Abstract
A grande maioria de espectrometria de massa (MS) baseados em métodos de análise de proteínas envolvem um passo de digestão enzimática antes da detecção, tipicamente com tripsina. Este passo é necessário para a geração de péptidos de baixo peso molecular, geralmente com PM <3000-4000 Da, que caem dentro do intervalo de varrimento efectivo de instrumentação de espectrometria de massa. protocolos convencionais envolvem O / N digestão enzimática a 37 ºC. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de uma variedade de estratégias, que envolvem normalmente a utilização de um micro-reactor com enzimas imobilizadas ou de uma variedade de processos físicos complementares que reduzem o tempo necessário para a digestão proteolítica de alguns minutos (por exemplo, microondas ou alta pressão). Neste trabalho, nós descrevemos um método simples e de baixo custo que pode ser implementado em qualquer laboratório para a realização rápida digestão enzimática de uma proteína. O (ou mistura de proteína) proteína é adsorvida em alta perf de fase inversa C18-ligadoormance partículas de sílica com cromatograf ia líquida (HPLC), pré-carregados numa coluna capilar, e com tripsina em tampão aquoso é administrada por perfusão durante as partículas para um curto período de tempo. Para permitir a detecção em linha de MS, os peptídeos trípticos são eluídas com um sistema de solvente com o aumento do teor orgânico directamente na fonte de iões de MS. Esta abordagem evita a utilização de partículas de alto preço enzima imobilizada e não necessitam de qualquer ajuda para completar o processo. a digestão de proteínas e a análise da amostra completa pode ser realizada em menos de 3 minutos ~ e ~ 30 min, respectivamente.
Introduction
A identificação e caracterização das proteínas purificadas é frequentemente conseguido através de técnicas de MS. A proteína é digerido com uma enzima e os seus péptidos são ainda analisados por MS utilizando uma configuração experimental simples de infusão. A digestão proteolítica é necessário para a geração de fragmentos peptídicos pequenos que caem na gama de massa da maioria dos analisadores útil MS, e que pode ser facilmente fragmentado por baixo de energia de colisão de dissociação induzida para gerar informação sobre a sequência de aminoácidos. Para as proteínas isoladas ou misturas de proteínas simples, não há mais necessidade de separação cromatográfica dos péptidos antes da detecção MS. Uma mistura de péptidos 25-50 podem ser facilmente analisadas por infusão da amostra com uma bomba de seringa directamente na fonte de iões de MS.
O espectrómetro de massa pode realizar a análise e confirmar a sequência de uma proteína dentro de um curto espaço de tempo. Com os métodos modernos de aquisição de dados, este processo pode ser realizado Within alguns minutos ou mesmo segundos. O fator limitante para completar todo o processo em uma escala de tempo curta é a etapa de digestão proteolítica. Normalmente, isto é realizado ao longo de algumas horas (ou O / N), em solução, a 37 ºC, utilizando substrato: rácios de enzimas de (50-100): 1. Para reduzir o tempo de digestão enzimática para minutos ou segundos, microrreactores enzima imobilizada, sob a forma de reactores de microfluidos ou cartuchos disponíveis comercialmente, foram descritos. 06/01 Tipicamente, a enzima é imobilizada por ligação covalente, não-covalente / adsorção física, complexo formação ou encapsulamento, 3,6 a eficiência melhorada do processo enzimático a ser activada pela grande superfície para volume e rácios de enzima e substrato. As vantagens adicionais de reactores imobilizadas incluem a redução da autólise e interferência do enzima na análise de MS, melhorou a estabilidade da enzima e reutilização. Uma variedade de abordagens, utilizando vidro ou dispositivos microfabricados poliméricos têm sido descritos,usando enzimas imobilizadas em esferas magnéticas por interações antígeno-anticorpo, 7,8 aprisionados em redes de nanopartículas de ouro, 9 encapsulado em titânia de alumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 ou capturados através de Ni-NTA ou His-Tag formação do complexo. 6 Alternativamente , capilares tubulares abertas com enzimas imobilizadas têm sido desenvolvidos, assim. 12 além disso, a clivagem proteolítica aumentada foi demonstrada utilizando a irradiação de microondas controlado 13 ou assistida por pressão ou ciclagem tecnologia pressão (PCT) para reduzir os tempos de reacção a 30-120 min. 14
Apesar das várias vantagens de reactores de enzimas imobilizadas, os custos de cartuchos comerciais é alta, a disponibilidade de dispositivos de microfluidos para uso de rotina é limitado, e o uso de tecnologias de micro-ondas ou de PCT resultados em necessidade de instrumentação adicional. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método que circumvents estas desvantagens, e que pode ser facilmente implementado em cada laboratório para capacitar investigadores com uma abordagem simples e eficaz para a realização de clivagem enzimática das proteínas na preparação para análise por MS em poucos minutos. A abordagem baseia-se na utilização de, C18-partículas hidrofóbicas, que são pré-carregados em um capilar ou dispositivo de microfluidos, e a adsorção da proteína (s) de interesse sobre essas partículas, seguido por digestão enzimática durante a infusão da enzima sobre o de leito fixo e de proteína (s) capturado. Nesta abordagem, o substrato é imobilizada através de interacções não covalentes, e a enzima é infundido através da proteína imobilizada. A eficiência proteolítica digestão é aumentada pelas grandes áreas de superfície de partícula que expõem a proteína para o processamento enzimático, as distâncias e os tempos de difusão de e para a superfície de partículas reduzido, uma melhor transferência de massa, sem ligação covalente que pode afectar a actividade da enzima, a capacidade Avaliado com a rapideze combinações de diferentes enzimas, descartável, e a multiplexação, se o processo é executado num formato de microfluidos. Esta abordagem é demonstrada com o uso de uma mistura de proteínas padrão e tripsina a enzima mais comumente utilizado para a digestão proteolítica antes da detecção ESI-MS. O espectrómetro de massa utilizados para a detecção neste estudo foi um instrumento linear armadilha de quadrupolo (LTQ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação do capilar microrreactor
- Cortar o diâmetro interno 100 um (ID) x 360 uM exterior capilar diâmetro (DO) a um comprimento de 7-8 cm, e a 20 uM ID x 90 um OD capilar de 3-5 cm com o cutelo de capilar em vidro; verificar sob o microscópio que ambas as extremidades capilares têm um corte limpo, em linha reta, sem quaisquer rebarbas salientes.
- Inserir a 20 um x 90 um ID OD capilar para um final de 100 uM ID x 360 uM OD capilar, para um comprimento de ~ 6 mm; em caso de necessidade, observar esta operação sob um microscópio.
- Aplique uma pequena gota de E6000 cola em torno da junção dos 90 mm OD / 100 capilares mm ID com o fim de um Q-tip, e deixe a cola cura O / N à temperatura ambiente.
- Cortar a 20 um x 90 um ID OD capilar inserido com um comprimento de ~ 10-15 mm; este vai ser o emissor de ionização por electropulverização.
- Pré-cortar a 1/32 "OD PEEK, 1/16" PEEK OD e 1/16 "banheira de PTFE ODing em pedaços de 4-5 cm de comprimento; estas serão as mangas utilizados em uniões capilares para fornecer uma conexão livre de vazamento.
- Ligar a extremidade oposta da 100 mm Dl x 360 uM OD capilar para uma união PEEK; usar uma luva 1/32 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
- Inserir / apertar uma peça de ~ 5 cm de comprimento tubagem de PTFE 1/16 "para a extremidade oposta da união.
- Pesar ~ 4 mg de C18 (5 uM), em partículas de um pré-limpos / secos frasco de 2 ml de vidro; adicionar 0,5 ml de isopropanol, fechar o recipiente e dispersar a pasta no banho ultrasonicator.
- Retirar com uma seringa de 250 ul a cerca de 200 pasta ul, inserir a agulha da seringa no "tubo de 1/16 PTFE da união PEEK, e dispensar lentamente a pasta para o 100 mm ID x 360 mm OD capilar; observar ao microscópio como a capilar enche de partículas até um comprimento de 2-3 mm de embalagem é obtida, o que irá ser o micro-reactor (Figura 1) a 20 μ.m ID capilar retém as partículas na micro-reactor por meio de um efeito de distorção. 15
- Lavar o microrreactor com ~ 50 ul de solução de H2O / CH3CN 50:50 v / v, e em seguida, com solução de ~ 50 ul de H2O / CH3CN 98: 2 v / v.
2. Preparação das Soluções Amostra
Nota: As operações que envolvam o manuseamento de solventes e ácidos orgânicos e preparação da solução são para ser executadas numa hotte. Usar óculos, luvas e vestuário de protecção.
- Lavar com CH3OH e secar alguns frascos de vidro (4 mL) e tubos de polipropileno (15 ml).
- Preparar 10 ml de uma solução de H2O / CH3CN (98: 2 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 9,8 ml de H2O com 200 ul de CH3CN; misture com ultra-sons.
- Preparar 10 ml de uma solução de H2O / CH3CN (50:50 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 5 ml de H 2 </ sub> O com 5 ml CH 3 CN; misture com ultra-sons.
- Prepare a 4 ml de uma solução aquosa acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons.
- Prepare a 4 ml de uma solução orgânica acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons.
- Pesar 16 mg de NH 4 HCO 3 com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicionar 4 ml de H 2 O / CH 3 CN: solução (98 2 v / v) e dispersa-se por ultra-sons; isto resulta em uma solução 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) em tampão aquoso.
- Pesar 5 mg de uma proteína padrão (por exemplo, albumina de soro bovino, a hemoglobina α / β, citocromo C, anidrase carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc) com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicione 4 ml wate DIR e dispersar por sonicação; Isto normalmente resulta numa solução de elevada concentração de nível uM.
- Prepare 1 ml de solução de proteína (1-2? M), diluindo a solução de concentração elevada de nível um, com um volume adequado de NH 4 HCO 3 (50 mM), tampão aquoso; misture com ultra-sons.
- Preparar a solução de tripsina (5 ^ M) por dissolução de 20 ug de tripsina de grau de sequenciação-em 170 mL de NH 4 HCO 3 (50 mM), tampão aquoso; dispersar por sonicação.
3. Configuração Experimental
Nota: O sistema LTQ-MS está equipado com uma fonte ESI modificado que inclui uma XYZ-estágio home-construído, que permite a interface do espectrômetro de massa para várias abordagens de entrada da amostra.
- Desligue o microreator capilar a partir da união PEEK e se conectar à PEEK Tee.
- Insira fio Pt A ~ 2 cm de comprimento no lado-braço do PEEK T; utilizar uma "manga PEEK 1/32 para fornecer umaconexão e para o isolamento do fio Pt livre de vazamento.
- Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para a extremidade oposta do PEEK T; usar uma luva 1/32 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
- Fixe o Tee PEEK na XYZ-stage e posicione o ESI emissor ~ 2 mm de distância da massa capilar de entrada espectrômetro.
- Ligue o fio de Pt à fonte de alimentação de energia ESI do espectrômetro de massa.
- Ligar a extremidade oposta do capilar de transferência de amostras para a união de aço inoxidável; usar uma luva 1/16 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
- Conectar um 4-5 cm de comprimento "1/16 tubagem de PTFE para a extremidade oposta da união de aço inoxidável e inserir a agulha da seringa de 250 ul na tubagem de PTFE; ligar a bomba e ajustar a taxa de fluxo no valor desejado (por exemplo, 2 ul / min).
- em tandem entrada parâmetros MS de aquisição de dados para o pacote de software que controla o instrumento de MSd salvar como um arquivo método para pronta a configuração para realizar a análise; para o sistema LTQ-MS, use os parâmetros de análise dependentes seguintes dados: a exclusão dinâmica habilitado para 180 segundos com largura de massa exclusão ± 1,5 m / z; uma MS varredura seguido por um zoom e MS 2 varreduras em 5 melhores picos mais intensos, aumentar a largura de digitalização ± 5 m / z; dissociação induzida por colisão (CID) parâmetros definidos no isolamento largura de 3 m / z, energia de colisão normalizada de 35%, a activação Q 0.25, e tempo de activação 30 ms.
4. Setup Microfluidic
- Preparar um dispositivo de microfluidos de vidro ou substratos poliméricos; 16-18 a disposição do dispositivo é fornecida na Figura 2A, que consiste de um micro-reactor (1) (0,13 mm Comprimento largura x 2 mm x 50 mm de profundidade) ligada a uma entrada (2 ), saída (3) e uma porta lateral (4); os canais comunicantes para manipulações são fluídicos ~110 uM de largura e ~ 50 mm de profundidade; uma estrutura de múltiplos canais (5), que consiste em ~ 1,5-2 uM de profundidade x 10 m de largura x 100 mm de comprimento colocados microcanais de 25 um para além, irá actuar como um filtro para a retenção das partículas no microrreactor.
- Ative as conexões de fluido de entrega para o chip por meio de colagem conectores especializados para as portas de entrada, ou através da elaboração de um suporte polimérico que acomoda acessórios para fornecimento de fluido (Figura 2B). 16
- Prepara-se uma pasta fluida de partículas de C18 (5 uM) tal como descrito no passo 1.8; fornecer a pasta para o micro-reactor com uma seringa usando 1/16 "tubagem de PTFE ligado à porta lateral do chip (4); selar a porta após o carregamento de partícula com cola epóxi e cura durante 1 hora num forno a 90 ° C 16.
- Inserir um capilar (20 uM ID x 90 um comprimento OD x 10 mm) no orifício de saída, selar com cola E6000, e deixar cura S / N; isso vai se tornar o emissor ESI (
- Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para o orifício de entrada do chip (2); ligar a extremidade oposta do tubo capilar a uma seringa de 250 ul e a bomba de seringa, tal como descrito em 3,6-3,7.
- Coloque um leve conector PEEK T na linha de transferência de amostras imediatamente antes da abertura de entrada (2) e inserir um fio de Pt sobre o lado do braço do T, como descrito no ponto 3.2; este será o eletrodo ESI.
- Fixar o dispositivo de microfluidos na fase XYZ com o emissor ESI posicionado ~ 2 mm de distância do capilar massa espectrómetro de entrada; preparar a MS para análise tal como descrito em 3.8.
5. Amostra de carregar, digestão proteolítica e eluição por análise por MS
Nota: Todos os passos de transferência de solução / amostra são realizadas com o auxílio de uma bomba de seringa e deveria permitir a alguns minutos adicionais para completar, para compensar os mortos-volumes associados com as linhas de transferência de e para o micro-reactor; o tempo necessário dependerá das taxas de fluxo envolvidos.
- Lavar o microrreactor e prepará-la para a análise por infusão de uma solução aquosa de NH 4 HCO 3 (50 mM) em H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
- Carregar a amostra de proteína (1 uM) no micro-reactor por infusão da solução de amostra a 2 mL / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
- Infundir a solução de tripsina (5 uM) sobre a proteína adsorvida no micro reactor em 2 ul / min durante 1-3 min.
- Extingue-se o processo de digestão proteolítica, por lavagem do micro-reactor com uma solução aquosa acidificada de TFA (0,01% v / v) em H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
- Iniciar eluindo a digestão de proteínas a partir do micro-reactor por infusão de uma solução orgânica acidificada de TFA (0,01%v / v) em H2O / CH3CN (50:50 v / v) em 300 nl / min.
- Ligue o processo de aquisição de dados de MS e a voltagem ESI (~ 2000 V); adquirir dados de MS, utilizando os parâmetros de aquisição de dados fornecidos no passo 3.8; observar a eluição dos péptidos trípticos.
6. Processamento de Dados
- Processar os dados em tandem MS com um motor de busca compatível com o formato de dados MS-primas.
- Processar os arquivos raw LTQ-MS, utilizando um organismo banco de dados específico de proteína minimamente redundantes; fazer o upload dos dados brutos no motor de busca, definir as tolerâncias de massa pai e de iões fragmento a 2 e 1 Da, respectivamente, e usar apenas fragmentos totalmente trípticos com até dois perderam clivagens para a busca; não permitem modificações pós-translacionais; definir os de média e alta confiança falsos taxas de detecção (FDR) para 1% e 3%, respectivamente, e não permitem modificações pós-translacionais.
- Filtrar os dados para selecionar apenas de alta confiançapéptido corresponde às proteínas na base de dados; avaliar os resultados de proteína e de nível de péptido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um resultado representativo de um processo de digestão proteolítica realizado simultaneamente com uma mistura de proteínas, com os micro-reactores acima descritos (Figuras 1 ou 2), é fornecida na Tabela 1. A tabela compreende as sequências de péptidos únicas que identificam uma proteína em particular, a cruz o resultado de correlação (Xcorr) (isto é, uma pontuação que caracteriza a qualidade do jogo experimental-a-teórica para o espectro de massa em tandem correspondente), o número de clivagens perdidas, o estado de carga de péptidos (Z), e a massa / carga ( m / z) dos péptidos protonados. Ao nível da proteína, a tabela proporciona a identificação da proteína UniProt, a descrição (nome) da proteína, o marcador da proteína e a proteína de cobertura. Todas as proteínas foram identificados por vários péptidos, após uma digestão proteolítica realizada durante 90 seg.
O tempo necessário para aeluição de todos os péptidos era dependente do comprimento da transferência capilar que entregue a solução orgânica acidificada a 300 nl / min, uma taxa de fluxo compatível com uma exploração óptima nano-ESI. Em capilar mistura das soluções aquosas e orgânicas acidificadas resultou na eluição precoce de alguns péptidos, mas a grande maioria eluída ao longo de vários minutos, apenas na solução orgânica. Um espectro de massa mostrando a co-eluição de vários péptidos representativos das cinco proteínas, gerados com o microrreactor capilar, é fornecido na Figura 3.
Tabela 1. Lista de peptídeos trípticos gerados através da digestão proteolítica de cinco proteínas utilizando o microreator capilar e protocolos de digestão O / N. Apenas sequências únicas, com a maior Xcorr, são apresentados. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Figura 1. capilar microrreactor. (A) de configuração experimental para a fabricação do micro-reactor. Micro-reactor (B) capilar posicionado na fonte de iões de MS. O micro-reator é carregado manualmente com partículas de sílica C18-ligados e colocados em uma XYZ-estágio que facilita o posicionamento adequado na fonte ESI-MS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. microreator Microfluidic. (A) Diagrama esquemático do reator microfluídico. (B) reactor Microfluidic protegidos em um estande PEEK. O reactor de um microfluidosnd linhas de transferência são fabricados em um substrato de vidro que pode ser fixado em um PEEK polimérica caseira ficar para mais de posicionamento na fonte MS com a fase XYZ. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Espectro de massa compreendendo peptídeos trípticos gerados a partir da mistura de proteína submetida a proteólise no microreator. Os mais intensos os iões peptídicos trípticos são rotulados com a sequência de aminoácidos eo identificador de proteína correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O microreator descrito neste trabalho fornece um fácil de implementar configuração experimental para a realização de digestão enzimática de proteínas para permitir a análise MS e identificação em menos de 30 min. As vantagens deste sistema, em comparação com métodos convencionais, incluem a simplicidade, a velocidade e baixo consumo de reagentes e baixo custo. Em particular, não há necessidade de caros esferas de tripsina imobilizada e os cartuchos. A preparação do microreator capilar é simples (Figura 1A), e pode ser realizado em poucos minutos a partir de fontes padrão, comumente encontrados em um laboratório de cromatografia. Enquanto as partículas de C18 de fase invertida pode ser lavado com solvente de elevado orgânica com conteúdos (CH 3 CN ou CH 3 OH) para a remoção completa das proteínas adsorvidas ou péptidos, e a micro-reactor pode ser re-utilizada, o processo de fabrico fácil e de baixo custo convida para a fabricação de unidades descartáveis para uso único applicções. O microrreactor capilar pode ser montado em uma fonte de ESI-casa construída, conforme mostrado na Figura 1B, ou pode ser inserida numa fonte de iões padrão comercial. Enquanto que o leito de partículas para a captura e digestão da amostra não necessita de ser superior a ~ 1-2 mm, apenas o suficiente para capturar o material suficiente para uma detecção óptima por MS, o comprimento do próprio capilar pode ser ajustado de acordo com o tamanho de qualquer nomeadamente fonte de iões.
Para laboratórios que têm capacidades para fabricar dispositivos de microfluidos, um design simples (Figura 2A) que pode ser fixada em um suporte para facilitar a interface para o MS de detecção (Figura 2B) é fornecida. As dimensões dos canais e do micro-reactor de transferência pode ser ajustada para os requisitos de uma aplicação particular, e o dispositivo pode ser desenvolvido em um formato simples ou multiplexada. Para a maioria dos espectrómetros de massa comercial, no entanto, a fonte de iões seria necessário para permitir modificações the a colocação do dispositivo na fonte. O desenho photomask para a fabricação de chips foi executado com o software AutoCAD eo photomask foram preparados por HTA fotomáscara. O fabrico de microchips foi realizada de acordo com os protocolos descritos anteriormente: 17,18 alinhamento do substrato com a foto-mascara, a exposição à luz UV (360 nm), a remoção do fotorresistente irradiado e cromo camada subjacente, o ataque químico molhado com tampão de canais etch óxido, a remoção da camada de cromo restante, a perfuração de orifícios de acesso, a limpeza, a hidrólise da superfície da micropastilha (NH 4 OH + H 2 o 2), e a ligação térmica do substrato à placa de cobertura por aquecimento gradual até 550 ° C. Ambos placa substrato e cobertura foram gravadas, uma para canais profundos para o manuseamento da amostra (~ 20-50 mm), e outro para elementos filtrantes micro-canais rasos (1,5-2 ^ m de profundidade). 16
Os resultados gerados com o IA acima descritocroreactor são comparáveis com os resultados obtidos a partir de O / N, 19 protocolos convencionais de digestão que utilizam substrato: enzima de rácios de (50-100): 1, seguido por uma experiência de infusão de péptido com o MS de detecção (300 nl / min, os péptidos dissolvidos em H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v), acidificada com CH3COOH, 0,1% v / v). Ambos microreator e protocolos convencionais possibilitou a identificação de todas as proteínas por vários peptídeos únicas (Tabela 1). Normalmente, um número um pouco maior de péptidos únicos por proteína eram observáveis com o microreator do que com a configuração convencional. Este foi um resultado de clivagem enzimática incompleta em certos locais. Poucos minutos adicionais de digestão proteolitica reduzida ou eliminada este resultado. Além disso, alguns péptidos enzimáticos gerados com o microrreactor diferiram dos gerados em solução, devido ao fato de que, para as proteínas adsorvidas sobre as partículas C18 locais diferentes foram expostas a enzima tHan em soluções homogéneas 20. As pontuações Xcorr demonstram, no entanto, que a qualidade dos espectros de massa em tandem gerado com o micro-reactor era de alta qualidade, e que uma sequência de proteína de cobertura suficiente (11-75%) é possível para identificação de proteínas não ambíguas .
A técnica, como descrito, está limitada à análise de misturas de proteínas bastante simples que geram a maior parte dos ~ 25-50 péptidos que podem ser analisadas por experiências de infusão simples e que não necessitam de separação cromatográfica líquida antes da análise por MS. É crítico para o sucesso do uso de soluções de tripsina recém-descongeladas e preparadas, para não perder ou reduzir a actividade da enzima proteolítica a um pH de funcionamento do micro-reactor (isto é, pH ~ 8). Além disso, um equilíbrio adequado deve ser encontrado entre as taxas de fluxo óptimas para ionização por electropulverização (150-300 nl / min) e as taxas de fluxo máxima que pode ser tolerada pela configuração experimental e que permitemeluição rápida péptido do micro-reactor (2-3 ul / min). Mais elevada do que as taxas de fluxo ESI ideais resultar em perdas de sensibilidade e limites de detecção pobres. Como resultado, o comprimento dos capilares de transferência deve ser mantido tão curto quanto possível para reduzir o tempo necessário para a eluição dos péptidos a partir do micro-reactor, quando operando em ≤300 nl / min. Todos os componentes que foram utilizados para a instalação experimental podem ser substituídos por componentes de outros fabricantes que executam funções semelhantes. Se as características dimensionais diferem destes componentes (comprimento, diâmetro, em volume), a optimização da taxa de fluxo de eluente, concentração da amostra, o tempo para a realização de certas etapas e da tensão de ESI pode ser necessária para obter resultados semelhantes.
Uma vantagem única activada pela configuração de microfluidos é a capacidade de incorporar adicionalmente no chip de um sistema de bombagem, por exemplo, uma bomba de fluxo electro dirigido, 21,22 para permitir que o suporte-aluma operação da plataforma e a integração de um passo adicional de separação. A capacidade de realizar separações on-chip dos péptidos gerados através da digestão proteolítica resultará em limites de detecção melhorados, e vai facilitar a análise de misturas complexas de proteínas a partir de extractos celulares. Isto irá permitir ainda mais a integração da técnica em fluxos de trabalho que fazem uso de plataformas microfabricated e detecção de MS de alta velocidade para aplicações biomédicas. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
