Summary
Vi beskriver en enkel og hurtig eksperimentelle procedure til generering af primære fibroblaster fra ørerne og haler af mus. Proceduren kræver ikke særlig dyretræningssystem og kan anvendes til generering af fibroblastkulturer fra ører opbevaret ved stuetemperatur i op til 10 dage.
Abstract
Primære celler er afledt direkte fra væv og menes at være mere repræsentativ for den fysiologiske tilstand af celler in vivo end etablerede cellelinjer. Men primære cellekulturer har normalt en begrænset levetid og skal ofte genetableres. Fibroblaster er en let tilgængelig kilde til primære celler. Her diskuterer vi en enkel og hurtig eksperimentelle procedure for at etablere primære fibroblastkulturer fra ører og haler af mus. Protokollen kan bruges til at etablere primære fibroblastkulturer fra ører opbevaret ved stuetemperatur i op til 10 dage. Når protokollen er omhyggeligt fulgt, er usandsynlig på trods af anvendelsen af ikke-sterilt væv opbevares i længere tid i nogle tilfælde forureninger. Fibroblaster formere sig hurtigt i kultur og kan udvides til et betydeligt antal før de undergik replikativ senescens.
Introduction
Primære celler er afledt af levende væv og dyrkes under in vitro betingelser. Det er almindeligt antaget, at primære celler mere ligner fysiologiske tilstand og den genetiske baggrund af det væv, hvorfra de stammer end udødeliggjorte eller tumorcellelinier 1. Af denne grund udgør primære celler en nyttig model til undersøgelse af biologiske spørgsmål 2,3. Men i modsætning til etablerede cellelinjer, der vokser i det uendelige, primære celler til sidst undergår ældning i kultur og skal ofte genetableres.
Almindeligt anvendte primære celler indbefatter fibroblaster, epitelceller, endotelceller, T-celler, B-celler, knoglemarv-afledte makrofager (BMDM) og knoglemarv-afledte dendritiske celler (BMDC). Fibroblaster er ofte anvendes som primær cellekultur model. De tilbyder vigtige fordele frem for andre primære celler. Cellekulturer let etableres, let vedligeholdes og kræver ingen rensningsmedietion af celler før dyrkning. De har hurtig indledende spredning og ingen krav om specialiserede medium eller aktivering protokoller. Fibroblaster kan effektivt transficeres ved hjælp af biologiske, kemiske og fysiske protokoller 4,5. Der er en mulighed for at lagre ører i op til 10 dage ved stuetemperatur forud for etableringen af cellekulturer. Fibroblastkulturer er fremmende for visualisering af cytoplasmatiske og egnet til omprogrammering ind induceret pluripotente stamceller (IPS) celler 6.
Fibroblaster er vigtige celler i bindevæv, der udskiller kollagen proteiner og ekstracellulære matrix 7. De giver de strukturelle rammer i mange væv 8 og spille en væsentlig rolle i sårheling og væv reparation 9,10.
Her beskriver vi en enkel og hurtig (<4 timer) protokol til at etablere fibroblastkulturer fra ører og haler af mus 11. Protokollen kræver minimal musoplevelse at høste væv (i modsætning til andre protokoller 12,13) og kan bruges til at etablere kulturer fra ørerne lagret i medium ved stuetemperatur i op til 10 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musene blev opstaldet i patogenfrie betingelser i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier indtil euthanization (Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer på National University of Singapore og det nationale rådgivende udvalg for Laboratory Animal Research (NACLAR) retningslinjer).
1. Mus
- Bestil en mus af den passende genetisk baggrund. Denne protokol er baseret på væv afledt fra en C57BL / 6 mus.
2. Fremstilling af komplet medium
- Forbered komplet medium ved tilsætning af følgende bestanddele til Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium: 10% føtalt kalveserum (FCS), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 uM asparagin, 2 mM glutamin, 1% penicillin-streptomycin-opløsning.
3. Udarbejdelse af enzymopløsninger
- Collagenase D opløsning i en 15 ml konisk bund rør forberede.
- Der afvejes 10 mg collagenase D. Dissolve collagenase D i 4 ml komplet medium.
- Forbered pronaseopløsning i en 1,7 ml mikrocentrifugerør.
- Der afvejes 10 mg pronase.
- Tilsæt 5 pi 1 M Tris-buffer (pH 8,0). Tilsæt 1 pi 0,5 M EDTA (pH 8,0).
- Fyld med 494 ul sterilt vand.
- Inkuber pronaseopløsning ved 37 ° C i et vandbad i 30 minutter.
4. Fremstilling af collagenase D-pronase Mix (≤2 Tails)
Bemærk: Udfør de efterfølgende trin i en steril cellekultur hætte.
- Tilsæt 250 pi pronaseopløsning til 4 ml collagenase D opløsning.
- Passere collagenase D-pronase blandingen gennem en 0,2 um sprøjtefilter i en steril 15 ml konisk bund rør.
5. Udvinding af fibroblaster fra øre og hale Væv
- Aflive mus i henhold til de relevante institutionelle retningslinier.
- Placer autoklaveres kirurgiske instrumenter (sakse og tænger) i cellekultur hætte.
- Der tilsættes 10 ml komplet medium i to 10 cm cellekultur retter hver.
- Skær ører (~ 1 cm radius) og 5 cm af halen (fra spidsen af halen) af en mus med en saks og inkuberes i 5 minutter i 40 ml 70% ethanol i en steril 50 ml konisk bund rør.
- Lufttørre ører og hale ved at anbringe dem i en åben 10 cm celledyrkningsskål i hætten i 5 minutter. Når tørret, overførsel øre og hale stykker til to dyrkningsskåle mærket "ører" og "hale", der indeholder 10 ml komplet medium som beskrevet i trin 5.3.
- Fjerne hår fra ørerne og hale ved hjælp af en saks.
- Skær ører og hale i stykker mindre end 3 mm i størrelse med en saks.
- Overfør de afskårne væv i 1,8 ml cryotube hætteglas mærket "ører" og "hale", og tilføj tilstrækkelig collagenase D-pronase løsning for volumen for at nå 1,8 ml mærket på hætteglasset.
- Psnøre de cryotube hætteglas vandret på et rysteapparat og rystes prøverne ved 200 rpm i 90 min ved 37 ° C.
- Efter 90 minutters inkubation, fjern cryotube hætteglas fra shaker og placere hætteglassene i hætten.
- Der tilsættes 10 ml komplet medium i to 10 cm cellekultur retter, mærket "ører" og "hale" hver, og sætte en 70 um cellefilter i hver skål.
- Placer de fordøjede øre og hale væv i 70 um cellefilter i overensstemmelse hermed mærkede retter tilberedt i trin 5.11 og kraftigt slibe væv ved hjælp af en 10 ml sprøjte stempel til> 5 min. Ryst cellefilter lejlighedsvis i mediet for at vaske celler ud af cellen si.
- Pipettere cellesuspensionen fra hver skål i to 15 ml koniske bund rør mærket "ører" og "hale". Vask skål og si med yderligere 10 ml fuldstændigt medium og tilsæt mediet til de relevante 15 ml koniske bund rør.
- Spin ned cellensuspension til 7 minutter ved 580 xg ~ og 4 ° C under anvendelse af en afkølet centrifuge celle.
- Fjern supernatanten, tilsættes 10 ml komplet medium til cellepelleten i de 15 ml konisk bund rør og resuspender cellerne.
- Gentag trin 5.14 og 5.15.
6. Dyrkning af celleblanding
- Fjern supernatanten. Sørg for, at cellepelletten forbliver uforstyrret.
- Resuspender celler i 10 ml komplet medium og tilsæt blandingen til respektive to 10 cm cellekulturskåle mærket "ører" og "hale".
- Tilsæt 10 pi amphotericin B-opløsning (stamopløsning: 250 ug / ml) til kulturen.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
- På den tredje dag, udskiftes mediet med 10 ml frisk komplet medium indeholdende 10 pi amphotericin B for at fjerne debris (figur 1 og 2).
7. subkultur af fibroblaster
- Fastsatten kulturen når ca. 70% konfluens (dag 3-4 kulturens) fjernes mediet og vask af cellerne med 5 ml sterilt 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Fjern PBS, og der tilsættes 2 ml sterilt 1x trypsin-EDTA-opløsning til cellerne.
- Inkubér cellerne i 5 minutter ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
- Efter 5 min, skal du trykke forsigtigt dyrkningsskålen og tilsæt 6 ml komplet medium til cellerne.
- Overfør cellesuspensionen til en 15 ml konisk bund rør og spin røret i 5 minutter ved 450 xg ~ og 4 ° C under anvendelse af en afkølet centrifuge celle.
- Fjern supernatanten, og forsigtigt igen suspendere cellepelleten i 5 ml komplet medium.
- Seed 2 x 10 5 celler i en 10 cm celledyrkningsskål og inkuberes cellerne ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2 inkubator i 3-4 dage før gentage trin 7,1-7,6.
8. Udarbejdelse af Ører til forsendelse
Bemærk: Udfør than efterfølgende trin i en steril cellekultur hætte.
- Aflive mus i henhold til de relevante institutionelle retningslinier.
- Placer autoklaveres saks og pincet i cellekultur hætte.
- Der tilsættes 50 ml komplet medium i en 50 ml konisk bund rør.
- Skær ører (~ 1 cm radius) af en mus med en saks.
- Overfør ørerne i 50 ml koniske bund rør (som fremstillet i trin 3) ved hjælp af pincet.
- Forsegl 50 ml konisk bund rør med parafilm før forsendelse ved RT i en passende kasse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekstraktion af fibroblaster fra væv resulterer i en betydelig mængde vævsrester (figur 1). I modsætning til væv vragrester, fibroblaster overholde væv kultur plastoverflader mellem dag 1 og 3 i kultur. Mediet af fibroblastkulturer kan sikkert ændret på dag 3 af kultur, der formodes at nedsætte mængderne af affald til stede i kulturen (figur 2). Fibroblaster vise en aflang morfologi og et klart synligt cytoplasma (figur 1 og 2). Mitotiske celler bør være til stede fra dag 3 af kultur og fremefter og celler bør nå 70-80% af cellekonfluens inden for 3-4 dage efter kultur. Udbyttet fra øre og hale væv i en 10 cm dyrkningsskål varierer fra 4 til 5 x 10 5 (ører) og 5 til 6 x 10 5 celler (hale) på dag 3 af kultur. Efter den tredje dag i fibroblaster isoleret, kan cellerne passeres og podes ved 2 x 10 5 celler pr 10 cm dyrkningsskål.
Ekstraktion af fibroblaster fra ører opbevaret ved stuetemperatur i 10 dage bør resultere i 70-80% cellekonfluens indenfor 5 til 6 dages dyrkning (figur 3). Podning af cellerne ved 2 x 10 5 celler pr 10 cm dyrkningsskål efter dag 5 bør også give anledning til ca. 1 x 10 6 celler inden for 3-4 dages dyrkning. Langtidsopbevaring påvirker ikke den tid, det tager for fibroblaster til at indtaste ældning i vores erfaring (data ikke vist).
For at kontrollere identiteten af celler efter 3 dages kultur, kan celler mærkes for fibroblaster markør vimentin 14. Ved hjælp af ovennævnte protokol, vi rutinemæssigt opnå rene fibroblastkulturer som angivet med vimentin farvning (figur 4).
Figur 1. Fibroblast kultur på dag 3 efter udvinding inden ændringen af mediet.Repræsentative lyse felt billeder af cellerester (hvide pile) til stede på dag 3 af kultur. Billeder blev taget til fange ved 100 × forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop. Skalaen søjle repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fibroblast kultur på dag 3 efter udvinding efter tilsætning af nye medie. Repræsentative lyse felt billeder af fibroblaster på dag 3 i kultur. Billeder blev taget til fange ved 100 × og 320 × forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop. Skalaen søjle repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fibroblast kultur på dag 3 efter ekstraktion fra øres væv opbevaret ved stuetemperatur i 10 dage. Repræsentative lysfelt billeder af fibroblaster på dag 3 i kultur. Billeder blev taget til fange ved 100 × og 320 × forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop. Skalaen søjle repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mærkning af fibroblastkulturer for vimentin. Repræsentant konfokal billede af øre og hale fibroblaster på dag 3 af kultur. Fibroblaster ekstraheret fra vævene blev mærket i vimentin (rød) og DAPI (blå). De fluorescerende billeder blev erhvervet af konfokale mikroerkopi. Skalaen søjle repræsenterer 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi en enkel, billig og hurtig eksperimentelle procedure for at etablere primære fibroblastkulturer fra ører og haler af mus. Ekstraktionen bør resultere i adhærente og hurtigt delende fibroblaster inden for 3 dage efter isolering af vævet. En vigtig begrænsning af primærelementer er degeneration, en permanent vækst anholdelse 15. Under anvendelse af protokollen, kan fibroblastkulturer passeres i 5 til 6 gange før fibroblaster bliver aldrende, angivet ved udfladning af celler, vokse i størrelse (2-3 gange stigning) og manglende ekspandere.
Ved udførelse isolering af fibroblaster, skal der betales opmærksomhed under afbrydelse af væv, som utilstrækkelig skæring eller fordøjelse vil resultere i lav inddrivelse af fibroblaster. Det er muligt at samle de øre og hale fibroblaster for at øge antallet af fibroblaster. Yderligere væv, herunder peritoneal og lungevæv behandles på samme måde kan tilsættes for at forøge tHan antallet af fibroblaster. Selvom vragrester er til stede i kulturen efter fibroblaster udvinding, anbefales det at skifte mediet først efter den tredje dag som fibroblaster tager tid at holde sig til cellekultur retter.
En potentiel begrænsning af protokollen er anvendelsen af ikke-sterile væv og associeret mulighed for mikrobiel kontaminering. For at reducere risikoen for forurening, er ører og hale inkuberet i 70% ethanol før høst af fibroblaster. Endvidere tilsættes det antifungale amphotericin B til den primære kultur for at forhindre udvækst af gær og svampe, et almindeligt problem, når oprettelse fibroblastkulturer. Mediet indeholder også penicillin og streptomycin for at forhindre bakteriel forurening. Ved hjælp af disse forholdsregler, er forureninger sjældent observeres, selv når oprettelse fibroblaster fra ører og haler, der blev holdt ved stuetemperatur i flere dage.
Et af de vigtigste fordele ved denne protokol er abiltet til at generere fibroblaster fra ører, der blev opbevaret i medium ved stuetemperatur i op til 10 dage før fibroblaster isolation. Vi observerede en beskedent reduceret effektivitet i etableringen øre fibroblast kultur efter 10 dages opbevaring (70-80% konfluens er nået inden for 5-6 dage sammenlignet med 3-4 dage for frisk isoleret væv). Derfor kan ører af mus udveksles af forskere ved hjælp af standard shipping, selvom anbefales Express forsendelse. Det er vores erfaring, at brugervenligheden få ører og det faktum, at vævet sjældent bruges til forsøg procedurer ofte giver adgang til væv af genetisk modificerede mus, der kan være tidskrævende at få noget andet. For haler effektivitet inddrive fibroblaster efter opbevaring kan variere meget, og haler bør kun anvendes, hvis ører er ikke tilgængelige for forsendelse. Endelig bør de fleste mennesker kunne udføre protokollen, da høsten af væv kræver minimal ekspertise og uddannelse i håndtering af mus.
Protokollen er kun blevet testet ved hjælp af musen væv, men bør i teorien tillade dannelsen af fibroblastkulturer hjælp af væv fra andre arter Selv om protokollen kan kræve yderligere optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D.
- Guo, S., Dipietro, L. A.
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
