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Biology

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

Die Kunst der Herstellung von rekombinanten Proteinen mit komplexen post-translationale Modifikationen stellt eine große Herausforderung für die Untersuchung der Struktur und Funktion. Die rasche Einrichtung und hohe Rückgewinnung aus transient transfizierten Säugerzelllinien adressiert diese Barriere und ist ein wirksames Mittel zur Expression von Proteinen, die natürlicherweise durch das ER und Golgi-vermittelte sekretorischen Weg geleitet werden. Hier ist ein Protokoll für die Proteinexpression mit Hilfe der menschlichen HEK293F und HEK293s Zelllinien mit einem Säugetier-Expressionsvektor für hohe Proteinausbeuten entwickelt transfiziert. Die Anwendbarkeit dieses Systems wird gezeigt, unter Verwendung von drei repräsentativen Glycoproteine, die mit Ausbeuten zwischen 95 bis 120 mg gereinigtes Protein gewonnen pro Liter Kultur ausgedrückt. Diese Proteine ​​sind die menschlichen FcγRIIIa und die Ratte α2-6 Sialyltransferase, ST6GalI, beide mit einem N-terminalen GFP-Fusions zum Ausdruck, ebenso wie das unmodifizierte humanen Immunglobulins G1 Fc. Das robuste System utilizes ein serumfreies Medium, das für die Expression von isotopisch angereicherten Proteine ​​und Kohlenhydrate für Strukturuntersuchungen unter Verwendung von Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie anpassungsfähig ist. Weiterhin kann die Zusammensetzung des N-Glycan durch Zugabe einer kleinen Moleküls an bestimmten Glycans Modifikationen in einer Weise, die Ausbeute nicht verringert verhindern abgestimmt werden.

Introduction

Hohe Ausbeuten an in geeigneter Weise gefaltet und posttranslational modifiziert Humanproteinen für die detaillierte Analyse von Struktur und Funktion wie vor eine große Herausforderung. Eine große Anzahl von Expressionssystemen zur Verfügung, die von rekombinanten Proteinen mit nativ-ähnlichen Funktion und Verhalten zu erzeugen. Bakterielle Expressionssysteme, überwiegend Escherichia coli-Stämme, repräsentieren die am leichtesten zugänglichen und am häufigsten verwendeten Werkzeuge in der Forschung Arena, wegen der Einfachheit dieser Expressionssysteme, obwohl Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugersystemen werden ebenfalls beschrieben 1-4. Die meisten dieser Systeme sind jedoch nicht in der Lage geeignete posttranslationale Modifikation der Zielproteine. Ein grundlegendes Interesse der Barb und Moremen Labors produziert eukaryotischen Proteinen mit entsprechenden Glykosylierung. Viele menschliche Proteine ​​erfordern entsprechende Glykosylierung für die richtige Funktion (siehe 5).

Der eukaryotischeGlykosylierungsmaschinerie ist umfangreich und der Lage, eine breite Palette von Modifikationen, einschließlich sowohl Asparagin (N) - und Serin / Threonin (O) -verknüpften komplexer Glykane 6. Es wird geschätzt, dass> 50% der menschlichen Proteine ​​sind N-glycosyliert. 7 Glykane sind wesentliche Bestandteile von vielen Proteinen, einschließlich therapeutischer monoklonaler Antikörper, Erythropoietin und Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX, um einige zu nennen. Obwohl mehrere Methoden existieren, um in geeigneter Weise N-glycosylierte Proteine ​​vorzubereiten und reichen von rein synthetischen 8-10, um Chemoenzymatische 11-14 oder Erholung von gentechnisch rekombinanten Systemen 15-20, nicht überraschend, menschliche Expressionssysteme sind bisher bewährt die robusteste zu sein Verfahren zur Erzeugung von menschlichen Proteinen.

Viele therapeutische Human Glykoproteine ​​in rekombinanten Systemen, die Säugetierzellen produziert. Systeme Bemerkenswert sind die Chinese Hamster Ovary (CHO), Maus-Myelom (NS0), Baby-Hamster Niereny (BHK), menschliche embryonale Nieren (HEK-293) und die menschliche Netzhaut-Zelllinien, die in der Haftung oder Suspensionskultur für die Proteinproduktion 4,21,22 eingesetzt werden. Allerdings haben Säugerproteinexpressionssysteme die Erzeugung von stabilen Zelllinien, teure Nährmedien und Substrat unterstützte Transfektion Verfahren 23 erforderlich.

Säugerzelle Transfektion wird mit Hilfe einer Vielzahl von Mitteln, einschließlich Kalziumphosphate 24,25, kationische Polymere (DEAE-Dextran, Polybren, Polylysin, Polyethylimin (PEI)) oder positiv geladene kationische Liposomen 26-29 erreicht. PEI ist ein polykationisches, geladene, lineares oder verzweigtes Polymer (25 kDa) 26, die einen stabilen Komplex bildet mit DNA und wird durch Endozytose. Beim Ansäuern des Endosoms wird PEI gedacht zu quellen, was zu dem Bruch der Endosomen und Freisetzung der DNA ins Zytoplasma 26,30.

Bis vor kurzem war die transiente Transfektion in Sperre wiederauf Kultur wurde durch vorherigen DNA / PEI-Komplexbildung, gefolgt von der Zugabe zu der Zellkultur 29 durchgeführt. Allerdings Würm und Mitarbeiter berichteten über eine hocheffiziente Protokoll für die Produktion rekombinanter Proteine ​​in HEK293-Zellen, die eine DNA / PEI-Komplex in situ gebildet 31,32 optimiert. Dies vermieden Herstellung, Sterilisation der Anlage und Pufferaustausch in einem Kulturmedium. Weitere Optimierung, indem die Expression steigernde Plasmiden führte zu deutlichen Ertragssteigerungen 33. Hierin ist eine Methode, die auf diesen Fortschritten baut und ist breit anwendbar. Expressionsbedingungen können ebenfalls verändert werden, um das N-Glycan-Zusammensetzung auswirken.

Die HEK293s Zelllinie mit einem Gen-Deletion, das N-Glycan Verarbeitung stoppt in einer Zwischenstufe, zur Expression von Proteinen mit einheitlichen N-Glycanen, die aus 2-N-Acetylglucosamin-Reste plus fünf Mannosereste (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Diese Zellenfehlt das N-Acetylglucosaminyl Transferase I (GntI) Gen, das für nachfolgende N-Glycan Verarbeitungs 36,37 erforderlich. Die Verwendung von Glycosyltransferase-Inhibitoren, einschließlich kifunensine Sialinsäure-Analogen und dem Fucose analogen und 2-Deoxy-2-fluor-Fucose hat ähnliche Wirkungen und Grenzen N-Glycan Verarbeitungs 38-41.

Das Protokoll verwendet die hier berichteten pGEn2 Vektors wie in Figur 1 gezeigt, 42,43, PEI stützten transiente Transfektion in Säugetierzelllinien (HEK293F oder HEK293s Zellen) und die Rückgewinnung von hohen Ausbeuten von geeignet glykosylierte Protein. Das System ist robust und kann von verschiedenen Faktoren, einschließlich Isotopenmarkierung und Glycan Technik für die Herstellung von großen Titern an rekombinante Proteine ​​unterzubringen.

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Protocol

Dieses Protokoll ist ausreichend für die Expression entweder HEK293F oder HEK293s Zellen.

1. Zell Establishment

  1. Kultur Inokulation
    Hinweis: Alle Kultur Manipulation Vorgänge in einer Anlage BSL-2 durchgeführt werden und jedes Einzelteil, die in das Biosicherheitswerkbank muss durch Besprühen mit einer 70% Ethanol in Wasser-Lösung sterilisiert werden.
    1. Betrieb des Inkubationsschüttler bei 135 UpM, 80% Feuchte und 8,0% CO 2 und 37 ° C. Schalten "auf" der UV-Lampe der Biosicherheitswerkbank mindestens 1 h vor dem Training. Vorwärmen die versiegelten Medium A und Medium B Flaschen im Wasserbad bei 37 ° C für 1 Stunde.
    2. Sterilisieren 125 ml Erlenmeyerkolben mit einer Wachstums belüftete Kappe, Pipetten, Pipetten und vorgewärmten Medien Flaschen durch Spritzen mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung. Legen Sie diese Dokumente in der Biosicherheitswerkbank. Hinweis: Sterilisieren Sie nur die äußere Kunststoffabdeckung des 125 ml-Erlenmeyer-Kulturflasche und entfernen Sie dann nur, wenn sie is in der Biosicherheitswerkbank.
    3. Für einen 30-ml-Kultur, zurückzutreten 26 ml Medium A und 3 ml Medium B (10% der Gesamtkultur) und Überführung in den 125 ml-Erlenmeyer-Kulturflasche und vorsichtig schütteln (im Folgenden als frisches Kulturmedium bezeichnet).
    4. Transfer eine Ampulle von Zellen, die HEK293F Zellen, bei -80 ° C eingefroren, auf Eis und bewegen sich im Kulturraum. Anmerkung: HEK293F Zellen werden in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml geliefert.
    5. Erwärmen Sie die Durchstechflasche vorsichtig im Wasserbad bei 37 ° C, um die Zellen teilweise auftauen (es dauert etwa eine Minute, und die Zellen nicht vollständig aufgetaut werden). Sterilisieren Sie die außerhalb des Fläschchens mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung und verschieben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
    6. Unter Verwendung von 1 ml-Pipette, ziehen Sie die Zellsuspension (etwa 0,7 ml) und Transfer in das 125 ml Erlenmeyerkolben mit 29 ml frischem Kulturmedium. Schließen Sie die Abdeckung der Kulturflasche und verschieben Sie sie in die inkubiert Shaker.
    7. Zell Wartung: Überprüfen Zelldichte, Lebensfähigkeit und Zellpassagen
      1. Überprüfen Sie die Zellen Dichte nach 24 Stunden nach dem Auftauen der Kultur mit Hilfe der nachstehenden Protokoll. Anmerkung: Die Zellen werden für 24 h nach dem Auftauen zu wesentlichen Zellen Wachstum und die Lebensfähigkeit von> 80% zu gewährleisten gezüchtet.
      2. Sterilisieren Sie die Kulturflasche mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung und verschieben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
      3. Unter Verwendung einer 1 ml Pipette und Pipetten langsam zurückziehen 100 ul der Suspensionskultur und Transfer in ein steriles 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Schließen und sobald die Kulturflasche in den Shaker Transfer zurück wie möglich.
      4. Mischen Sie 7,5 ul einer Trypanblau-Lösung mit 7,5 ul der Zellen. Mischen kräftig mit 7,5 ul der Zell / Trypanblau Gemischs und überträgt es auf das Zählen Rutsche.
      5. Aktivieren Sie die automatische Zellzähler und legen Sie das Zählen Rutsche in den Laderaum. Die Auto-Leser wird aktiviert und die Zellen werden automatisch in den Einheiten gezähltder Anzahl der Zellen pro ml und prozentuale Lebensfähigkeit
      6. Bestimmen das Volumen des für die Übertragung in ein frisches Kulturmedium in den Zellen Dichte von 0,3 × 10 6 lebende Zellen / ml benötigt Spenderkultur.
        Hinweis: Sehen Sie eine Beispielrechnung im ergänzenden Materialien.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 und 1.1.3 der "1.1 Kultur Impfung" Protokoll über den Materialien für frisches Kulturmedium erforderlich vorzubereiten.
      8. Übertragungsmedium A (23 ml) und Medium B (3 ml) zu einer frischen 125 ml Kulturflasche. Entfernen Sie die Vorratsflaschen von Medium A und Medium B von der Biosicherheitswerkbank.
        Hinweis: Die Bestände an Medienflaschen dürfen nicht in der Biosicherheitswerkbank zur gleichen Zeit wie die HEK 293F-Zellen gehalten werden. Dies schränkt die Möglichkeit der Verunreinigung der Lager Medium Flaschen.
      9. Entfernen Sie die HEK293 Zellkultur aus dem Inkubator und Spray mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung. Mit Hilfe einer neuen Pipette herausziehen Aliquot von Zellen (4 ml, dieses Volumen bestimmt wurde, nach to Schritt 1.2.6) aus der Kultur und übertragen sie in den Kolben mit frischem Kulturmedium.
      10. Bringen Sie beide Kulturen aus der Biosicherheitswerkbank in den Inkubator Schüttler Satz nach 1.1.1. Wachsen Zellen auf eine ungefähre Dichte von 2-3 x 10 6 lebende Zellen / ml.
        Anmerkung: Die ungefähre Verdopplungszeit der Zellen 32 h. Es dauert 3-4 Tage, um diese Dichte zu erreichen. Inkubieren der Zellen für 3-4 Durchgänge mit einem stabilen Wachstum Muster von Zellen vor der ersten Transfektion haben.

    2. Bereiten Sie Materialien für die Transfektion

    1. Vorbereiten HEK293-Zellen (Tag 1)
      1. Subkultur-Zellen bis zu einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in frisches Medium B 24 h vor der Transfektion gemäß Schritt 1.2.
        Hinweis: das Volumen der Transfektion Kultur hängt von der Anzahl von Zellen sein. Transfektion größeren Mengen (> 20 ml) wird ein größeres Volumen der Kultur in dieser Phase erforderlich.
    2. Vorbereiten Stocks of Materials
      1. Vorbereitung Stammlösung Lineares Polyethylenimin (PEI) mit einer Konzentration von 1 mg / ml in einem Puffer, der 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 150 mM NaCl (pH 7,5). Löse PEI vollständig; Dies kann 30-60 min bei RT zu nehmen. Sterilisieren durch 0,22 um Spritzenfilter und bei -20 ° C für die langfristige Nutzung.
      2. Bereiten Sie sterile Plasmid-DNA (entsprechend den Schritten 2.2.2.1-2.2.2.4). Die Plasmid-Konstruktionsverfahren wird an anderer Stelle 42 beschrieben. Eine kurze Verfahren zur DNA-Präparation wird hier erklärt:
        1. Wachsen, eine Kultur von chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen mit dem Vektor pGEn2 in 1 l LB-Medium (Tryptone- 10 g / l, Hefe Ausschnitt- 5 g / l und Natriumchlorid-10 g / l), ergänzt mit 100 ug / transformierten ml Ampicillin. E. coli bei 37 ° C in einer nicht befeuchteten, Schüttelinkubator gezüchtet.
        2. Reinige den pGEn2 kodierenden Vektor Zielplasmid DNA gemäß der manulers DNA Reinigungsprotokoll.
        3. Um eine vollständige Sterilität der Plasmid-DNA zu gewährleisten, führen Sie die endgültigen Isopropanolfällung und Resuspension Schritte der DNA-Extraktionsverfahren in der Biosicherheitswerkbank.
        4. Fügen Sie das Volumen Isopropanol (im Plasmid Vorbereitung Kit angegeben) auf die eluierte DNA und Zentrifuge bei 10.000 x g für 10 min. Sterilisieren Sie die Außenseite des DNA-Behälter mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung und überträgt es in der Biosicherheitswerkbank. Entsorgen Sie die Isopropanol Überstand mit einer Pipette und der Luft trocknen die DNA-Pellet. Einmal trocken, das Pellet in sterilem 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0.
      3. Vorbereitung Stammlösung von 220 mM Valproinsäure (VPA) Säure in Wasser und Sterilisieren mittels Durchleiten durch einen sterilen 0,22 um Filter. Bewahren Sie die Lösung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.

    3. Aufbau einer Transiente Transfektion

    1. Transfektion (Tag 0)
      1. Überprüfen Sie die Zelldichte durch folgende Schritte 1.2.2 bis 1.2.5 "1.2. Cell Wartung" weiter oben. Bestimmung der Anzahl der Zellen für die Transfektion (2,5-3,0 × 10 6 lebende Zellen / ml mit der Lebensfähigkeit> 95%). Hier finden Sie eine Beispielrechnung im ergänzenden Materialien.
      2. Übertragung des Volumens der Suspensionskulturzellen in dem vorherigen Schritt (hier 67 ml) in einen 250 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung eines sterilen serologischen Pipette. Sammeln Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 100 x g.
      3. In der Zwischenzeit eine frische Transfektion Kulturmedium nach Schritt 1.1.3 nach "1.1. Kulturinokulation" oben. Siehe die Zusatzmaterialien für ein Rechenbeispiel. Auch Transfer 5 ml frisches Kulturmedium in ein steriles 15 ml-Tube und beiseite stellen.
      4. Übertragungsrohren, die die pelletierten Zellen in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Außenseite der Rohre mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung und mit einer sterilen Pipette Dekantier-the Stand aus verbrauchten Kulturmedium.
      5. Kräftig Resuspendieren der pelletierten Zellen durch Auf- und Abpipettieren mit 10 ml frischem Kulturmedium und Transfer in den Kolben mit frischem Transfektion Kulturmedium (in Schritt 3.1.3 oben hergestellt). Schrauben Sie die Kappe auf der Zellkulturflasche entlüftet und der Kolben zu bewegen, um den Brutschrank (wie in 1.1.1 festgelegt) für 15 min-1 h mit Schütteln.
      6. Während dieser Zeit verdünnt das Plasmid-DNA und PEI Bestände mit frischem Kulturmedium (mit der 5 ml Volumen aus Schritt 3.1.3 oben zurückgezogen) zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ul. Siehe Beispielrechnungen in ergänzende Materialien, die Menge an DNA und PEI bestimmen. Übertragen Sie die Kulturflasche mit den dispergierten Zellen in der Biosicherheitswerkbank.
      7. In Plasmid-DNA (300 & mgr; l von 0,5 ug / ul) zu der Kultur unter Verwendung von Mikropipette und mischen durch vorsichtiges manuelles Schütteln. In PEI (900 ul 0,5 ug / ul) zu der Kultur, mischen durch vorsichtiges Schütteln. In 3,8 ml frischem culture Medium aus Schritt 3.1.3 vor und Übertragungskolben in den Inkubator Schüttler für 24 Stunden.
      8. Reinigen Sie die Biosicherheitswerkbank gemäß Schritt 1.1.
    2. Verdünnung (Tag 1) (für eine 50 ml Transfektion Volumen)
      1. Inkubieren Sie die transfizierten Kultur für 24 Stunden.
      2. Zurückzuziehen 1 ml vorgewärmten 220 mM Valproinsäure (VPA; gemäß Schritt 2.2.3 vorbereitet.) Mit einer sterilen 1 ml serologische Pipette und übertragen sie in eine sterile 50-ml-Tube.
      3. Zurückzuziehen 5,0 ml vorgewärmtem Medium B und 44 ml vorgewärmtem Medium A und addieren sie zum VPA Lösung mit einer sterilen Pipette in serologischen 50 ml frisches Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 4,4 mM VPA vorzubereiten.
      4. Bewegen Sie den transfizierten Kultur in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Äußeren der Kolben mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung, fügen Sie die vorbereiteten Verdünnungsmedium und der Kolben Transfer zurück zum inkubiert Shaker.
    3. Expression und Harvest (Tage 2-6)
      1. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 4-5 Tage (5-6 Tage insgesamt seit Transfektion).
      2. Zurückzuziehen Aliquots des Kulturmediums nach Schritt 1.2.2. zu 1.2.5. oben mit einer sterilen 1 ml serologische Pipette, um Zellen Lebensfähigkeit zu überwachen und speichern Aliquots zur Proteinexpression an jedem Tag durch SDS-PAGE analysiert beschriebenen "1.2. Cell Wartung" (siehe Abschnitt 5, unten).
      3. Ernten der Zellen nach 5-6 Tagen durch Zentrifugieren der Zellen plus Medium bei 1000 g für 5 min. Zusätzlich zu ernten den Überstand, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen unter 50% (siehe Schritte 1.2.2-1.2.5).
      4. Gießen Sie den Überstand, die sekretiertes Protein enthält. 5 ml einer 10% Bleichmittel auf die HEK Zellpellet und entsorgen Sie als Biohazard.

    4. Protein Purification

    1. Vorbereitung einer Säule mit 5 ml Protein-A-Sepharose. Äquilibrieren der Säule mit 5 Säulenvolumina Puffer A (20 mM 3- (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCll).
    2. Zentrifugieren des gesammelten Überstandes mit exprimierten Proteins bei hoher Geschwindigkeit (14.000 g für 10 min), um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie mit dem Umfüllen in ein frisches Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet als Biohazard.
    3. Sammeln ein 10 ul Aliquot des Überstandes und zusätzlich zu sammeln eine kleine Probe an jedem Proteinreinigungsschritt, um die Probe durch SDS-PAGE analysiert (in Abschnitt 5 beschrieben). Laden Sie das geklärte Überstand und sammeln die Strömung durch.
    4. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer A und Eluieren des Proteins mit 5 Säulenvolumina von 100 mM Glycin, pH 3,0. Das Eluat wird gesammelt in Röhrchen, die ein halbes Volumen von 1 M Tris-Puffer, pH 8,0, um den pH-Wert rasch zu neutralisieren.
    5. Mit 10 Säulenvolumina Puffer A und Speicher für eine zukünftige Verwendung Die Säule.
    6. Buffer tauschen die eluierte Protein mit mindestens einem 10-fachen Überschuss an Puffer A mit 10 kDa Molekulargewicht cut-off zentrifugalen Filter. Hinweis: die eluierten Probe zu konzentrieren Sie sich nichtein sehr geringes Volumen (<2 ml) in der eluierten Puffers. Verwenden Sie die Schleuderfilter, um den Puffer mit Puffer A austauschen
    7. Speicher gereinigte Protein bei 4 ° C bis zum nächsten Einsatz.
      Achtung: Die Protein im Überstand ausgedrückt können durch Affinitätssäulen auf der Basis der Eigenschaften des Proteins oder die Verwendung von Affinitätsmarkierungen ausgewählt gereinigt werden. Für einen typischen Reinigungsverfahren, Protein-A-Säule kann für IgG oder Fc-Fragmente oder Nickelsäule verwendet werden kann, die für Proteine ​​mit einem Poly-Histidin-Tag exprimiert werden. Hier ist eine Beschreibung der Reinigungsschritte zur IgG1-Fc Verwendung einer Protein A-Säule.

    5. Analyse von Protein durch SDS-PAGE

    1. Verdünnt den Aliquoten (7,5 & mgr; l) jeder Probe mit einem gleichen Volumen 2 × Ladepuffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau).
    2. Man kocht die Mischung bei 90 ° C für 5 min mit einem Heizblock oder Wasserbad. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g for 1 min. Laden der vorbereiteten Gels mit 5 ul der Markerprotein und 14 & mgr; l der Proben für die Analyse unter Verwendung einer 20 & mgr; l-Pipette mit einer Einwegspitze.
    3. Führen Sie einen Gel bei 25 Milliampere für 60 min. Sobald die Elektrophorese Schritt abgeschlossen ist, Übertragen des Gels zu einem Behälter mit 1 l Wasser und Mikrowelle für 5 min.
    4. Stain das Gel mit Färbelösung (40% Ethanol, 10% Essigsäure und 0,1% Coomassie Brilliant Blue) für 2 Stunden und destain in Wasser.

    6. Glykane massenspektrometrische Analyse

    1. Analysieren Glykane wie zuvor 44 beschrieben. Kurz gesagt, 75 & mgr; g von IgG1-Fc wurde mit Trypsin behandelt, dann mit PNGaseF zur Freisetzung von Glycanen 45 behandelt. Freigabe Glycane wurden permethyliert und durch Verwendung von Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) analysiert.

    7. Protokoll Anpassungen für spezielle Szenarien

    1. Markierung von Proteinen mit 15 N-markierte Aminosäuren (für ein 50 ml Volumen Transfektion)
      1. Verzichtet 5 mg jeder Aminosäure in einer einzigen sterilen Glasphiole. Resuspendieren mit 4 ml autoklaviertem Wasser (beachten Tyr nicht vollständig löslich zu machen, im Gegensatz zu Lys und Phe). Sterilisieren der Lösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 15 min. Die Lösung wird in etwa 50-60 ° C abkühlen.
      2. Für einen 50-ml-Transfektion Volumen, führen Sie Schritt 3.1.3 nach "3.1 Aufbau einer transienten Transfektion". Finden Sie in der ergänzenden Materialien Abschnitt für ein Beispiel mit entsprechenden Volumen.
      3. Für die Transfektion wurden die Schritte von "3. Aufbau einer transienten Transfektion" mit frischem Kulturmedium ersetzt mit markierten Aminosäurereste wie oben hergestellt.
      4. Nach 24 Stunden der Transfektion, am Tag der Kultur Verdünnung zurückzuziehen 5,0 ml vorgewärmtem Medium B, 40 ml vorgewärmtem Medium A und ein frisch autoklaviert 4 ml Aliquot der Aminosäuremischung (wie in Schritt 7.1.1 hergestellt. Oben) und fügen Sie 1ml vorgewärmtem Stammlösung von VPA-Lösung zu 50 ml frischem Verdünnungskulturmediums mit einer Endkonzentration von 4,4 mM VPA vorzubereiten. Fügen Sie dieses Medium zu der Transfektion Kultur mit einer sterilen serologischen Pipette.
      5. Übertragen Sie die transfizierten Kultur in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Äußeren der Kolben mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung, fügen Sie die vorbereiteten Verdünnungsmedium und der Kolben Transfer zurück zum inkubiert Shaker.
        Anmerkung: Medium A ist ein chemisch definierten, serumfreien Medium. Somit ist es möglich, eine andere Formulierung herzustellen. Kontaktieren Sie die Anbieter, um ein eigenes Medium A Vorbereitung, dass bestimmte Aminosäuren fehlt erhalten. Es ist möglich, dass alle Aminosäuren weggelassen, jedoch bevorzugen wir, Medium, das nur wenige ausgewählte Reste fehlt verwenden, da eine vollständige Ausfallmedium würde Verstellung Osmolarität nach Ergänzung erfordern. Wir haben uns für ein Lys-Tyr-Phe-Dropout Medium, ergänzt werden kann und nicht Osmolarität Einstellung. Furthermore das Medium A Lieferant nicht frei zu teilen die Konzentrationen von Mediumkomponenten; verwendeten wir 100 mg / L jeweils für Lys, Tyr und Phe mit Erfolg. Volumina der Transfektion und Expression Medium muss eingestellt werden, um die hinzugefügten Aminosäuren ausmachen. Hier sind die Anpassungen an den Protokoll oben für Isotopenmarkierung
    2. Ergänzen die Transfektion mit ein kleines Molekül
      1. Vorzubereiten 100 mM Stammlösung von 2-Deoxy-2-fluor-L-Fucose unter Verwendung von autoklaviertem Wasser und Sterilisieren dieser Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter.
      2. Für einen 50-ml-Kultur, fügen 125 ul (bei 250 & mgr; M) der Fucose analoge Lösung für die Transfektion und Verdünnungsmittel. Hinweis: Es wird unterlassen, eine weitere Volumeneinstellung durchzuführen, da die Zugabe des Substituenten bei dieser Konzentration beträgt nur 0,25% des gesamten Kulturvolumens .Es ist möglich, die Expression unter Verwendung von Kleinmolekül-Inhibitoren der Glycan Verarbeitung modifizieren. Hier werden wir die Bedingungen beschreiben, für die Aufnahme von 2-Desoxy-2-Fluor-L-Fucose, ein Inhibitor der Glycan Fucosylierung. Ergab> 90% ige Reduktion der Fucosylierung durch Addieren des analogen Fucose in einer Konzentration von 250 uM in der Transfektion und Verdünnungsmittel.

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Representative Results

High-Level-Proteinexpression und Reinheit

Diese optimierte Expressionssystem erzeugt eine hohe Ausbeute an glycosylierten Proteinen. Ein typisches Muster der Expression von IgG1-Fc (Figur 1) dargestellt. In diesem Fall, Tag 0 ist der Tag der Transfektion gefolgt von Tag 1 (Verdünnung), und die anschließende Kultivierung Tage bis Tag 5. Die Protein-Expression wird unter Verwendung des löslichen Expressionsfraktion in dem Rohmedium analysiert. Eine sehr kleine Menge an Protein-Expression wurde in Tag 1 beobachtet, als die Kultur Aliquot wurde 3 Stunden nach der Kultur Verdünnung entnommen. Dies ist einfacher, mit GFP-markierten Proteinen, die eine deutliche grüne Farbe in dem Kulturmedium anzu visualisieren. Eine solche Erhöhung wurde in der Expression des GFP-FcγRIIIa und GFP-ST6GalI von Tag 2 bis Tag 5. kein signifikanter Anstieg in der Expression wurde beobachtet zwischen Tag 4 und Tag 5 beobachtet Am Tag 5 wurden die Zellen <50%lebensfähigen und damit Kultur wurde geerntet, um die Proteolyse zu begrenzen. Affinitätsreinigung unter Verwendung einer Protein A-Säule zur IgG1 Fc oder Nickelsäule für GFP-FcγRIIIa ergab Proteine ​​mit hoher Reinheit (> 99% ist, 2), die Ausbeute (Tabelle 1) und vollständige Glykosylierung (Daten nicht gezeigt).

15 N oder 13 C-Isotop-Markierung von Proteinen und Glycane

Dieses System effizient exprimiert isotopisch angereicherten IgG1 Fc nach dem beschriebenen Protokoll. Obwohl eine geringe Abnahme der Proteinausbeute beobachtet (25-50%) wurden gut dispergierte Signale in einem 2D-NMR-Spektrum, das die Resonanzfrequenz des 1 H-Atome und die direkt gebundenen Amid 15 N-Atomen (Abbildung 3) korreliert gesehen. Dieses Niveau der Expression ermöglicht eine effiziente Proteinproduktion auf dem für das strukturbasierte Studien erforderlich (in der Regel 2-20 Skalamg Protein), und veranschaulicht die erfolgreiche Einbau des markierten Isotopen in das Protein. Der hohe Grad der Ähnlichkeit zwischen diesem Spektrum und veröffentlichten Spektren zeigen einen hohen Grad an Proteinmarkierung erfolgte mit minimaler Verwürfelung der 15 N-Etiketten 43.

Herstellung von Proteinen mit unterschiedlichen N-Glykane

Verschiedene glycoforms wurden mit den HEK293F und HEK293s Zellen produziert. Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) Analysen der enzymatisch freigesetzt N-Glykane zeigte die erwartete Glycoformen (Abbildung 4). Proteine ​​aus Zellen HEK293s hegte N-Glykane, die der Man 5 GlcNAc 2 Form waren und keine Fucose (Abbildung 4) enthalten ist, ausgedrückt. Glykane von HEK293F-exprimierte Material war komplexartigen, biantennären Formen mit Core Fucose und meist mit endständigenN-Acetylglucosamin (GlcNAc) oder kleiner Anteil der mono- oder di-galactosylierte (Gal) bildet. Obwohl sie nicht wissen, was die nativen N-Glykane von ST6GalI und FcγRIIIa sind, ist das Glykan Profil für IgG1 Fc sehr ähnlich IgG1 Fc aus menschlichem Serum 46 gereinigt. Die Hauptunterschiede sind der Grad der Modifizierung; IgG1 Fc aus humanem Serum zeigt einen höheren Grad an Galactosylierung als für die HEK293F Expression beobachtet. Zugabe von 2-Desoxy-2-fluor-L-Fucose, einem Inhibitor der Glycan Fucosylierung, in einen Ausdruck durchgeführt unter Verwendung des HEK293F Zellinie zeigte eine dramatische> 90% ige Reduktion der Inkorporation Fucose (Abbildung 4).

Abbildung 1
Abbildung 1: Hohe Ausbeuten von rekombinanten Proteinen sind durch die Expression von der pGEn2 Vektor gewonnen. (A - B) Zwei Ausdruck vReflektoren in dieser Studie verwendet wurden, aus einem Plasmid pIBI30, die einen Verstärker R-Kassetten und ein E. enthält erzeugten coli-Replikationsursprung. (C) Expressionsniveau des sezerniert IgG1 Fc-Protein nach transienter Transfektion HEK293F Zellen. SDS-PAGE-Analyse zeigt die Akkumulation von exprimierten Proteine ​​von Tag 0 bis Tag 5 und wird durch den Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Rückgewinnung der exprimierten Proteins aus dem Kulturmedium. (A) IgG1-Fc, (B) GFP-FcγRIIIa. "Medium" bezieht sich auf das Kulturmedium nach der Zentrifugation; FT = Durchflussfraktion aus der Reinigungskolonne. SDS-PAGE-Proben sind pr in nicht-reduzierenden Bedingungen ohne β-Mercaptoethanol epared. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abb. 3: Die Aminosäure selektive Markierung von IgG1-Fc-1 H- 15 N-hetero einzigen Quantenkohärenz-Spektrum von [15 N-Tyr; 15 N-Lys] -markiertem IgG1-Fc-exprimiert mit HEK293F Zellen in individuelle Medium A, ergänzt mit (15 N ) mit L-Tyr und L-Lys. Kreuz-Peaks wurden basierend auf früheren Berichten 43,47 zugeordnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abb. 4: Protein-Expression in Gegenwart von niedermolekularen Modulatoren der Glycan-Zusammensetzung N-Glycan-Profile von IgG1 Fc exprimiert in HEK293-Zellen unter Verwendung verschiedener Kulturbedingungen. Das obere Spektrum wurde mit Glykane isoliert vom IgG1-Fc-in HEK293s Zellen exprimiert vorbereitet. Das Zentrum Spektrum zeigt die IgG1 Fc Glykoformen von Material in HEK293F Zellen exprimiert und das untere Spektrum wurde hergestellt ähnlich erwarten Zellen wurden in der Gegenwart von einem Inhibitor von GDP-Fucose-Biosynthese, 2-Deoxy-2-fluor-L-Fucose gezüchtet. N-Glykane als Cartoon-Diagramme nach dem CFG-Konvention 5 vorgestellt: N- Acetylglucosamin (GlcNAc), blaue Quadrate; Mannose (Man), grüne Kreise; Fucose (Fuc) rote Dreiecke; Galactose (Gal), gelbe Kreise. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<tbody>
Eiweiß Ausbeute (mg / L)
IgG1 Fc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Tabelle 1: Ausbeute für verschiedene Proteine ​​in HEK293F Zellen exprimiert.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt die Proteinexpression über die transiente Transfektion von HEK293F oder S-Zellen. Die in den Barb und Moremen Labors etabliert optimale Transfektionsbedingungen beschäftigen eine kritische Kombination von Zelldichte und Reagenzienkonzentrationen eine hohe Effizienz der Transfektion zu erreichen. Kritische Überlegungen bei der Durchführung dieses Protokolls sind: die Aufrechterhaltung einer stabilen Kultur vor der Transfektion (mit konsistenten Kultur Verdopplungszeiten); Transfektion von aktiv wachsenden Zellen mit Zellviabilität größer als 95% (hergestellt durch Verdünnen Zellen auf 1 × 10 6 Zellen / ml 24 Stunden vor der Transfektion erreicht); Zelldichte bei der Transfektion sollte zwischen 2,5 bis 3,0 x 10 6 lebenden Zellen / ml mit einer Tragfähigkeit> 95% (Transfektion Dichte) in einer Kultur, die 90% Medium A und 10% Medium B sein; und Zugabe von DNA vor PEI Zugabe bei 3 ug / ml und 9 & mgr; g / ml 31; 1 in Medium conta: bei 24 Stunden nach der Transfektion die Kultur 1 verdünntining 4,4 mM Valproinsäure in einer Konzentration von 2,2 mM valprioc Säure in der verdünnten Kultur führt; die Produktionsphase Wachstum setzt sich dann in einer befeuchteten Schüttelkolben bei 37 ° C und 8% CO 2 für weitere 4-5 Tage. Die hier beschriebene Vektor wird optimiert und ein wichtiges Merkmal der löslichen Proteinexpressionssystem 32,42.

Wenn ein Zielprotein ausfällt, um auszudrücken, zusätzlich zu den oben genannten Faktoren, mehreren anderen Variablen kann zu niedrigen Ausbeuten bei. Sicherzustellen, dass die Protein-kodierende DNA Sequenz enthält Codons für die menschlichen Zellen optimiert. Dies kann mit mehreren Online-Quellen zu beurteilen. Sterilität während des gesamten Verfahrens ist von größter Bedeutung. Ein aktiv wachsenden und Reinkultur HEK293F Zellen sollten leicht körnig mit dem bloßen Auge erscheint, und das Medium sollte (insbesondere bei Zelldichten <1,0 x 10 6 Zellen / ml) vor allem klar sein.

Kulturen, die mit Bakterien oder Pilzen kontaminiert solltensofort entfernt werden, um die Ausbreitung zu verhindern. Ist es wichtig, einen gesunden Stammkultur erhalten. Dies wird durch Inokulation dieser Kulturen bei einer Dichte von 0,3 Zellen × 10 6 Zellen / ml erreicht. Lower Inokulationsdichten kann die Wachstumsrate durch die Begrenzung der Lieferung von verschiedenen Wachstumsfaktoren für Zellwachstum und Zellteilung 48 erforderlich verlangsamen. Als Kulturen wurden für mehr als 25 oder 30-mal passagiert worden waren, wurde eine Abnahme der Expression beobachtet. Aus diesem Grund agiert Kulturen mehr als 30 Mal verworfen.

Es ist möglich, das Protein in das Expressionsmedium verschlechtert wird, oder der Ausdruck Zeitraum zu lang ist, was zu einer Protein-Abbau. Aus diesen Gründen ist es zu empfehlen, um die Lebensfähigkeit der Kultur und die Proteinexpression zu jedem Tag zu überwachen, um eine optimale Expression Zeitrahmen zu bestimmen. Es ist wichtig, Proteine ​​so schnell wie möglich zu reinigen, nachdem das Ernten des Mediums. Bei einigen Proteinen ist es hilfreich, Protease-Inhibitoren durin schließeng Reinigung. Insgesamt haben diese Anpassungen die Rückgewinnung von Proteinen in der Barb und Moremen Labors 42,43 verbessert.

Die transiente Transfektion von HEK293-Zellen hat großen Nutzen für die Herstellung von löslichen Proteinen und Proteindomänen, die natürlich auf den sekretorischen Weg gezielte gezeigt. Es ist wahrscheinlich, dass die Produktion von zytoplasmatischen oder integrale Membranproteine ​​wird eine weitere Optimierung erforderlich. Ein Hauptvorteil dieses Systems ist die Muttersubstrate und Maschinen für die Proteinproduktion vorhanden und verfügbar in den HEK293-Zellen 49 sind. Dies erklärt weitgehend ihre Vorteile gegenüber anderen Herstellungsverfahren rekombinantes Protein wie Bakterien nicht oder nur beschränkt posttranslationale Modifikationen, Hefe und Baculovirus-Systeme mit korrekt gefalteten, aber unterschiedliche N-Glykoformen eingebaut 1,50,51.

Darüber hinaus ist das hier beschriebene Protokoll zeigt die zusätzliche Fähigkeit, um mit niedrigem Molekulargewicht umfassen comVerbindungen wie markierte Aminosäuren, markierte Glukose oder kleine Moleküle entwickelt, um den N-Glycan-Zusammensetzung zu modifizieren. Die HEK293-Zellen zu beweisen auch geschickt im Ausdruck der Nicht-Säuger-Proteine, einschließlich Pflanzenenzyme und unterstützt Co-Expression von mehreren Polypeptiden, für die Gewinnung von Protein-Komplexe (Daten nicht gezeigt).

Die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Glykoproteinen wird oft von Musterfertigung Herausforderungen behindert. Die hier beschriebene Proteinexpressionssystem überwindet diesen Nachteil durch die Verwirklichung post-translationale Modifikationen mit der natürliche Ergänzung von anspruchsvollen intrazellulären glycan Verarbeitungsenzyme 6. Diese robuste und einfache Protokoll wird für die transiente Transfektion von Suspensions menschliche HEK293-Zellen nachgewiesen. Dieses Verfahren zeigte eine signifikante Glykoprotein Ausbeute (> 95 mg / l) mit drei N-glykosylierte Proteine ​​und Ergänzungen wie markierte Aminosäurereste oder das kleine Molekül chemische inh zubringenibitor 2-Deoxy-2-fluor-L-Fucose. Die exprimierten Glycoproteine ​​weiter umgestaltet werden Nachreinigung, um eine breite Palette von definierten Glycoformen 52 vorzubereiten.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den Zuschüssen K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) und P01GM107012 (KWM) von den National Institutes of Health, und aus Mitteln des Roy J. Carver Lehrstuhl für Biochemie, Biophysik und Molekularbiologie an der Iowa State University unterstützt . Der Inhalt dieser Arbeit ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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Cellular Biology Ausgabe 106 Glykoprotein Immunglobulin G Fc Rezeptor rekombinanten Proteinen menschlichen HEK293F und HEK293s Zellen

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension
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Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

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