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Biology

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

doi: 10.3791/53568 Published: December 28, 2015

Abstract

L'art de la production de protéines recombinantes avec des modifications post-traductionnelles complexes représente un défi majeur pour les études de structure et la fonction. La mise en place rapide et de récupération élevés de lignées cellulaires de mammifères transitoirement transfectées aborde cette barrière et est un moyen efficace d'exprimer des protéines qui sont naturellement acheminée par le ER et Golgi voie de sécrétion médiée. Voici un protocole pour l'expression de protéine en utilisant la HEK293F humain et des lignées de cellules transfectées HEK293S avec un vecteur d'expression de mammifère destiné à des rendements élevés de protéines. L'applicabilité de ce système est démontrée en utilisant trois glycoprotéines représentatives qui ont exprimé avec des rendements entre 95-120 mg de protéine purifiée récupérée par litre de culture. Ces protéines sont le FcyRIIIa humain et la sialyltransférase α2-6 de rat, ST6GalI, tous deux exprimés avec une fusion GFP N-terminale, ainsi que l'immunoglobuline humaine non modifiée G1 Fc. Cette robustes uti systèmeLizes un milieu exempt de sérum qui peut être adapté pour l'expression de protéines et d'hydrates de carbone pour des études structurales par spectrométrie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire isotopiquement enrichis. En outre, la composition du N-glycane peut être réglée par addition d'une petite molécule pour empêcher certaines modifications glycanniques d'une manière qui ne réduit pas le rendement.

Introduction

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Produire des rendements élevés de protéines humaines pliées de manière appropriée et modifications post-traductionnelles pour l'analyse détaillée de la structure et de la fonction demeure un défi important. Un grand nombre de systèmes d'expression sont disponibles qui produisent des protéines recombinantes avec fonction native-like et le comportement. Systèmes d'expression bactériens, principalement des souches d'Escherichia coli, représentent les outils les plus accessibles et couramment utilisés dans le domaine de la recherche, en raison de la simplicité de ces systèmes d'expression, bien que la levure, des plantes, les insectes et les mammifères sont également décrits 1-4. Cependant, la plupart de ces systèmes sont incapables de modification post-traductionnelle appropriée des protéines cibles. Un intérêt fondamental des laboratoires Barb et Moremen est la production de protéines eucaryotes avec une glycosylation appropriée. Beaucoup de protéines humaines exigent glycosylation appropriée pour le bon fonctionnement (voir 5).

Le eucaryotemachines de glycosylation est vaste et capable de faire un large éventail de modifications, incluant à la fois l'asparagine (N) - et de la sérine / thréonine (O) lié en glycanes complexes 6. On estime que> 50% des protéines humaines sont N-glycosylées 7. Glycanes sont des composantes essentielles de nombreuses protéines, y compris des anticorps thérapeutiques monoclonaux, l'érythropoïétine, et les facteurs de coagulation du sang comme le facteur IX, pour ne nommer que quelques-uns. Bien que plusieurs méthodes existent pour préparer des protéines convenablement N-glycosylée et vont de purement synthétique 8-10, 11-14 à chimioenzymatiques ou la récupération de systèmes recombinants d'ingénierie 15-20, sans surprise, des systèmes d'expression humains ont jusqu'ici avéré être le plus robuste des procédés pour générer des protéines humaines.

De nombreuses glycoprotéines humaines thérapeutiques sont produits dans des systèmes recombinants en utilisant des cellules de mammifères. Systèmes de la note sont l'ovaire de hamster chinois (CHO), myélome de souris (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), de rein embryonnaire humain (HEK-293) et des lignées de cellules rétiniennes humaines qui sont utilisés dans l'adhésion ou de la suspension de culture pour la production de protéine 4,21,22. Cependant, les systèmes d'expression de protéines de mammifère ont nécessité la production de lignées cellulaires stables, des milieux de croissance et le substrat coûteuses procédures de transfection assistée 23.

La transfection de cellules de mammifère est obtenue à l'aide de nombreux agents, y compris les phosphates de calcium, les polymères cationiques 24,25 (DEAE-dextrane, le polybrène, la polylysine, polyéthylimine (PEI)) ou des liposomes cationiques chargés positivement 26-29. PEI est un polycationique, chargé, linéaire ou ramifié en polymère (25 kDa) 26 qui forme un complexe stable avec l'ADN et est endocytose. Lors de l'acidification de l'endosome, PEI est pensé pour gonfler, ce qui conduit à la rupture des endosomes et la libération de l'ADN dans le cytoplasme de 26,30.

Jusqu'à récemment, la transfection transitoire dans suspensila culture a été réalisée par la formation du complexe ADN / PEI avant suivie de l'addition à la culture de cellules 29. Cependant, Würm et ses collaborateurs ont rapporté un protocole est performant optimisé pour une production de protéines recombinantes dans des cellules HEK293 qui ont formé un complexe ADN / PEI in situ 31,32. Ceci évite préparation, la stérilisation du complexe, et l'échange de tampon dans un milieu de culture. Poursuite de l'optimisation en incluant des plasmides d'expression amélioration conduit à une augmentation significative de rendement 33. Est ici une méthode qui se fonde sur ces avancées et est largement applicable. Conditions d'expression peuvent aussi être modifiées pour influer sur la composition de N-glycanes.

La lignée cellulaire HEK293S, avec une deletion de gène qui interrompt le traitement de N-glycane à un stade intermédiaire, conduit à l'expression de protéines avec des uniformes N-glycanes comprenant 2 résidus N-acétylglucosamine et cinq résidus de mannose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Ces cellulespas la N-acétylglucosaminyl transférase I (GntI) gène qui est nécessaire pour la N-glycane en aval traitement 36,37. L'utilisation d'inhibiteurs de glycosyltransférase comprenant kifunensine, des analogues d'acide sialique et l'analogue de fucose et de 2-désoxy-2-fluoro-fucose a des effets de traitement et les limites de N-glycane 38-41 similaires.

Le protocole indiqué ici utilise le vecteur pGEN2 comme représenté sur la figure 1 42,43, PEI transfection transitoire dans des cellules assistée lignes de mammifères ou des cellules HEK293F (HEK293S), et la récupération des rendements élevés de protéine glycosylée de façon appropriée. Ce système est robuste et peut accueillir divers facteurs, notamment marquage isotopique et de l'ingénierie glycane pour la production de grandes titres de protéines recombinantes.

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Protocol

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Ce protocole est suffisante pour l'expression en utilisant soit HEK293F ou cellules HEK293S.

1. Cellule Création

  1. Culture inoculation
    Remarque: Toutes les procédures de manipulation de culture doivent être effectuées dans une installation BSL-2 et chaque élément introduit dans la enceinte de sécurité biologique doit être stérilisé par pulvérisation d'un éthanol à 70% dans une solution aqueuse.
    1. Actionner l'incubateur agitateur à 135 tours par minute, 80% d'humidité et à 8,0% de CO 2 et 37 ° C. Tournez "sur" la lampe UV de l'armoire de biosécurité au moins 1 h avant de travailler. Préchauffer les bouteilles scellées milieu A et le milieu B dans le bain-marie à 37 ° C pendant 1 heure.
    2. Stériliser 125 ml des flacons Erlenmeyer de croissance avec un bouchon à évent, pipettes, pipettes, bouteilles et des médias préchauffées par pulvérisation avec de l'éthanol 70% dans une solution d'eau. Placez ces articles dans l'enceinte de sécurité biologique. Remarque: Stériliser que le plastique extérieure couvrant l'Erlenmeyer de 125 ml flacon de culture, puis retirez seulement quand il is intérieur de l'armoire de biosécurité.
    3. Pour une culture de 30 ml, retirer 26 ml de milieu A et 3 ml de milieu B (10% de la culture finale) et de les transférer dans le 125 ml de culture erlenmeyer et mélanger doucement en secouant (ci-après appelé comme milieu de culture frais).
    4. Transfert d'un flacon de cellules contenant des cellules HEK293F, congelés à -80 ° C, sur de la glace et de passer à la chambre de culture. Remarque: Les cellules HEK293F sont fournis à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml.
    5. Chauffer doucement le flacon au bain-marie à 37 ° C pour dégeler partiellement les cellules (il faut environ une minute et les cellules ne doit pas être complètement décongelés). Stériliser à l'extérieur du flacon avec l'éthanol à 70% dans une solution d'eau et de le déplacer dans l'enceinte de sécurité biologique.
    6. En utilisant une pipette ml, retirer la suspension de cellules (environ 0,7 ml) et le transférer dans le Erlenmeyer de 125 ml contenant 29 ballon ml de milieu de culture frais. Fermez le couvercle du flacon de culture et le déplacer dans le shaker incubés.
    7. Maintenance des cellules: Vérifiez densité cellulaire, la viabilité et de passages cellulaires
      1. Vérifiez la densité des cellules après 24 heures de décongélation de la culture en suivant le protocole ci-dessous. Note: Les cellules sont cultivées pendant 24 h après la décongélation afin d'assurer la croissance des cellules et la viabilité essentiels de> 80%.
      2. Stériliser le flacon de culture avec l'éthanol à 70% dans une solution d'eau et de le déplacer dans l'enceinte de sécurité biologique.
      3. En utilisant une pipette de 1 ml et pipette, retirer lentement 100 pi de la culture et le transfert suspension dans un tube Eppendorf de 0,5 ml stérile. Fermer et transférer le flacon de culture de retour dans le shaker dès que possible.
      4. Mélanger 7,5 ul d'une solution de bleu trypan à 7,5 ul de cellules. Mélanger vigoureusement avec 7,5 pi de la cellule / bleu Trypan mélange et le transférer sur le coulisseau de comptage.
      5. Allumer le compteur de cellules automatique et placer la lame de comptage dans la chambre de chargement. Le lecteur automatique est activée et les cellules sont comptés automatiquement dans les unitésdu nombre de cellules par ml et la viabilité pour cent
      6. Déterminer le volume de la culture de donneur requis pour le transfert à un milieu de culture frais à la densité de cellules de 0,3 x 10 6 cellules / ml en direct.
        Remarque: Voir un exemple de calcul dans les matériaux supplémentaires.
      7. Répétez les étapes 1.1.2 et 1.1.3 du protocole "1.1 Culture inoculation" ci-dessus pour préparer le matériel requis pour milieu de culture frais.
      8. Transfert Moyen A (23 ml) et moyennes B (3 ml) à une 125 ml flacon de culture frais. Retirez les bouteilles d'achat d'actions de moyenne A et B de la moyenne enceinte de sécurité biologique.
        Remarque: Les stocks de bouteilles de médias ne devraient pas être conservés dans l'enceinte de sécurité biologique en même temps que les cellules HEK 293F. Cela limite la possibilité de contamination des bouteilles moyennes de stock.
      9. Retirer la culture de cellules HEK293 de l'incubateur et de pulvérisation avec de l'éthanol à 70% dans une solution aqueuse. En utilisant une nouvelle pipette, retirer l'aliquote de cellules (4 ml, ce volume a été déterminé en fonction to étape 1.2.6) de la culture et le transférer dans le flacon contenant le milieu de culture frais.
      10. Transfert à la fois les cultures de l'enceinte de sécurité biologique à l'agitateur d'incubateur réglé selon 1.1.1. Cultiver les cellules à une densité approximative de 2-3 x 10 6 cellules / ml en direct.
        Remarque: Le temps de doublement approximatif de cellules est 32 h. Il prendra 3-4 jours pour atteindre cette densité. Incuber les cellules pendant 3-4 passages d'avoir modèle de croissance stable de cellules avant la première transfection.

    2. Préparer le matériel pour la transfection

    1. Préparation de cellules HEK293 (Jour 1)
      1. De sous-culture des cellules à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans du milieu B frais 24 heures avant la transfection selon l'étape 1.2.
        Note: le volume de la culture de transfection dépendra du nombre de cellules. Les volumes de plus de transfection (> 20 ml) auront besoin d'un plus grand volume de la culture à ce stade.
    2. Préparation Sttroupeaux de Matériaux
      1. Préparer une solution stock de Polyéthylènimine linéaire (PEI) à une concentration de 1 mg / ml dans un tampon contenant 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) et NaCl 150 mM (pH 7,5). Dissoudre complètement PEI; cela peut prendre 30-60 minutes à température ambiante. Stériliser à travers le filtre de la seringue de 0,22 um et conserver à -20 ° C pour une utilisation à long terme.
      2. Préparer l'ADN plasmidique stérile (selon les étapes 2.2.2.1-2.2.2.4). La procédure de construction de plasmide est décrit ailleurs 42. Une brève procédure de préparation de l'ADN est expliqué ici:
        1. Cultiver une culture de cellules d'Escherichia coli chimiquement compétentes, transformées par le vecteur pGEN2 dans 1 L de milieu LB (Tryptone- 10 g / L, y décompresser levure 5 g / L et chloride- de sodium 10 g / l) supplémenté avec 100 ug / ml d'ampicilline. E. coli est cultivé à 37 ° C dans un non-humidifié, incubateur à agitation.
        2. Purifier l'ADN vecteur codant pour pGEN2 cible plasmidique selon la manuLe protocole de purification de l'ADN constructeur.
        3. Pour assurer la stérilité complète de l'ADN plasmidique, effectuer les précipitations de l'isopropanol et remise en suspension dernières étapes des procédures d'extraction d'ADN à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique.
        4. Ajouter le volume d'isopropanol (spécifié dans le kit de préparation de plasmide) à l'ADN élue et centrifuger à 10000 x g pendant 10 min. Stériliser l'extérieur du récipient d'ADN avec de l'éthanol à 70% dans une solution aqueuse et la transférer à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique. Jeter le surnageant de l'isopropanol aide d'une pipette et sécher à l'air le culot d'ADN. Une fois sec, remettre le culot dans un tampon stérile Tris 10 mM, pH 8,0.
      3. Préparer une solution stock de 220 mM valproïque (VPA) de l'acide dans l'eau et stériliser par passage à travers un filtre de 0,22 um stérile. Conserver la solution à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

    3. Établir une transfection transitoire

    1. Transfection (jour 0)
      1. Vérifiez la densité cellulaire en suivant les étapes 1.2.2 à travers 1.2.5 de "1.2. Maintenance des cellules" ci-dessus. Déterminer la quantité de cellules pour la transfection (2,5-3,0 x 10 6 cellules / ml en direct avec la viabilité> 95%). Voir un exemple de calcul dans les matériaux supplémentaires.
      2. Transférer le volume des cellules de culture en suspension calculés dans l'étape précédente (ici 67 ml) dans un tube à centrifuger de 250 ml en utilisant une pipette sérologique stérile. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 5 min à 100 x g.
      3. Dans le même temps, préparer un milieu de culture de transfection frais étape 1.1.3 ci-dessous en fonction de "1.1. Culture inoculation" ci-dessus. Voir les matériaux supplémentaires pour un exemple de calcul. En outre, le transfert de 5 ml de milieu de culture frais à un tube de 15 ml stérile et mettre de côté.
      4. Tubes de transfert contenant les cellules sédimentées dans l'enceinte de sécurité biologique après la stérilisation à l'extérieur des tubes avec de l'éthanol à 70% dans une solution d'eau et en utilisant une pipette stérile à décanter ee surnageant constitué de milieu de culture usé.
      5. Vigoureusement Reprendre le culot de cellules par pipetage de haut en bas en utilisant 10 ml de milieu de culture frais et le transfert dans le ballon avec un milieu de culture de transfection frais (préparé à l'étape 3.1.3 ci-dessus). Visser le bouchon sur le flacon de culture cellulaire ventilé et déplacer le ballon à l'étuve (tel que défini au point 1.1.1) pendant 15 min-1 heure avec agitation.
      6. Pendant ce temps, on dilue l'ADN de plasmide et des stocks de PEI en utilisant un milieu de culture frais (en utilisant le volume de 5 ml retiré de l'étape 3.1.3 ci-dessus) à une concentration finale de 0,5 pg / pl. Voir des exemples de calculs dans les matériaux supplémentaires pour déterminer la quantité d'ADN et PEI. Transférer le flacon de culture avec les cellules dispersées dans l'enceinte de sécurité biologique.
      7. Ajouter ADN plasmidique (300 pi de 0,5 ug / ul) à la culture à l'aide de micro-pipette et mélanger par agitation manuelle douce. Ajouter PEI (900 pi de 0,5 ug / ul) à la culture, mélanger en agitant doucement. Ajouter 3,8 ml de cul fraismilieu de ture, de l'étape 3.1.3, ci-dessus et le transfert ballon à l'agitateur incubateur pendant 24 heures.
      8. Nettoyez l'enceinte de sécurité biologique selon l'étape 1.1.
    2. Dilution (Jour 1) (Pour un volume de transfection de 50 ml)
      1. Incuber la culture transfectées pendant 24 heures.
      2. Prélever 1 ml d'acide valproïque mM préchauffé 220 (VPA; préparé selon l'étape 2.2.3.) À l'aide d'une pipette stérile de 1 ml sérologique et le transférer dans un tube de 50 ml stérile.
      3. Retirer 5,0 ml de milieu B préchauffée et 44 ml de milieu A préchauffé et ajouter cette solution à l'aide d'une pipette VPA sérologique stérile pour préparer 50 ml de milieu de culture frais avec une concentration finale de 4,4 mM de VPA.
      4. Déplacez la culture transfectées dans l'enceinte de sécurité biologique après la stérilisation de l'extérieur de la fiole avec un éthanol à 70% dans une solution d'eau, ajouter le milieu de dilution préparé et transférer le ballon vers le shaker incubés.
    3. Expression et Harvest (Jours 2-6)
      1. Incuber les cellules pendant encore 4-5 jours (5-6 jours au total depuis transfection).
      2. Prélever des aliquotes de milieu de culture après l'étape 1.2.2. à 1.2.5. décrit dans «1.2. maintenance des cellules," ci-dessus en utilisant une pipette de 1 ml sérologique stérile, pour surveiller la viabilité des cellules et économisez aliquotes pour analyser l'expression de protéines à chaque jour par SDS-PAGE (voir la section 5 ci-dessous).
      3. Cellules de récolte Après 5-6 jours par centrifugation les cellules plus moyen à 1000 g pendant 5 min. En outre, récolter le surnageant si la viabilité cellulaire tombe en dessous de 50% (voir les étapes 1.2.2-1.2.5).
      4. Décanter le surnageant qui contient la protéine sécrétée. Ajouter 5 ml d'un agent de blanchiment de 10% au culot de cellules HEK et jeter comme un danger biologique.

    4. Protein Purification

    1. Préparer une colonne avec 5 ml de protéine A-Sepharose. Équilibrer la colonne avec 5 volumes de colonne de tampon A (20 mM de 3- (N-morpholino) propanesulfonique d'acide (MOPS), pH 7,4, NaCl 100 mMl).
    2. Centrifuger le surnageant recueilli avec protéine exprimée à grande vitesse (14 000 g pendant 10 minutes) pour enlever les débris de cellules restant. Recueillir par décantation dans un nouveau tube. Jeter le culot comme un danger biologique.
    3. Récupérer une aliquote de 10 ul du surnageant et de recueillir en outre un petit échantillon à chaque étape de la purification des protéines à analyser l'échantillon par SDS-PAGE (décrit dans la section 5). Chargez le surnageant clarifié et de recueillir l'écoulement à travers.
    4. Laver la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon-A et éluer la protéine avec 5 volumes de colonne de glycine-100 mM, pH 3,0. Recueillir l'éluat dans des tubes contenant une demi-volume de tampon TRIS 1 M, pH de 8,0 à neutraliser rapidement le pH.
    5. Laver la colonne avec 10 volumes de colonne de tampon A et stocker pour une utilisation future.
    6. Échanger le tampon de protéine est éluée avec au moins un excès de 10 fois de tampon A à l'aide de 10 kDa de poids moléculaire filtres centrifuges de coupure. Note: Ne pas concentrer l'échantillon élue àun volume très faible (<2 ml) éluée dans le tampon. Utilisez les filtres centrifuges pour échanger le tampon avec le tampon A.
    7. Magasin protéine purifiée à 4 ° C jusqu'à la prochaine utilisation.
      Remarque: la protéine exprimée dans le surnageant peut être purifié par des colonnes d'affinité sélectionnés sur la base des propriétés de la protéine ou de l'utilisation de marqueurs d'affinité. Pour une procédure typique de purification, colonne de protéine A peut être utilisée pour des fragments de Fc d'IgG ou de nickel ou de colonne peut être utilisé pour des protéines exprimées avec une étiquette poly-histidine. Ici, une description des étapes de purification pour les IgG1-Fc en utilisant une colonne de protéine A.

    5. Analyse des protéines par SDS-PAGE

    1. Diluer les aliquotes (7,5 ul) de chaque échantillon avec un volume égal de tampon de charge 2x (Tris 0,125 M, pH 8,0, 4% de SDS, 10% β-mercaptoéthanol, 20% de glycerol et 0,01% de bleu de bromophénol).
    2. Faire bouillir le mélange à 90 ° C pendant 5 min en utilisant un bloc chauffant ou un bain d'eau. Centrifuger les échantillons à 10000 g for 1 min. Chargez le gel préparé avec 5 pi de protéine marqueur et 14 ul d'échantillons pour analyses à l'aide d'une pipette de 20 pi avec un embout jetable.
    3. Exécutez un gel à 25 milliampères pendant 60 min. Une fois l'étape d'électrophorèse terminée, le gel à transférer un récipient avec 1 litre d'eau et micro-ondes pendant 5 min.
    4. Colorer le gel avec une solution de coloration (40% d'éthanol, acide acétique à 10% et 0,1% bleu brillant de Coomassie) pendant 2 heures et déteindre dans l'eau.

    6. glycanes analyse par spectrométrie de masse

    1. Analyser glycanes comme décrit précédemment 44. En bref, 75 ug d'IgG 1-Fc a été trypsinées, puis traité par la PNGaseF pour la libération de 45 glycanes. Glycanes libérés ont été perméthylés et analysés à l'aide de laser désorption ionisation spectrométrie assistée par matrice de temps de vol de masse (MALDI-TOFMS).

    7. Ajustements relatifs au protocole pour les scénarios spéciales

    1. Marquage des protéines avec 15 N-acides aminés marqués (pour un volume de transfection 50 ml)
      1. Distribuer 5 mg de chaque acide aminé dans un seul flacon en verre stérile. Reprendre avec 4 ml d'eau à l'autoclave (note Tyr ne pas solubiliser complètement, contrairement Lys et Phe). Stériliser la solution par passage à l'autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Laisser refroidir la solution à environ 50-60 ° C.
      2. Pour un volume de transfection de 50 ml, suivez l'étape 3.1.3 selon "3.1 Établir une transfection transitoire". Voir la section matériaux supplémentaires pour un exemple avec des volumes appropriés.
      3. Pour la transfection, suivez les étapes de "3. Établir une transfection transitoire" en utilisant un milieu de culture frais substituée avec des résidus d'acides aminés étiquetés comme préparé ci-dessus.
      4. Après 24 heures de transfection, le jour de culture dilution, retirer 5,0 ml de préchauffée milieu B, 40 ml d'préchauffé milieu A et un fraîchement passés à l'autoclave 4 ml aliquote du mélange d'acides aminés (préparé comme dans l'étape 7.1.1. Ci-dessus) et ajouter 1ml préchauffé solution stock de solution APV pour préparer 50 ml de milieu de culture frais de dilution avec une concentration finale de 4,4 mM d'APV. Ajouter ce milieu à la culture de transfection en utilisant une pipette sérologique stérile.
      5. Transférer la culture transfectées dans l'enceinte de sécurité biologique après la stérilisation de l'extérieur de la fiole avec un éthanol à 70% dans une solution d'eau, ajouter le milieu de dilution préparé et transférer le ballon vers le shaker incubés.
        Note: Moyen A est un milieu chimiquement défini, sans sérum. Ainsi, il est possible de préparer une formulation différente. Contactez le fournisseur pour obtenir une mesure moyenne Une préparation qui manque de certains acides aminés. Il est possible d'avoir tous les acides aminés en reste, cependant, nous préférons utiliser milieu qui ne lui manque que quelques résidus sélectionnez car un moyen d'abandon complet nécessiterait une adaptation de l'osmolarité après la supplémentation. Nous avons choisi un moyen d'abandon Lys-Tyr-Phe qui peut être complétée et ne nécessite pas de réglage de l'osmolarité. Furthermore, le milieu Un fournisseur ne partage pas librement les concentrations de composants de milieu; nous avons utilisé 100 mg / L pour le Lys, Tyr et Phe avec succès. Les volumes de milieu de transfection et d'expression doivent être adaptés pour tenir compte des acides aminés supplémentaires. Voici les ajustements au protocole ci-dessus pour l'étiquetage isotopique
    2. Compléter la transfection avec une petite molécule
      1. Préparer mM solution 100 de 2-désoxy-2-fluoro-L-fucose utilisant de l'eau à l'autoclave et stériliser cette solution en utilisant un filtre de 0,22 pm.
      2. Pour une culture de 50 ml, ajouter 125 ul (à 250 pM) de la solution fucose analogique pour la transfection et la dilution médias. Note: Nous avons négligé d'accomplir un réglage du volume en outre parce que l'ajout le substituant à ces comptes de concentration pour seulement 0,25% du volume total .Il de culture est possible de modifier l'expression en utilisant des petites molécules inhibitrices de traitement des glycanes. Nous décrivons ici les conditions pour y compris 2-désoxy-2-fluoro-L-fucose, un inhibiteur de la fucosylation glycane. Nous avons trouvé> 90% de réduction dans fucosylation en ajoutant l'analogue de fucose à une concentration de 250 uM dans la transfection et dilution médias.

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Representative Results

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Expression de la protéine de haut niveau et de la pureté

Ce système d'expression optimisé généré un rendement élevé de protéines glycosylées. Un motif typique est montrée dans l'expression de Fc-IgG1 (figure 1). Dans ce cas, jour 0 est le jour de la transfection suivie par Jour 1 (dilution) et les jours de culture subséquentes jusqu'à Jour 5. expression de la protéine est analysée en utilisant la fraction d'expression soluble dans le milieu brut. Une très petite quantité d'expression de protéine a été observée dans une journée que l'aliquote de la culture a été retiré trois heures après dilution culture. Cela est plus facile à visualiser avec des protéines GFP étiqueté qui présentent une couleur verte distincte dans le milieu de culture. Une telle augmentation a été observée dans l'expression de la GFP et GFP-FcyRIIIa-ST6GalI du jour 2 au jour 5. Aucune augmentation significative de l'expression a été observée entre le jour 4 et le jour 5. Au jour 5, les cellules étaient <50%culture viable a été récolté, et donc de limiter la protéolyse. La purification par affinité en utilisant une colonne de protéine A IgG1 Fc ou d'une colonne de nickel-GFP pour FcyRIIIa abouti à des protéines ayant une grande pureté (> 99%; Figure 2), le rendement (tableau 1) et la glycosylation intégral (données non présentées).

15 N ou 13 C étiquetage isotopique des protéines et des glycanes

Ce système efficacement exprimé isotopiquement enrichi IgG1 Fc selon le protocole décrit. Bien qu'une légère réduction dans le rendement en protéine a été observée (25-50%), des signaux bien dispersées ont été observés dans un spectre RMN 2D qui met en corrélation la fréquence de résonance de 1 atomes d'hydrogène et l'amide directement lié 15 N d'atomes (figure 3). Ce niveau d'expression permet une production efficace de protéines à l'échelle requise pour les études basées sur la structure (typiquement 2-20mg de protéine) et illustre l'incorporation réussie des isotopes marqués dans la protéine. Le degré élevé de similitude entre ce spectre et les spectres publiés indiquent un degré élevé de marquage des protéines est produite avec un minimum de brouillage des 15 N 43 étiquettes.

Produisant des protéines avec différents N-glycanes

Glycoformes différentes ont été produites avec les cellules HEK293F et HEK293S. Désorption ionisation laser assistée par matrice spectrométrie de masse (MALDI-MS) analyse des N-glycanes libérés par voie enzymatique a montré les glycoformes attendus (figure 4). Protéines exprimées à partir de cellules HEK293S abrités N-glycanes qui étaient de l'Homme 5 forme GlcNAc 2 et ne contenaient pas de fucose (Figure 4). Glycanes de matériau HEK293F exprimée étaient de type complexe, formes biantennaires avec noyau fucose et ayant la plupart du temps la borneN-acétylglucosamine (GlcNAc) ou faible proportion de (Ga) forme mono- ou di-galactosylée. Bien qu'il est sait pas ce que les N-glycanes indigènes de ST6GalI et FcyRIIIa sont, le profil glycanes pour IgG1 Fc est très similaire à IgG1 Fc purifiée à partir de sérum humain 46. Les principales différences sont le degré de modification; IgG1 Fc partir de sérum humain montre un degré de galactosylation élevé que celui observé pour l'expression de HEK293F. L'addition de 2-désoxy-2-fluoro-L-fucose, un inhibiteur de la fucosylation glycane, à une expression réalisée à l'aide de la lignée cellulaire HEK293F montré une dramatique> 90% de réduction dans le fucose incorporation (figure 4).

Figure 1
Figure 1: rendements élevés de protéines recombinantes sont récupérés par l'expression du vecteur pGEN2. (A - B) Deux expression vréflecteurs utilisés dans cette étude ont été générées à partir d'un plasmide pIBI30 qui contient une cassette d'ampères et R un E. origine de replication coli. Niveau (C) de l'expression de la protéine IgG1 Fc sécrétée après transfection transitoire de cellules HEK293F. Analyse SDS-PAGE montre l'accumulation de protéines exprimées à partir jour 0 au jour 5 et est indiquée par la flèche. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: récupération de la protéine exprimée à partir du milieu de culture. (A) IgG 1-Fc, (B) GFP-FcyRIIIa. "Moyen" désigne le milieu de culture après centrifugation; FT = fraction de l'écoulement à travers la colonne de purification. Échantillons SDS-PAGE sont pr epared dans des conditions non réductrices sans β-mercaptoéthanol. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Acides aminés marquage sélectif des IgG1 Fc 1 H- 15 N hétéronucléaires seul spectre de la cohérence quantique de [15 N-Tyr; 15 N-Lys] marqué à IgG1 Fc exprimé en utilisant des cellules de HEK293F dans la coutume Milieu A complétée par (15 N ) marqué L-Tyr et L-Lys. Pics croisés ont été attribués en fonction des rapports précédents 43,47. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4:. L'expression des protéines en présence de petites molécules modulateurs de composition de N-glycane profils glycanniques de IgG1 Fc exprimé dans des cellules HEK293 en utilisant différentes conditions de culture. Le spectre dessus a été préparée en utilisant glycanes isolés à partir IgG1 Fc exprimé dans les cellules HEK293S. Le spectre de centre révèle les glycoformes IgG1 Fc de matériau exprimé dans les cellules HEK293F et le spectre du bas a été préparé attendent similaire cellules ont été cultivées en présence d'un inhibiteur de GDP-fucose biosynthèse, le 2-désoxy-2-fluoro-l-fucose. N-glycanes sont présentés sous forme de diagrammes de bande dessinée après le congrès CFG 5: acétylglucosamine (GlcNAc), carrés bleus; Mannose (Man), des cercles verts; Fucose (FUC) triangles rouges; Galactose (Gal), des cercles jaunes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<tbody>
Protéine Rendement (mg / L)
IgG1 Fc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Tableau 1: Rendement de différentes protéines exprimées dans les cellules HEK293F.

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Discussion

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Ce protocole illustre l'expression de la protéine par l'intermédiaire de la transfection transitoire de cellules HEK293F ou S. Les conditions de transfection optimales établies dans les laboratoires et Barb Moremen emploient une combinaison critique de concentrations de densité de cellules et de réactifs pour réaliser la transfection à haut rendement. Considérations critiques lors de la mise en œuvre de ce protocole comprennent: le maintien d'une culture stable avant la transfection (avec la culture cohérente temps de doublement); la transfection de cellules en croissance active (obtenue par dilution des cellules à 1 x 10 6 cellules / ml 24 h avant la transfection) avec la viabilité cellulaire supérieure à 95%; la densité des cellules à transfection doit être comprise entre 2,5 à 3,0 x 10 6 cellules / ml en direct avec un (densité) de transfection viabilité> 95% dans une culture contenant 90% de milieu A et du milieu B 10%; et, en ajoutant de l'ADN avant l'addition PEI à 3 pg / ml et 9 pg / ml, respectivement 31; à 24 h post-transfection de la culture est diluée à 1: 1 dans conta moyenINING 4,4 mM d'acide valproïque pour aboutir à une concentration de 2,2 mM d'acide valprioc dans la culture diluée; la croissance de la phase de production continue ensuite dans un flacon d'agitation humidifié à 37 ° C et 8% de CO 2 pendant encore 4-5 jours. Le vecteur décrit ici est optimisée et une caractéristique importante du système d'expression de protéine soluble 32,42.

Si une protéine cible ne parvient pas à exprimer, en plus des facteurs énumérés ci-dessus, plusieurs autres variables peuvent contribuer à de faibles rendements. Veiller à la séquence d'ADN codant pour la protéine contient des codons optimisés pour les cellules humaines. Cela peut être évaluée avec de multiples ressources en ligne. Stérilité toute la procédure est primordiale. Une culture en croissance active et pure de cellules HEK293F devrait être légèrement plus granuleuses à l'œil nu, et le milieu devrait être la plupart du temps clair (en particulier à des densités cellulaires <1,0 × 10 6 cellules / ml).

Cultures contaminées par des bactéries ou des champignons devraitimmédiatement supprimées pour empêcher la propagation. Est-il important de maintenir une culture de bonne santé du stock. Ce résultat est obtenu par inoculation de ces cultures à une densité de cellules de 0,3 x 10 6 cellules / ml. Densités inférieures d'inoculation peuvent ralentir le taux de croissance en limitant la fourniture de divers facteurs de croissance nécessaires à la croissance et la division 48 cellulaire. Comme les cultures ont été repiquées pendant plus de 25 ou 30 fois, une diminution de l'expression a été observée. Pour cette raison, les cultures soumises à des passages plus de 30 fois sont mis au rebut.

Il est possible que la protéine se dégrade dans le milieu d'expression, ou la période d'expression est trop longue, ce qui conduit à la dégradation des protéines. Pour ces raisons, il est recommandé de surveiller la viabilité de la culture et l'expression de protéines à chaque jour afin de déterminer un délai d'une expression optimale. Il est important de purifier des protéines aussi rapidement que possible après la récolte du milieu. Pour certaines protéines, il est utile d'inclure des inhibiteurs de la protéase durinpurification g. Au total, ces ajustements ont amélioré la récupération des protéines dans le Barb et Moremen laboratoires 42,43.

La transfection transitoire de cellules HEK293 a montré une grande utilité pour produire des protéines solubles et des domaines de protéines qui sont naturellement ciblées sur la voie de sécrétion. Il est probable que la production de protéines cytoplasmiques ou membranaires intégrales, il faudra en outre l'optimisation. Un avantage principal de ce système est substrats natifs et machines pour la production de protéines sont présentes et disponibles dans les cellules HEK293 49. Ceci explique en grande partie ses avantages par rapport à d'autres méthodes de production de protéines recombinantes telles que des bactéries ou sans modifications post-traductionnelles spécifiques, ou des systèmes de levure et de baculovirus correctement repliées mais avec différentes glycoformes incorporés N-1,50,51.

En outre, le protocole décrit ici montre la capacité supplémentaire pour inclure de bas poids moléculaire comlivres tels que les acides aminés marqués glucose marqué, ou de petites molécules destinés à modifier la composition de N-glycane. Les cellules HEK293 prouvent également aptes à l'expression de protéines non-mammifères, y compris les enzymes végétales, et prend en charge la co-expression de plusieurs polypeptides pour la récupération de complexes de protéines (données non présentées).

La caractérisation structurale et fonctionnelle des glycoprotéines est souvent entravée par des problèmes de production de l'échantillon. Le système d'expression de protéine décrite ici surmonte cet inconvénient en accomplissant modifications post-traductionnelles utilisant le complément naturel des enzymes intracellulaires glycanes sophistiquées de traitement 6. Ce protocole robuste et simple est prouvé pour la transfection transitoire de cellules HEK293 humaines de suspension. Cette méthode a montré un rendement de glycoprotéine significative (> 95 mg / L) avec trois protéines N-glycosylées et peut accueillir des suppléments tels que des résidus d'acides aminés marqués ou les inh chimiques à petites moléculesibitor 2-désoxy-2-fluoro-l-fucose. Les glycoprotéines exprimées peuvent encore être remodelés post-purification pour préparer un large éventail de glycoformes définies 52.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu financièrement par les subventions K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) et P01GM107012 (KWM) des Instituts nationaux de la santé, et par des fonds provenant du Roy J. Carver Département de biochimie, biophysique et biologie moléculaire à l'Université de l'Iowa . Le contenu de ce travail est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension
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Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

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