हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblasts पैदा करने के लिए एक सरल और त्वरित प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है। प्रक्रिया विशेष पशु प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से fibroblast संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्राथमिक कोशिकाओं ऊतकों से सीधे प्राप्त कर रहे हैं और स्थापित सेल लाइनों से विवो में कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति के अधिक प्रतिनिधि होने के लिए लगा रहे हैं। हालांकि, प्राथमिक सेल संस्कृतियों आम तौर पर एक परिमित जीवन काल है और बार-बार फिर से स्थापित किए जाने की जरूरत है। Fibroblasts प्राथमिक कोशिकाओं के एक आसानी से सुलभ स्रोत हैं। यहाँ, हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल और त्वरित प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर चर्चा की। प्रोटोकॉल के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का सावधानी से पालन किया जाता है, संदूषण कुछ मामलों में विस्तारित समय के लिए भंडारित गैर बाँझ ऊतक के उपयोग के बावजूद घटित होने की संभावना नहीं है। Fibroblasts संस्कृति में तेजी से पैदा और replicative वार्धक्य से गुजरने के पहले पर्याप्त संख्या का विस्तार किया जा सकता है।
प्राथमिक कोशिकाओं में इन विट्रो की शर्तों के तहत ऊतक और सुसंस्कृत रहने से निकाली गई है। यह आम तौर पर प्राथमिक कोशिकाओं को और अधिक बारीकी से शारीरिक स्थिति और वे अमर या ट्यूमर सेल लाइनों 1 से शुरु हुआ, जिसमें से ऊतक के आनुवंशिक पृष्ठभूमि के समान माना जाता है कि। कारण है कि, प्राथमिक कोशिकाओं जैविक सवालों 2,3 के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनिश्चित काल के बढ़ने कि स्थापित सेल लाइनों के विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं अंततः संस्कृति में वार्धक्य से गुजरना है और अक्सर फिर से स्थापित किए जाने की जरूरत है।
आमतौर पर इस्तेमाल किया प्राथमिक कोशिकाओं फ़ाइब्रोब्लास्ट, उपकला कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDC) शामिल हैं। Fibroblasts अक्सर प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। वे अन्य प्राथमिक कोशिकाओं से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। सेल संस्कृतियों आसानी से आसानी से बनाए रखा है, की स्थापना की और कोई purifica की आवश्यकता होती हैसंस्कृति के लिए पूर्व कोशिकाओं के tion। वे तेजी से प्रारंभिक प्रसार और विशेष मध्यम या सक्रियण प्रोटोकॉल के लिए कोई आवश्यकता है। Fibroblasts कुशलता से जैविक, रासायनिक और भौतिक प्रोटोकॉल 4,5 का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता। सेल संस्कृतियों की स्थापना करने से पहले आरटी पर अप करने के लिए 10 दिनों के लिए कान की दुकान करने की संभावना है। Fibroblast संस्कृतियों साइटोप्लास्मिक प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए अनुकूल और प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं 6 में reprogramming के लिए उपयुक्त हैं।
Fibroblasts कोलेजन प्रोटीन और बाह्य मैट्रिक्स 7 छिपाना कि संयोजी ऊतक के महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं। वे कई ऊतकों 8 में संरचनात्मक ढांचा प्रदान करते हैं और घाव भरने और ऊतकों की मरम्मत 9,10 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं।
यहाँ, हम fibroblast कान से संस्कृतियों और चूहों 11 की पूंछ की स्थापना के लिए एक सरल और त्वरित (<4 घंटा) प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल न्यूनतम माउस की आवश्यकता हैअनुभव (अन्य प्रोटोकॉल 12,13 के विपरीत) ऊतकों फसल के लिए और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर माध्यम में संग्रहित कान से संस्कृतियों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यहाँ हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल, सस्ता और तेज प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करते हैं। निकासी के ऊतक के 3 दिन बाद अलगाव के भीतर पक्षपाती और तेजी से विभाजि…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
Scissors | Aesculap | ||
Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
Water bath | GFL | 1002 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |