더 간단한 주입 실험 장치를 사용하여 MS로 분석된다. 단백질 분해 소화 가장 MS 분석기의 유효 질량 범위에 속하는 작은 펩티드 단편을 생성하기 위해 필요하고, 그 용이 아미노산 서열 정보를 생성하기 위해 저 에너지 충돌 유도 된 분해를 통해 단편화 될 수있다. 절연 단백질 또는 단순 단백질 혼합물, MS 검출하기 전에 펩티드의 크로마토 그래피 분리에 대한 추가적인 필요가 없다. 25-50 펩티드의 혼합물을 용이 MS 이온 소스에 직접 주사기 펌프 시료를 주입하여 분석 할 수있다.
질량 분석 장치는 분석을 수행하고, 짧은 시간 프레임 내에서 단백질의 서열을 확인할 수있다. 현대 데이터 수집 방법과,이 프로세스는 승 달성 될 수있다몇 분 또는 초 ithin. 단시간 스케일에 대한 전체 프로세스를 완료하는 제한 요인이 단백질 분해성 분해 공정이다. 일반적으로, 이것은 수 시간에 걸쳐 수행된다 (또는 O / N) 용액에 37 ºC에서 사용한 기판 (50-100) 효소의 비를 1. 설명 된 미세 반응기 또는 시판되는 카트리지의 형태로, 분, 초, 고정화 효소의 마이크로 리액터의 효소 소화 시간을 감소시킨다. 1-6 일반적으로 효소를 공유 결합, 비 - 공유 / 물리 흡착 복합체가 고정화 형성 또는 캡슐화, 효소 처리의 -3,6- 향상된 효율으로 사용되는 큰 표면 대 부피 및 효소에 대한 기판 비. 고정화 반응기의 추가 이점은 MS 분석에서자가 분해 효소와의 간섭을 감소 효소 안정성 및 재사용 성을 향상시킬 것을 포함한다. 접근법을 이용하여 유리 또는 중합 미세 다양한 장치가 설명되었지만항체 - 항원 상호 작용에 의해 자성 비드에 고정화 효소를 이용하여, 7,8- 9는 티타니아, 알루미나 졸 - 겔 10 nanozeolites 11에 캡슐화 또는 니켈 NTA 또는 그의 태그 복합체 형성을 통해 캡처 된 금 나노 입자의 네트워크에 포획. 6 대안 고정화 효소 개방 관형 모세관도 개발되어있다. (12) 또한, 향상된 단백질 분해 절단은 30-120에 대한 반응 시간을 감소시키기위한 제어 마이크로파 조사 (13) 또는 압력 보조 또는 압력 사이클링 기술 (PCT)을 사용하여 입증되었다 분. (14)
고정화 효소 반응기의 여러 장점에도 불구하고, 상업적 카트리지의 비용이 높고, 일상적인 사용을위한 미세 유체 장치의 유용성은 제한되어, 추가 계측을 필요로하는 전자 또는 PCT 기술 결과의 용도. 이 연구의 목적은 circumve 방법을 개발했다이러한 단점을 NTS, 그것은 쉽게 분 이내 MS 분석에 대비 단백질의 효소 적 분해를 수행하기위한 간단하고 효과적인 방법으로 연구자 강화할 각 실험실에서 구현 될 수있다. 접근법은 모세관 또는 미세 유동 장치에 사전로드 된 소수성 C18 입자의 사용에 의존하며 통해 효소의 주입 중에 효소 분해 한 다음 이들 입자에 관심 단백질 (들)의 흡착 충전 층 및 캡처 단백질 (들). 이 방법에서, 기판은 비 - 공유 상호 작용을 통해 고정되고, 상기 효소가 고정화 된 단백질을 통해 주입된다. 단백질 분해 소화 효율을 효소 처리, 환원 및 입자의 표면으로부터의 거리와, 확산 시간은 단백질을 노출 큰 입자 표면적이 증가 질량 전사 효소의 활성에 영향을 미칠 수없는 공유 결합, 기능 향상 빠르게 evaluat다른 효소 처리 성 및 다중화 E의 조합이 과정은 미세 형식으로 실행되는 경우. 이 방법은 표준 단백질 및 ESI-MS 검출 이전에 단백질 분해 소화 트립신 가장 일반적으로 사용되는 효소의 혼합물을 이용하여 설명된다. 본 연구에 사용 된 검출 질량 분석기는 선형 트랩 중극 (LTQ)기구이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모세관 마이크로 반응기 1. 준비
- 100 μm의 내경 (ID)이 360 ㎛의 외경 (OD) 7-8cm 길이로 모세관 유리 모세관 칼 3-5 센티미터 20 μm의 ID X 0.09의 OD 모세관 X 컷; 어떤 돌출 버없이, 모두 모세관 끝이 깨끗하고 스트레이트 컷을 현미경으로 확인합니다.
- ~ 6mm의 길이, 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관의 한쪽 끝으로 20 μm의 ID X 90 μm의 외경 모세관을 삽입; 필요한 경우에, 현미경이 동작을 관찰한다.
- 면봉의 끝이 90 μm의 OD / 100 μm의 아이디 모세 혈관의 교차점 주위에 접착제 E6000의 작은 방울을 적용하고 RT에서 접착제 경화 O / N을 할 수 있습니다.
- ~ 10-15mm의 길이에 삽입 된 20 μm의 ID X 90 μm의 외경 모세관을 잘라; 이것은 전기 분무 이온화 방출 될 것입니다.
- 미리 잘라 1/32 "OD의 PEEK, 1/16"OD의 PEEK 및 1/16 "OD의 PTFE 욕조길이 4-5cm의 조각 보내고; 이러한 누출이없는 연결을 제공하기 위해 모세관 조합에 사용되는 소매 될 것입니다.
- 까꿍 조합에 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관의 반대쪽 끝을 연결합니다; 누출이없는 연결을 제공하기위한 1/32 "PEEK 슬리브를 사용합니다.
- 삽입 / 노조의 반대쪽에 5cm 길이 1/16 "PTFE 튜브 ~의 조각을 조입니다.
- 사전 세척 / 2 ㎖의 유리 병을 건조에 C18 (5 μm의) 입자 ~ 4 mg의 무게; 0.5 ml의 이소프로판올을 추가 바이알을 닫고 초음파 목욕 슬러리를 분산.
- , 250 μL 주사기 약 200 ㎕의 슬러리를 철수 PEEK 조합의 1/16 "PTFE 튜브에서 주사기 바늘을 삽입하고 천천히 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관에 슬러리를 분배하며로서 현미경으로 관찰 모세 혈관이 달성된다 2-3mm 포장의 길이까지 입자로 채우고, 이것은 마이크로 반응 할 것이다 (그림 1) 20 μ.m의 ID 모세관은 키스톤 효과를 통해 마이크로 반응기에서의 입자를 유지한다. (15)
- H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / V를 50 μl의 솔루션 ~와 마이크로 반응기를 씻어하고 H 2 O / CH 3 CN (98)의 50 μl의 솔루션 ~와 : 2 v / V를.
샘플 솔루션의 2. 준비
주 : 유기 용매 및 산 및 용액 제제의 운반 작업 것을 포함 흄 후드에서 수행되어야한다. 고글, 장갑 및 보호 복을 착용 할 것.
- CH 3 OH 씻어 몇 유리 병 (4 ㎖) 및 폴리 프로필렌 튜브 (15 ml)에 건조.
- H 2 O / CH 3 CN 용액 10 ㎖를 준비 (98 : 2 v / v)로 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 200 μL의 CH 3 CN로 9.8 ml의에게 H 2 O를 혼합하여; 초음파로 섞는다.
- 용액 10 ㎖를 준비 H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v)로 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 5 ML의 H 2를 혼합하여 </ 서브> O 5 ml의 CH 3 CN; 초음파로 섞는다.
- H 2 O / CH 3 CN 4 ml의 4 μL TFA (10 %)를 추가하여 산성화 된 수용액 (TFA 0.01 %의 v / v)의 4 ml의 준비 : 4 ㎖의 유리 병에 (98 2 v / v)의; 초음파로 섞는다.
- 4 ml의 H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v)로에서 4 mL 유리 바이알에 4 μl를 TFA (10 %)를 추가하여 산성화 된 유기 용액 (TFA 0.01 %의 v / v)의 4 ml의 준비; 초음파로 섞는다.
- 16 mg의 NH 4 HCO 3 무게 4 mL 유리 바이알에서 분석 마이크로 밸런스와; (: 2 v / V를 98) 솔루션 및 초음파에 의해 분산 2 O / CH 3 CN에게 H의 4를 가하여 이 수성 버퍼 NH 4 HCO 3 (산도 ~ 7.8)의 50 mM의 솔루션을 초래한다.
- 표준 단백질의 5 mg의 체중 (예를 들면, 소 혈청 알부민, 헤모글로빈 α / β, 시토크롬 C, 탄산 탈수 효소, α-2-HS 당 단백질 등) 4 mL 유리 바이알에서 분석 마이크로 밸런스와; 4 ML의 DI의 물 공급을 추가연구 및 초음파에 의해 분산; 이것은 일반적으로 높은 수준 μM 농도 용액을 초래한다.
- NH 4 HCO 3 (50 mM)을 수성 완충액 적절한 부피 μM 높은 수준의 농도로 용액을 희석하여 1 mL의 단백질 용액 (1-2 μM)를 준비; 초음파로 섞는다.
- (50 mM의 께) NH 4 HCO 3 170 μL 수성 완충액을 20 μg의 서열 분석 등급 트립신 용해 트립신 용액 (5 μM)를 준비; 초음파에 의해 분산.
3. 실험 설정
주 : LTQ-MS 시스템은 다양한 샘플 입력 방식으로 질량 분석 장치의 인터페이스 수있는 조립식 XYZ 스테이지를 포함하는 변성 ESI 공급원이 장착된다.
- 픽 조합에서 모세관 마이크로 반응기를 분리하고 PEEK 티에 연결합니다.
- 픽 티 옆을 팔에 ~ 2cm 긴 백금 와이어를 삽입; 를 제공하는 1/32 "PEEK 슬리브를 사용누수없는 연결과 백금 와이어를 절연합니다.
- 픽 티의 반대쪽에 (~ 0.5 m 길이) 샘플 전송 모세관 50 μm의 ID X 360 μm의 외경을 연결합니다; 누출이없는 연결을 제공하기위한 1/32 "PEEK 슬리브를 사용합니다.
- XYZ 단계에 PEEK 티를 안전하고 멀리 질량 분석기 입구 모세관에서 ESI 터 ~ 2mm의 위치.
- 질량 분광기의 ESI 전원부에 백금 와이어를 연결한다.
- 스테인리스 연합 샘플 이송 모세관의 대향 단부에 연결; 누출이없는 연결을 제공하는 1/16 "PEEK 슬리브를 사용한다.
- 스테인레스 스틸 노동 조합의 반대 끝에 4-5cm 길이 1/16 "PTFE 튜브를 연결하고 PTFE 튜브에 250 μL 주사기 바늘을 삽입, 예를 들어 (펌프를 켜고 원하는 값에 유량을 설정, 2 μL / 분).
- 이동국 구을 제어하는 소프트웨어 패키지에 입력 탠덤 MS 데이터 수집 매개분석을 수행하기위한 준비를 설치하는 방법 파일로 저장 거라고; LTQ-MS 시스템에 대해 다음 데이터 분석 의존 파라미터를 사용 제외 질량 폭 180 초 동안 활성화 된 동적 배제를 1.5 m / z ±; 하나의 MS는 한 줌 다음 스캔과 MS는 상위 5 가장 강렬한 봉우리 2 스캔, 5m / Z ± 스캔 폭을 확대; 충돌 유도 해리 분리 폭 3m / Z, 정규화 된 충돌 에너지 35 %, 활성화 Q 0.25 및 활성화 시간 30 밀리 초 설정 (CID) 매개 변수를 설정합니다.
4. 미세 유체 설치
- 유리 또는 폴리머 기판으로부터 마이크로 유체 장치 준비, 입구에 접속 16-18 장치의 레이아웃이도 2a에 제공되고, 마이크로 반응기로 이루어진 (1) (0.13 mm 폭 × 2 mm 길이 × 50 μm의 깊이) (2 ), 배출구 (3) 측의 포트 (4); 유체 조작에 대한 상호 연결 채널은 ~입니다110 μm의 폭 ~ 50 μm의 깊이; 다중 채널 구조는 (5)로 이루어진 ~ 1.5 ㎛의 깊이 × 10 ㎛ 폭 X 위치 100 μm의 길이 25 ㎛의 미세 간격, 마이크로 리액터에 입자를 유지하기위한 필터로서 작용한다.
- 또는 유체 전달 (그림 2B)에 대한 피팅을 수용하는 고분자 스탠드를 고안하여 입구 포트에 특수 커넥터를 접착하여 칩에 유체 전달 연결을 사용하도록 설정합니다. (16)
- 단계 1.8에 기재된 바와 같이 입자 C18 (5 μm의)의 슬러리를 조제; 칩 측 포트에 접속 1/16 "PTFE 튜빙을 사용하여 주사기와 마이크로 반응기에 상기 슬러리를 제공하는 것은 (4) 90 ºC 오븐에서 에폭시 접착제와 1 시간 동안 경화와 함께 입자 로딩 후 포트를 밀봉 (16).
- 경화 O / N을 E6000 접착제로 밀봉하고,하자, 출구에 모세관 (20 μm의 ID X 90 μm의 OD × 10 mm 길이)를 삽입; 이합니다 (ESI의 터가 될 것이다
- 50㎛의 ID X 360 μm의 지름을 연결 (~ 0.5 m 길이) 칩 유입구 샘플 이송 모세관 (2); 3.6-3.7에 기재된 바와 같이, 250 μL 주사기 및 주사기 펌프 모세관의 대향 단부를 연결한다.
- 흡기구 직전 샘플 전송 라인상의 경량 PEEK 티 커넥터 배치 (2) 및 티 측 아암 편에 와이어를 삽입 3.2에 기재된 바와 같고; 이것은 ESI 전극 될 것입니다.
- 질량 분석기 입구 모세관에서 ~ 2mm 거리에 위치하는 ESI 이미 터와 XYZ 스테이지에 미세 유체 소자를 고정; 3.8에 기재된 바와 같이 분석을 위해 MS를 준비한다.
5. 샘플로드, MS 분석을위한 단백질 분해 소화 및 용출
모든 용액 / 샘플 전송 단계를 주사기 펌프의 도움으로 수행되고, 데드 있습니다 volum 보상하기 위해, 완료하기 위해 몇 분 동안 추가로 허용한다 참고및 상기 마이크로 반응기에서 이송 라인과 관련된 ES; 필요한 시간이 포함 된 유량에 따라 달라집니다.
- 마이크로 반응을 씻어 2 O / CH 3 CN H의 수성 NH 4의 솔루션 HCO 3 (50 mm)를 주입하여 분석 준비를 5 분 동안 2 μL에서 (98 2 v / v)의 / 분; 250 μL 주사기를 사용합니다.
- 2 μL의 시료 용액을 주입하여 미세 반응기에 단백질 샘플 (1 μM)을로드 / 분, 5 분; 250 μL 주사기를 사용합니다.
- 1-3 분 / 2 μL에서 분 마이크로 리액터에 흡착 된 단백질을 통해 트립신 용액 (5 μM)을 주입.
- TFA의 산성화 수용액으로 마이크로 반응기를 세척하여 단백질 분해 소화 과정을 끄다 (0.01 % v / v)의 H 2 O / CH 3 CN에서 (98 : 2 v / v)의 2 μL / 분 5 분; 250 μL 주사기를 사용합니다.
- (단백질의 TFA 산성화 된 유기 용액을 주입하여 미세 반응기로부터 0.01 % 다이제스트 용출 시작v / v)로 H 2 O / CH 3 CN에서 (50:50 v / v)의 300 NL / 분.
- 단말기 데이터 수집 과정과 ESI 전압 (~ 2000 V)를 켭니다; 단계 3.8에 제공된 데이터 수집 매개 변수를 사용하여 MS 데이터를 획득; 트립신 펩타이드의 용출을 관찰합니다.
6. 데이터 처리
- 원시 MS 데이터 포맷과 호환되는 검색 엔진 탠덤 MS 데이터를 처리한다.
- 생체의 특정 최소 중복 단백질 데이타베이스를 사용하여 LTQ-MS 원시 파일을 처리; 검색 엔진의 원시 데이터를 업로드, 각각 2 및 1 다에 부모 및 조각 이온 질량 공차를 설정하고, 최대 두 개의 검색에 대한 분열을 놓친 만 완전히 트립신 단편을 사용한다; 번역 후 변형을 허용하지 않습니다 각각 1 %와 3 %로 높은 및 중간 신뢰 거짓 발견 비율 (FDR)를 설정하고, 번역 후 변형을 허용하지 않습니다.
- 만 높은 신뢰를 선택하기 위해 데이터를 필터링펩타이드는 데이터베이스의 단백질과 일치; 단백질 및 펩타이드 수준의 결과를 평가합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
단백질 분해 소화 공정의 대표적인 결과가 상기 마이크로 반응기 (도 1, 2) 표 1에 제공하여, 단백질의 혼합물을 동시에 수행 하였다.이 표는 특정 단백질을 식별하는 고유의 펩티드 서열을 포함하는 십자가 상관도 스코어 (Xcorr) (즉, 대응하는 탠덤 질량 스펙트럼 실험 투 이론적 매치의 품질 특징 스코어) 놓친 분열 횟수, 펩티드 충전 상태 (z) 및 질량 / 전하 ( 양성자 펩티드 m / z). 단백질 수준에서의 표는 단백질, 단백질 및 단백질의 점수 범위의 UniProt 단백질 ID, 설명 (명칭)을 제공한다. 단백질 분해 소화 90 초 동안 수행 한 후에 모든 단백질은 여러 펩타이드에 의해 식별했다.
에 필요한 시간모든 펩타이드의 용출은 300 NL / 분, 나노 ESI 최적 동작과 호환 유량으로 산성화하고 유기 용액을 전달 이송 모세관의 길이에 의존 하였다. 인스 모세관 수용액 및 유기 용액의 산성화 혼합은 몇 가지 펩티드의 초기 용출 초래하지만, 대다수는 유기 용액을 몇 분 동안 용출시켰다. 모세관 마이크로 리액터 생성 다섯 단백질, 여러 펩티드의 대표 공동 용출 표시 질량 스펙트럼을도 3에 제공된다.
모세관 마이크로 반응기 및 O / N 소화 프로토콜을 사용하여 다섯 단백질의 단백질 분해 소화를 통해 생성 된 트립신 펩티드의 표 1에 목록. 만 고유 한 시퀀스, 가장 높은 Xcorr으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1. 모세관 마이크로 반응기. 마이크로 반응기의 제조를위한 (A) 실험 설정. 상기 MS 이온 소스에 위치하는 (B) 모세관 마이크로 리액터. 마이크로 반응은 C18 결합 된 실리카 입자 수동으로로드 및 ESI-MS 소스의 적절한 위치를 용이하게하는 XYZ 스테이지에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 미세 유체 마이크로 반응기. (A) 미세 유체 반응기의 개략도. PEEK 스탠드에 고정 (B) 미세 유체 반응기. 미세 유체 반응기차 전송 라인은 XYZ 스테이지와 MS 소스의 추가 배치를위한 스탠드 집에서 만든 고분자 PEEK 확보 할 수있는 유리 기판으로 제조된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 마이크로 반응기에서 단백질 분해를 실시 단백질 혼합물로부터 생성 된 트립신 펩티드를 포함하는 3 질량 스펙트럼. 가장 강렬한 트립신 펩타이드 이온이 아미노산의 순서와 해당 단백질의 식별자로 표시되어 있습니다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 작품에서 설명하는 마이크로 반응기가 제공하는 간편한 구현 미만 30 분에서 MS 분석 및 식별을 가능하게하는 단백질의 효소 소화를 수행하기위한 실험 장치를. 기존의 방법에 비해이 시스템의 뚜렷한 장점은 단순성, 속도, 낮은 시약 소모와 낮은 비용을 포함한다. 특히, 고가의 트립신 고정화 비드 카트리지가 필요 없다. 모세관 마이크로 리액터의 제조는 간단 (도 1a), 그리고 통상적으로 크로마토 그래피 실험에서 발견 된 표준 용품에서 분 이내에 달성 될 수있다. 역상 C18 입자 흡착 단백질 또는 펩티드의 완전한 제거를위한 높은 유기 함량 용제 (CH 3 CN 또는 CH 3 OH)로 세정 할 수있어, 마이크로 리액터는 간단하고 비용 효과적인 제조 공정을 다시 사용할 수 있지만 일회용 APPLIC 일회용 유닛의 제조를 위해 초대관리 포인트. 모세관 마이크로 반응기는도 1b에 도시 된, 또는 표준 상업적인 이온 소스에 삽입 할 수 있으므로, 홈 내장 ESI 소스에 장착 될 수있다. 샘플 캡처 및 소화 입자 베드를보다 길게 할 필요는 없지만 ~ 1-2mm, MS에 의해 최적의 검출을 위해 충분한 물질을 포착하기에 충분한 모세관 자체의 길이는 임의의 특정 크기에 맞게 조절 될 수있다 이온 소스.
미세 유체 소자를 제작 기능이 검사실, MS 검출 (도 2B)에 인터페이싱 용이하게하기위한 스탠드로 고정 될 수있는 간단한 디자인 (도 2a)가 설치되어있다. 마이크로 리액터 및 전송 채널의 크기는 특정 애플리케이션의 요건을 조정할 수 있고, 상기 장치는 단일 또는 다중 형식으로 발전 할 수있다. 대부분의 상용 질량 분광계 그러나 이온 소스는 일을 허용하도록 수정해야소스에있는 장치의 전자 배치. 칩의 제조를위한 포토 마스크 도면 AutoCAD 소프트웨어로 실행하고, 포토 마스크 HTA 포토 마스크에 의해 제조 하였다. 마이크로 칩의 제조는 앞서 설명한 프로토콜에 따라 수행 하였다 : UV 광 (360 ㎚), 조사 된 포토 레지스트 하부의 크롬 층의 제거 버퍼와 채널의 습식 화학 에칭, 포토 마스크, 노출 된 기판 (17, 18)의 정렬 산화물 에칭 나머지 크롬 층의 제거, 접속 구멍 세정 드릴링, 마이크로 칩 표면의 분해 (NH 4 OH + H 2 O 2), 550 ºC로 점진적 가열에 의해 상기 커버 플레이트와 상기 기판의 열 접착. 두 기판과 커버 플레이트는 샘플에 대한 깊은 채널 하나가 얕은 마이크로 채널 필터 소자 (깊이 1.5 μm의)에 대한 다른 (~ 20-50 μm의) 처리하고, 에칭 하였다. (16)
상기 MI 생성 결과croreactor 기판을 사용 O / N, 19 기존의 소화 프로토콜에서 얻은 결과와 비교할 수 : H에 용해 된 펩타이드 주입 MS 검출 실험 (300 NL / 분, 펩티드 다음 (1), (50 ~ 100)의 효소 비율 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v)의 CH 3 COOH로 산성화, 0.1 % v / v)로. 마이크로 반응기와 기존의 프로토콜을 모두 여러 독특한 펩타이드 (표 1) 모든 단백질을 식별 할 수 있었다. 통상적으로, 단백질의 당 펩타이드 고유의 다소 더 많은 종래의 설치보다 마이크로 반응으로 관찰 하였다. 이것은 특정 사이트에서 불완전한 효소 절단의 결과였다. 단백질 분해 소화의 몇 가지 추가 분 감소하거나 결과를 제거. 또, 마이크로 리액터 생성 효소 일부 펩타이드 인해 C18 입자 다른 사이트에 흡착 된 단백질 효소 t에 노출된다는 사실에, 용액 중에 생성 된 것과는 상이균질 용액의 한강. 20 Xcorr 점수 마이크로 반응 생성 텐덤 질량 스펙트럼의 품질은 고품질이었다 그러나 보여, 충분한 단백질 서열 커버리지 (11~75%)은 모호 단백질 동정에 대한 달성 가능한 것으로 .
이 기술은, 기술 된 바와 같이, 간단한 주입 실험에 의해 분석 될 수 있고, 즉 MS 분석에 앞서 액체 크로마토 그래피 분리를 필요로하지 않는 가장 ~ 25-50 펩티드에서 발생 오히려 단순 단백질 혼합물의 분석에 한정된다. 성공에 중요 줄이거 나 마이크로 리액터의 작동 pH에서 단백질 분해 효소의 활성을 잃게하지 갓 해동 제조 트립신 용액을 사용하는 것이다 (즉, pH를 ~ 8). 또한, 적절한 균형은 전기 분무 이온화를위한 최적의 유량 (150-300 NL / 분) 실험 장치에 의해 허용하고 활성화 할 수있는 최대 유량 사이에서 발견되어야마이크로 리액터 (2-3 μL / 분)에서 빠른 펩타이드 용출. ESI 최적 유속보다 높은 감도 손실 불량 검출 한계를 초래한다. 그 결과, 이송 모세관의 길이는 ≤300 NL / 분으로 작동 할 때 마이크로 반응기로부터 펩타이드의 용출에 필요한 시간을 줄이기 위해 가능한 한 짧게 유지되어야한다. 실험적 셋업에 사용 된 모든 구성 요소는 유사한 기능을 수행하는 다른 제조업체의 구성 요소들에 의해 대체 될 수있다. 이들 구성 요소의 치수 특성이 특정 단계들을 수행하기위한 상기 ESI 전압 (길이, 직경, 볼륨) 용리액 유량의 최적화, 시료 농도, 시간이 다른 경우에는 유사한 결과를 얻을 필요가있다.
미세 유체 설정으로 활성화 독특한 장점은 대기 등을 가능하게하는 상기 칩상의 예 펌핑 시스템을 통합 할 수있는 능력, 흐름에 관련된 전기 구동 펌프 (21, 22) 인하나의 플랫폼의 작동 및 추가의 분리 단계의 통합. 능력은 개선 된 검출 한계 될 것이다 단백질 분해 소화를 통해 생성 된 펩티드의 온 - 칩 분리를 수행하고, 세포 추출물로부터의 복합 단백질 혼합물의 분석을 용이하게한다. 이는 상기 미세 플랫폼 및 생의학 애플리케이션 고속 MS 검출 활용 흐름의 기술의 통합을 가능하게한다. (23)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H.
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
