Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
Konsten att producera rekombinanta proteiner med komplexa posttranslationella modifieringar utgör en stor utmaning för studier av struktur och funktion. Den snabba etablering och hög återhämtning från transient transfekterade däggdjurscellinjer behandlar denna barriär och är ett effektivt sätt att uttrycka proteiner som naturligt kanaliseras genom ER och Golgi-medierad sekretoriska vägen. Här är ett protokoll för proteinexpression med användning av humana HEK293F och HEK293S cellinjer transfekterade med en däggdjursexpressionsvektor designad för höga proteinutbyten. Tillämpligheten av detta system demonstreras med användning av tre representativa glykoproteiner som uttryckte med utbyten mellan 95-120 mg renat protein återvinns per liter kultur. Dessa proteiner är den humana FcγRIIIa och råttan α2-6 sialyltransferas, ST6GalI, båda uttryckta med en N-terminal GFP-fusion, såväl som det omodifierade humant immunoglobulin G1-Fc. Denna robusta systemet utilizes ett serumfritt medium som är anpassningsbar för expression av isotopiskt anrikade proteiner och kolhydrater för strukturella studier med användning av masspektrometri och kärnmagnetisk resonansspektroskopi. Vidare kan sammansättningen av den N-glykan avstämmas genom tillsats av en liten molekyl för att förhindra vissa glykan modifieringar på ett sätt som inte minskar utbytet.
Introduction
Producera höga utbyten av lämpligt vikta och posttranslationellt modifierade humana proteiner för detaljerad analys av struktur och funktion är fortfarande en stor utmaning. Ett stort antal uttryckssystem finns tillgängliga som producerar rekombinanta proteiner med nativ-liknande funktion och beteende. Bakteriella expressionssystem, främst Escherichia coli-stammar, representerar de mest tillgängliga och vanligen använda verktyg i forskningsarenan, på grund av enkelheten i dessa expressionssystem, även om jäst, växt-, insekts- och däggdjurssystem är också beskrivna 1-4. Majoriteten av dessa system är oförmögna att lämpliga post-translationell modifiering av målproteinerna. En grundläggande intresse Barb och Moremen laboratorier producerar eukaryota proteiner med lämplig glykosylering. Många humana proteiner kräver lämplig glykosylering för korrekt funktion (se 5).
Den eukaryotaglykosylering maskiner är omfattande och kan ge ett varierat utbud av modifieringar, både asparagin (N) – och serin / treonin (O) -länkade komplexa glykaner 6. Det uppskattas att> 50% av humana proteiner är N-glykosylerade 7. Glykaner är viktiga komponenter i många proteiner, inklusive terapeutiska monoklonala antikroppar, erytropoietin, och blod koagulationsfaktorer som faktor IX, för att nämna några. Även flera metoder finns för att förbereda sig på lämpligt sätt N-glykosylerade proteiner och sträcker sig från rent syntetisk 8-10, att chemoenzymatic 11-14 eller återhämtning från manipulerade rekombinanta system 15-20, inte helt oväntat, har humana expressionssystem som hittills visat sig vara den mest robusta metoder för att generera humana proteiner.
Många terapeutiska mänskliga glykoproteiner produceras i rekombinanta system med däggdjursceller. System att notera är den kinesiska hamsterovarie (CHO), mus myelom (NS0) Baby Hamster Kidney (BHK), humana embryonala njur (HEK-293) och mänskliga näthinnan cellinjer som används i vidhäftning eller suspensionsodling för proteinproduktion 4,21,22. Dock har däggdjursproteinexpressionssystem krävs generering av stabila cellinjer, dyra tillväxtmedier och substrat assisterad transfektion förfaranden 23.
Däggdjurscell transfektion uppnås med hjälp av ett stort antal medel inkluderande kalciumfosfater 24,25, katjoniska polymerer (DEAE-dextran, polybren, polylysin, polyetylimin (PEI)) eller positivt laddade katjoniska liposomer 26-29. PEI är en polykatjonisk, laddad, linjär eller grenad polymer (25 kDa) 26 som bildar ett stabilt komplex med DNA och är endocyteras. Vid försurning av endosomen är PEI tänkt att svälla, vilket leder till bristningar i endosomer och frisättning av DNA i cytoplasman 26,30.
Tills nyligen, transient transfektion i suspensiom kultur utfördes genom tidigare DNA / PEI komplexbildningen följt av tillsats till cellodlingen 29. Men Würm och medarbetare rapporterade en högeffektiv protokoll optimerad för rekombinant proteinproduktion i HEK293-celler som bildade en DNA / PEI-komplexet in situ 31,32. Detta undviks framställning, sterilisering av komplexet, och buffertutbyte i ett odlingsmedium. Ytterligare optimering genom att inkludera uttryck höjande plasmider ledde till betydande ökad avkastning 33. Häri är en metod som bygger på dessa framsteg och är brett tillämpbar. Uttrycks villkor kan också ändras för att påverka N-glykan komposition.
Den HEK293S cellinje med en gen deletion som stannar N-glykan bearbetning vid ett mellansteg, leder till expression av proteiner med enhetliga N-glykaner bestående av 2 N-acetylglukosaminrester plus fem mannosrester (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Dessa cellersaknar den N-acetylglukosaminyltransferas I (GntI) gen som krävs för nedströms N-glykan bearbetning 36,37. Användningen av glykosyltransferasaktiviteter inhibitorer inklusive kifunensine, sialinsyra analoger och fukos analoga och 2-deoxi-2-fluor-fukos har liknande effekter och gränser N-glykan bearbetnings 38-41.
Protokollet redovisas här använder pGEn2 vektorn som visas i figur 1 42,43, PEI assisterad transient transfektion in i däggdjursceller linjer (HEK293F eller HEK293S celler), och återvinning av höga utbyten av lämpligt glykosylerat protein. Detta system är robust och kan anpassas till olika faktorer, inklusive isotopmärkning och glykan teknik för produktion av stora titrar av rekombinanta proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll illustrerar proteinexpression via transient transfektion av HEK293F eller S-celler. De optimala transfektion villkoren i Barb och Moremen Labs anställa en kritisk kombination av celltäthet och reagenskoncentrationer för att uppnå hög effektivitet transfektion. Kritiska överväganden vid genomförandet av detta protokoll inkluderar: att upprätthålla en stabil kultur före transfektion (med konsekvent kultur fördubbling gånger); transfektion av aktivt växande celler (till följd av utspädning c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds ekonomiskt av bidragen K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) och P01GM107012 (KWM) från National Institutes of Health, och genom medel från Roy J. Carver Institutionen för biokemi, biofysik och molekylärbiologi vid Iowa State University . Innehållet i detta arbete är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
References
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
- Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
- Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
- Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
- Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
- Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
- Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
- Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
- Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
- Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
- Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
- Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
- Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
- Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
- Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
- Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
- Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
- Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
- Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
- Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
- Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
- Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
- Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
- Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
- Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
- Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
- Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
- Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
- Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).
