Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
De kunst van het produceren van recombinante eiwitten met complexe post-translationele modificaties is een grote uitdaging voor studies van de structuur en functie. De snelle vaststelling en hoge herstel van transiënt getransfecteerde zoogdiercellijnen richt deze barrière en is een effectieve manier tot expressie eiwitten die van nature via de ER en Golgi-gemedieerde secretorische pathway. Hier is een protocol voor het eiwit expressie met behulp van het menselijk HEK293F en HEK293S cellijnen getransfecteerd met een zoogdierexpressievector ontworpen voor hoge eiwit opbrengsten. De toepasbaarheid van dit systeem wordt aangetoond met behulp van drie representatieve glycoproteïnen die uitgedrukt met opbrengsten tussen 95-120 mg van het gezuiverde eiwit teruggevonden per liter cultuur. Deze eiwitten zijn de menselijke FcγRIIIa en rat α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, beide uitgedrukt met een N-eindstandige GFP fusie, alsook ongemodificeerd menselijk immunoglobuline G1 Fc. Deze robuuste systeem utilizes een serumvrij medium dat is aangepast voor expressie van isotopisch verrijkte eiwitten en koolhydraten structurele studies met massaspectrometrie en kernmagnetische resonantiespectroscopie. Verder kan de samenstelling van de N-glycan worden afgesteld door toevoeging van een kleine molecule bepaalde glycaan wijzigingen voorkomen op een wijze die de opbrengst vermindert.
Het produceren van hoge opbrengsten van de juiste gevouwen en post-translationeel gemodificeerde menselijke eiwitten voor een gedetailleerde analyse van de structuur en functie blijft een belangrijke uitdaging. Een groot aantal expressiesystemen beschikbaar die recombinante eiwitten met natief-achtige en gedrag produceren. Bacteriële expressiesystemen, voornamelijk Escherichia coli-stammen, zijn de meest toegankelijke en gebruikte gereedschappen in de onderzoeksarena, vanwege de eenvoud van deze expressiesystemen, ofschoon gist, plant, insect en zoogdier systemen zijn ook beschreven 04/01. Het merendeel van deze systemen zijn niet in staat geschikte posttranslationele modificatie van de doeleiwitten. Een fundamenteel belang van de Barb en Moremen laboratoria is het produceren van eukaryote eiwitten met de juiste glycosylering. Veel menselijke eiwitten nodig passende glycosylering voor de juiste functie (zie 5).
De eukaryotischeglycosyleringsmachinerie is uitgebreid en in staat om een uiteenlopende modificaties, zowel asparagine (N) – en serine / threonine (O) complex-gebonden glycanen 6. Geschat wordt dat> 50% van humane eiwitten N-geglycosyleerd 7. Glycanen essentiële componenten van verschillende proteïnen, waaronder therapeutische monoklonale antilichamen, erytropoëtine en bloedstollingsfactoren zoals factor IX, om een paar te noemen. Hoewel meerdere methoden bestaan om de juiste N-geglycosyleerde eiwitten te bereiden en variëren van puur synthetische 8-10, om chemoenzymatic 11-14 of herstel van ontworpen recombinante systemen 15-20, niet verrassend, menselijke expressie systemen hebben tot nu toe bewezen de meest robuust werkwijzen voor het genereren van humane eiwitten.
Veel therapeutische humane glycoproteïnen worden geproduceerd in recombinante systemen die gebruik zoogdiercellen. Systemen van de nota zijn de Chinese hamster ovarium (CHO), muis myeloom (NS0), baby hamster kidney (BHK), humane embryonale nier (HEK-293) en menselijke netvlies cellijnen die werkzaam zijn in de hechting of opschorting cultuur eiwitproductie 4,21,22. Echter, zoogdieren eiwitexpressiesystemen het genereren van stabiele cellijnen, dure kweekmedia en substraat geassisteerde transfectie procedures 23 vereist.
Zoogdiercel transfectie wordt bereikt met behulp van talrijke middelen zoals calciumfosfaten 24,25, kationische polymeren (DEAE-dextran, polybreen, polylysine, polyethylimine (PEI)) of positief geladen kationische liposomen 26-29. PEI is een polykationisch, geladen, lineair of vertakt polymeer (25 kDa) 26 dat een stabiel complex vormt met DNA en endocytose. Na aanzuren van het endosoom wordt PEI gedacht te zwellen, waardoor de scheuring van endosomen en afgifte van het DNA in het cytoplasma 26,30.
Tot voor kort, voorbijgaande transfectie in suspensiop kweek werd uitgevoerd door voorafgaande DNA / PEI complexvorming, gevolgd door toevoeging aan de 29 celkweek. Echter, Würm en medewerkers rapporteerden een zeer efficiënt protocol geoptimaliseerd voor recombinante eiwitproductie in HEK293 cellen die een DNA / PEI complex in situ 31,32 gevormd. Deze vermeden voorbereiding, sterilisatie van het complex, en de buffer te wisselen in een kweekmedium. Verdere optimalisatie door het opnemen van expressie verbeteren van plasmiden heeft geleid tot een aanzienlijke toename van de opbrengst 33. Hierin is een methode die voortbouwt op deze vooruitgang en is breed toepasbaar. Expressie mogen ook worden gewijzigd volgens de N-glycan samenstelling beïnvloeden.
De HEK293S cellijn met een gen deletie die N-glycan verwerking in een tussenstadium stopt, leidt tot de expressie van eiwitten met uniforme N-glycanen bestaande uit 2 N-acetylglucosamineresten plus vijf mannose residuen (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Deze cellenmissen het N-acetylglucosaminyl transferase I (GNTI) gen dat vereist is voor stroomafwaartse N-glycan verwerkende 36,37. Het gebruik van glycosyltransferase-remmers waaronder kifunensine, siaalzuur analogen en fucose analoge en 2-deoxy-2-fluor-fucose gelijksoortige gevolgen en beperkingen N-glycan verwerkende 38-41.
Het protocol hier gerapporteerde gebruikt pGEn2 vector zoals getoond in figuur 1 42,43, PEI bijgestaan transiënte transfectie in zoogdiercellen leidingen (HEK293F HEK293S of cellen) en de terugwinning van hoge opbrengsten op passende geglycosyleerd eiwit. Dit systeem is robuust en is geschikt voor diverse factoren, waaronder isotopen en glycan techniek voor de productie van grote titers van recombinante eiwitten.
Dit protocol illustreert eiwitexpressie via transiënte transfectie van HEK293F of S cellen. De in de Barb en Moremen labs opgericht optimale transfectie voorwaarden gebruik van een kritische combinatie van celdichtheid en reagensconcentraties hoog rendement transfectie te bereiken. Kritische overwegingen bij de uitvoering van dit protocol zijn onder andere: het behoud van een stabiele cultuur voor transfectie (met consistente cultuur verdubbeling keer); transfectie van actief groeiende cellen (verdunning cellen tot 1 x…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd financieel ondersteund door de subsidies K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) en P01GM107012 (KWM) van de National Institutes of Health, en door fondsen van de Roy J. Carver Afdeling Biochemie, Biofysica & Moleculaire Biologie aan de Iowa State University . De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
Glycerol | SIGMA | G5516 | |
Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |