Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Au-Interaktion av Slp1 polymerer och monolager från Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

På grund av den ökande användningen av guld för flera applikationer som elektronik, katalysatorer, biosensorer, eller medicinska instrument, har efterfrågan på denna ädelmetall ökat under de senaste åren "tid 6-9. Guld liksom många andra ädelstenar och tungmetaller släpps ut i miljön via industriutsläpp i utspädda koncentrationer, genom gruvdrift och avfallshantering 7,8,10, även om de flesta miljöförorening av tunga eller ädelmetaller är en pågående process orsakas huvudsakligen av teknisk verksamhet. Detta leder till en betydande störning av naturliga ekosystem och skulle kunna hota människors hälsa 9. Att känna till dessa negativa utfall främjar sökandet efter nya tekniker för att avlägsna metaller från förorenade ekosystem och förbättringar återvinna metaller ur industriellt avloppsvatten. Väletablerade fysikalisk-kemiska metoder såsom utfällning eller jonbyte är inte så effektiva, särskilt i högtly utspädda lösningar 7,8,11. Biosorption, antingen levande eller död biomassa, är ett attraktivt alternativ för rening av avloppsvatten 10,12. Användningen av sådana biologiska material kan minska förbrukningen av giftiga kemikalier. Många mikroorganismer har beskrivits att ackumulera eller immobilisera metaller. Till exempel, celler av Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 har visat höga bindande kapacitet för ädelmetaller, t ex Pd (II), Pt (II), Au (III), och andra giftiga metaller som Pb (II) eller U (VI) 4,13, celler av Bacillus megaterium för Cr (VI) 14, celler av Saccharomyces cerevisiae för Pt (II) och Pd (II) 15, och Chlorella vulgärt för Au (III) och U (VI) 16 17. Bindningen av föregående metaller som Au (III), Pd (II), och Pt (II) har också rapporterats för Desulfovibrio desulfuricans 18 och för L. sphaericus JG-B53 19,20. Ändå inte all mikrober binder stora mängder metaller och deras tillämpning som sorberande material är begränsad 12,21. Vidare metallbindande kapacitet beror på olika parametrar, t.ex. cellkomposition, den använda bio-komponent eller miljömässiga och experimentella förhållanden (pH, jonstyrka, temperatur etc.). Studien av isolerade cellväggsfragment 22,23, som membranlipider, peptidoglykan, proteiner eller andra komponenter, hjälper till att förstå den metallbindande processer av komplexa konstruerade hela celler 8,21.

Cellkomponenterna fokuserade på i denna studie är S-skiktproteiner. S-skiktproteiner är delar av det yttre cellhölje av många bakterier och arkéer, och de utgör ca 15-20% av den totala proteinmassan av dessa organismer. Som det första gränssnittet för miljön, dessa cell föreningar starkt påverkar bakterie sorptionsegenskaper 3. S-skiktproteiner med molekylvikter som sträcker sig från fyrtiotill hundratals kDa produceras inuti cellen, men är monterade utanför där de kan bilda skikt på lipidmembran eller polymercellväggskomponenter. När isolerade, nästan alla S-skiktproteiner har den inneboende egenskapen att spontant själv montera i suspension, vid gränsytor, eller på ytor som bildar plana eller rörliknande strukturer 3. Tjockleken på proteinmonoskikt beror på bakterierna och är inom ett intervall av fem - 25 nm 24. I allmänhet kan de formade S-skiktproteinstrukturer har en sned (P1 eller P2), fyrkantig (p4), eller hexagonala (p3 eller p6) symmetri med gitterkonstanter på 2,5 till 35 nm 3,24. Den gallerbildning verkar vara i många fall beroende av divalenta katjoner och främst på Ca2 + 25,26, Raff, J. et al. S-lager baserade nanokompositer för industriapplikationer i Protein baserade Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (lämnas)). Icke desto mindre, den fullständiga reaktionskaskad av monomer vikning, interaktion monomer-monomer, bildandet av ett gitter, och betydelsen av olika metaller, i synnerhet av divalenta katjoner, såsom Ca2 + och Mg2 +, är ännu inte helt klarlagda.

Den grampositiva stam L. sphaericus JG-B53 (bytt namn från Bacillus sphaericus efter nya fylogenetiska klassificeringen) 27 isolerades från uranbrytning avfallet högen "Haberland" (Johann, Sachsen, Tyskland) 4,28,29. Dess funktionella S-skikt protein (Slp1) besitter en kvadrat galler, en molekylvikt på 116 kDa 30, och en tjocklek på ≈ 10 nm på levande bakterieceller 31. I tidigare studier har bildningen in vitro av en sluten och stabilt protein-skikt med en tjocklek av ca 10 nm uppnås på mindre än 10 minuter 19. Den relaterade stammen L. sphaericus JG-A12, även ett isolat från "Haberland" högen, har hög metallbindningskapaciteter och dess isolerade S-skiktet proteinet har visat en hög kemisk och mekanisk stabilitet och goda sorptionsegenskaper priserna för ädelmetaller som Au (III), Pt (II), och Pd (II) 4,32,33. Denna bindning av ädelmetaller är mer eller mindre specifika för vissa metaller och beror på tillgängligheten av funktionella grupper på den yttre och inre protein ytan av polymeren och i dess porer, jonstyrka och pH-värdet. Relevanta funktionella grupper för interaktion metall av proteinerna är COOH, NH2 -, OH, PO 4 -, SO 4 - och SO-. I princip, metallbindande kapaciteten öppnar ett brett spektrum av tillämpningar, Raff, J. et al. S-lager baserade nanokompositer för industriapplikationer i Protein baserade Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (lämnas)). t.ex. som biosorptive komponenter för avlägsnande eller återvinningav lösta giftiga eller värdefulla metaller, mallar för syntes eller definierade avsättning regelbundet strukturerade metalliska nanopartiklar (NPS) för katalys, och andra biologiskt konstruerade material som bio-sensoriska skikten 3,5,18,33. Regelbundet arrangeras NP arrayer som Au (0) -NPs skulle kunna användas för stora tillämpningar som sträcker sig från molekylär elektronik och biosensorer, ultrahög lagringskapacitet enheter och katalysatorer för CO-oxidation 34-37. Utvecklingen av sådana ansökningar och smart design av dessa material kräver en djupare förståelse av de underliggande metall bindande mekanismer.

En förutsättning för utvecklingen av sådana biobaserade material är tillförlitlig genomförandet av ett gränsskikt mellan biomolekylen och den tekniska ytan 38,39. Exempelvis polyelektrolyter monterad med lager-för-skikt (LBL) teknik 40,41 har använts som ett gränsskikt för omkristallisation av S-skiktproteiner 39 19,42, Raff, J. et al. S-lager baserade nanokompositer för industriapplikationer i Protein baserade Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (lämnas)). Emellertid är den komplexa mekanismen för proteinadsorption och interaktion protein-yta inte fullständigt klarlagd. Speciellt information om konforma, mönster orientering och beläggningstäthet saknas fortfarande.

Kvartskristallmikrovåg med förlustövervakning (QCM-D) teknik har uppmärksammats de senaste åren som ett verktyg för att studera proteinadsorption, beläggnings kinetik och interaktion proprocesser på nanometerskala 19,43-45. Denna teknik gör det möjligt att den detaljerade detektering av mass adsorption i realtid, och kan användas som en indikator för proteinsjälvsammansättningsprocessen och koppling av funktionella molekyler på proteingitter 19,20,42,46-48. Dessutom QCM-D mätningar öppnar möjlighet att studera interaktionsmetallprocesser med det proteinskikt under naturliga biologiska förhållanden. I en nyligen genomförd studie, interaktionen av S-skiktet protein med utvalda metaller såsom Eu (III), Au (III), Pd (II), och Pt (II) har studerats med QCM-D 19,20. Det adsorberade proteinskikt kan tjäna som en förenklad modell av en cellvägg av grampositiva bakterier. Studiet av denna enda komponent kan bidra till en djupare förståelse av interaktion metall. Dock inte enbart QCM-D experiment tillåter inte påståenden om strukturer och influenser av metaller till protein yta. Andra tekniker är nödvändiga för att erhålla sådan information. En postagande för avbildning bio-nanostrukturer och få information om strukturella egenskaper är atomkraftsmikroskop (AFM).

Målet för den presenterade studien var att undersöka sorption av guld (Au (III) och Au (0) -NPs) till S-skiktproteiner, särskilt Slp1 L. sphaericus JG-B53. Experiment gjordes med suspenderade proteiner på satsskala i ett pH-intervall av 2,0-5,0 med hjälp av ICP-MS och med immobiliserade S-skikt med användning av QCM-D. Dessutom var påverkan av metallsaltlösningen på gitterstabilitet undersöktes med efterföljande AFM studier. Kombinationen av dessa tekniker bidrar till en bättre förståelse av in vitro interaktionsmetallprocesser som ett verktyg för att lära sig mer om bindande händelser hela bakterieceller avseende specifika metall tillhörighet. Denna kunskap är inte bara avgörande för utvecklingen av tillämpliga filtermaterial för återvinning av metaller för miljöskydd och bevarande av rekällor 49, men också för att utveckla uppsättningar av högt ordnade metall NP för olika tekniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikroorganism och odlingsbetingelser

Anm. Alla experiment gjordes under sterila förhållanden L. sphaericus JG-B53 erhölls från en kryo-bevarade kultur 29,30.

  1. Överföring Cryo-bevarad kultur (1,5 ml) under rena bänken till 300 ml steril näringsbuljong (NB) substrat (3 g / I köttextrakt, 5 g / L pepton, 10 g / L NaCI). Efteråt omrördes lösningen under minst 6 h vid 30 ° C för att erhålla den förodling för odling.
  2. Odla bakterierna under aeroba betingelser i NB media vid pH = 7,0, 30 ° C i en 70 L skalas ånga-på-plats bioreaktor. Därför fyller reaktorn med ≈ 57 L avjoniserat vatten. Lägg till och upplösa fast NB media direkt i bioreaktor (koncentrationer se ovan).
    1. Dessutom tillskumdämpare (30 ul / L NB-media) till media för att undertrycka skumbildning under odling, sedan autoklav (122 ° C, temperatur hålltid 30 min) mediainuti reaktoranläggning.
  3. Kyl ner media och utför fullständig syremättnad. Justera pH till 7,0 (med användning av en MH 2 SO 4 och 2 M NaOH) och starta den automatiska inokulering av 300 ml förkultur. Starta datainsamling odlingsparametrar vid inokuleringspunkten. Logga på nätet parametrar t.ex. löst syre (DO 2), syra och bas Dessutom och pH-värden inom odling.
    1. Övervaka bakterietillväxt på nätet genom icke-invasiva mätningar grumlighet.
  4. Utför ytterligare provtagning efter varje timme för odling och bestämma ytterligare parametrar såsom bio torrvikt (BDW) och offline optisk densitet (OD). Därför samlar 20 ml odlingsbuljong vid varje provtagningspunkt under sterila förhållanden.
    1. Bestäm offline OD av fotometriska mätningar av adsorption vid 600 nm. Använd sterila filtrerade NB-mediet som ett tomt värde. Akterer når adsorption> 0,4 ​​utspädd cellsuspensionen efter linearitet Lambert-Beers lag.
    2. För bestämning av BDW centrifug 1 till 5 ml av bakteriesuspension (beroende på celltäthet) vid 5000 xg under 5 min vid RT. Torka den erhållna cellpelleten vid 105 ° C i en värmeugn upp till mass stabilitet och mäta pelletmassan.
  5. Ta mikroskopiska bilder med optisk fas kontrastforskningsmikroskop i 400 och 1000 gångers förstoring (faskontrast kondensorn 2 respektive 3) för kontroll av bakterietillväxt och som en korskontaminering.
  6. Efter att ha nått den exponentiella tillväxtfasen detekteras av nätet dO 2 och online grumlighet, skörda biomassan genom genomströmningscentrifugering vid 15 tusen xg, 4 ° C och tvätta biomassan två gånger med standardbuffert (50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Obs: Den erhållna pellets biomassa kan förvaras vid -18 & #176; C tills vidare användning för isolering.

2. S-skikt Protein Isolering och rening

Obs: Rena Slp1 polymerer enligt en anpassad metod som beskrivits tidigare 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogenisera den tvättade och tinats rå biomassa erhållen från odling i standardbuffert (1: 1 (vikt / volym)) för att avlägsna flagella genom användning av en dispergeringsanordning (nivå 3, 10 min) under isbad kylning vid 4 ° C.
  2. Centrifugera suspensionen (8000 xg, 4 ° C under 20 min) och tvätta den erhållna pelleten två gånger med standardbuffert (1: 1 (vikt / volym)). Efter tvättning och centrifugering (8000 x g, 4 ° C under 20 min), suspendera pelleten i standardbuffert (1: 1 (vikt / volym)), tillsätt DNas II och RNas (0,4 enheter / g biomassa) till suspensionen och sönderdelas cellerna vid 1000 bar med en högtryckshomogenisator. Centrifugera Efteråt suspensionen vid 27,500 xg, 4 ° C under 1 timme.
    Obs: Styr cellsuspensionen med forsknings mimikroskop. Bristning är fullbordad när mindre än 2 - 3 intakta celler är synliga i vyn området för mikroskopet i 400 gångers förstoring.
  3. Tvätta pelleten två gånger med standardbuffert (1: 1 (vikt / volym)) och utför centrifuger igen. Efteråt återsuspendera pelleten i standardbuffert (2: 1 (vikt / volym)) blandas med 1% Triton X-100 och inkubera det i 20 minuter under successiv skakning (100 varv per minut) för att solubilisera fettavlagringar.
  4. Centrifugera lösningen (27,500 xg, 4 ° C under 1 h) och tvätta de erhållna pellet tre gånger med standardbuffert (1: 1 (vikt / volym)).
  5. Inkubera pelleten som erhölls efter ytterligare centrifugering (27,500 x g, 4 ° C under 1 h) under 6 h i standardbuffert (1: 1 (vikt / volym)) blandades med 0,2 g / I lysozym, att hydrolysera bindningar i peptidoglykan 50. Dessutom lägga DNas II och RNas (vardera 0,4 enheter / g biomassa) till suspensionen.
  6. Efter centrifugering (45,500 x g, 4 ° C, 1 h), återsuspendera den övre vita protein fas med en låg volym av than centrifugeringssupernatant (<30 ml) innehållande proteinsubenheter.
  7. Solubilisera den vita suspensionen genom att blanda 1: 1 med 6 M guanidin-hydroklorid (6 M GuHCl, 50 mM Tris, pH = 7,2). Lösningen blir ljust.
  8. Utför sterilfiltrering (0,2 ^ m) av GuHCl behandlade lösningen följt av ytterligare höghastighetscentrifugering (45,500 x g, 4 ° C under 1 h).
  9. Överför supernatanten till dialysmembranrören (MWCO 50 tusen Dalton) och dialyserades den mot omkristallisation buffert (1,5 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH = 8,0) under 48 h.
  10. Överför vita rekristalliserad proteinpolymerlösning i rör och centrifugera vid 45.500 xg, 4 ° C under 1 timme. Återsuspendera pelleten i en liten volym av ultrarent vatten (<30 ml).
  11. Efteråt, överför suspensionen i dialys membranrör och utföra en dialys mot ultrarent vatten under 24 timmar för att ta bort buffertinnehåll.
    Obs: Flera ändringar av buffert eller ultrarent vatten dnder dialys är oumbärliga.
  12. Lyofilisera den renade Slp1 i en frystork.

3. Karakterisering och kvantifiering av Slp1 för försöken

Obs: Slp1 koncentration för sorptions- och beläggnings experiment kvantifierades genom UV-VIS-spektrofotometri.

  1. Pipettera 2 pl löst Slp1 prov direkt på den nedre mätningen piedestal av fotometern. Bestäm proteinkoncentrationen vid adsorption maximum vid en våglängd av 280 nm, karakteristiska för proteiner. Använd extinktionskoefficienten för 0,61 för att bestämma Slp1 koncentration. Använd Slp1 gratis lösning för referensmätningar.
  2. Späd proteinet med bufferten (för sorptions- experiment i batch-läge använder 0,9% NaCl, pH = 6,0 och för QCM-D experiment använder omkristallisation buffert, pH = 8,0) till önskad koncentration för experiment (1 g / L och 0,2 g / L respektive).
  3. Analysera Slp1 kvalitet och molekylvikt av standarden bioanalytical metod natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-elektrofores (SDS-PAGE) som beskrivits av Laemmli, UK 52.
    1. Utför SDS-PAGE innan du använder Slp1 inom experiment och t.ex. efter Au (0) -NP inkubation med användning av 10% polyakrylamid separations geler.
    2. För SDS-prov mix ≈10 il av odling eller proteinprov med provbuffert (1,97 g TRIS, 5 mg bromofenolblått, 5,8 ml glycerin, 1 g SDS, 2,5 ml β-merkaptoetanol, fyll på med ultrarent vatten till 50 ml) i ett förhållande av 1: 1 (volym / volym) och pipettera blandningen efter 4 min inkubation vid 95 ° C in i gelén fickor.
    3. Kör SDS-PAGE 30 minuter vid en spänning av 60 V tills proverna passera uppsamlings gel och förändring spänningen till 120 V gång passerar separationsgelen.
    4. Avlägsna gelerna från gelén systemet, skölj med ultrarent vatten och plats för en timme in fixeringslösning (10% sur syra, 50% absolut etanol). Efteråt, skölj geler med ultrarent vatten.
    5. Stain gelergenom att använda en anpassad ospecifik kolloidalt Coomassie brilliant blue metod 53,54. Efter avfärgning 72,73, ta SDS-PAGE-bilder genom gelén dokumentationssystemet enligt tillverkarens protokoll.

4. Sorption Experiment i Batch-läge och Metal Kvantifiering

  1. Vid sats sorption experiment förbereda Au (III) stamlösning från HAuCl 4 ∙ 3 H2O, utspädd metallsaltet och blanda den med den Slp1 / NaCl-lösning till en initial metallkoncentration av 1 mM och slutlig Slp1 koncentration av 1 g / I . Utföra experiment i tripletter med en ytterligare negativ kontroll utan Slp1. Använd en total volym av 5 ml för sorptions- experiment.
  2. Skaka suspensionen kontinuerligt vid RT på olika förinställda justerade pH-värden mellan 2,0-5,0 under 24 timmar (justera pH med låg koncentrerad HCl och NaOH-lösning).
  3. Efter sorption, centrifugera proverna vid 15 tusen xg, 4 ° C under 20 min) till separåt Slp1 från supernatanten.
  4. Överför supernatanten i ultrafiltreringsrören (MWCO 50 tusen Da) och centrifugera det vid 15.000 xg, 4 ° C under 20 minuter för att avlägsna upplöst protein monomerer.
  5. Bestäm metallkoncentrationen i den resulterande filtratet genom ICP-MS 19,20 och använda resultaten för back-beräkning av sorberad metall av Slp1 torrvikt. Mätning principer, har möjligheter metoden och komponenter i den använda ICP-MS beskrivs i litteraturen 55.
    1. Förbered prover och referenser för ICP-MS mätningar med 1% HNO3 som matris och rodium som en intern standard (1 mg / ml).

5. Syntes av Au-NP och bestämning av partikelstorlek

Obs: Citrat stabiliserad Au (0) -NP syntetiserades enligt en anpassad metod som tidigare beskrivits av Mühlpfordt, H. et al. (1982) för att erhålla sfäriska partiklar med en diameter av 10-15 nm 56,57

  1. Förbered en stabiliserad 25 mM HAuCl 4 ∙ 3 H2O lager för NP-uppställning.
  2. Späd 250 pl av denna stamlösning i 19,75 ml ultrarent vatten och inkubera dessa vid 61 ° C under 15 min under successiv skakning.
  3. Bered 5 ml av en andra stamlösning (12 mM garvsyra, 7 mM natriumcitrat di-hydrat, 0,05 mM K 2 CO 3) och inkubera 2: a lösningen separat vid 61 ° C under 15 minuter.
  4. Lägg under ständig omrörning 2: a stamlösningen till lösningen en. Rör om reaktionsblandningen under åtminstone 10 min vid 61 ° C. Efteråt kyla ned lösningen och använda den för NP beläggning på Slp1 gitter inom QCM-D experiment.
    Obs: Den erhållna Au (0) -NP karakteriserades med UV-VIS-spektroskopi vid maximal absorbans 520 nm, som typiskt används för detektion av bildad Au (0) -NPs 58. Lösningen kan lagras vid 4 ° C.
  5. Analysera storleken av den bildadeAu (0) -NP genom fotonkorrelationsspektroskopi (PCS), som också är känd som dynamisk ljusspridning.
    1. För bestämning av NP storlek, överföra 1,5 ml av syntetiserat Au (0) -NP lösningen i kyvetter i dammfria förhållanden i en inloppslåda laminär och analysera den med en storlek och zetapotentialen partikelstorleksmätare. En detaljerad beskrivning av PCS och provberedning ges i Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 och Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D Experiment - Slp1 Coating på ytor och Au-NP Adsorption på Slp1 Lattice

Obs: Mätningar genomfördes med en QCM-D utrustas med upp till fyra flödesmoduler. Alla QCM-D experiment utfördes med en konstant flödeshastighet av 125 | j, l / min vid 25 ° C. Slp1 beläggning och metall / NP inkubation gjordes på SiO 2 piezoelektriska AT-skuren kvartssensorer (Ø 14 mm) med en grundfrekvens ≈ 5 MHz. Sköljningssteg och tillsättition lösning är markerade i siffrorna för den representativa resultat del. QCM-D experiment kan beskrivas som en steg för steg sätt börjar med rengöring och ytbearbetning av de använda sensorer följt av Slp1 omkristallisation och senare på metall och metall NP interaktion.

  1. Rengöringsprocedurer:
    1. Utrusta fluid cellerna med sensor dummies. Pump på minst 20 ml (vardera per modul) av ett alkaliskt flytande rengöringsmedel (2% rengöringsmedel i ultrarent vatten (volym / volym)) genom QCM-D och rörsystem. Efteråt pumpa den femfaldiga volymen (vardera per modul) av ultrarent vatten genom systemet (flödeshastighet på upp till 300 | j, l / min). Utför rengöringen enligt tillverkarens protokoll.
    2. Rengör SiO 2 sensorer utanför flödesmodulerna genom inkubation (minst 20 min) i 2% SDS-lösning och skölj sensorerna efteråt flera gånger med ultrarent vatten 61,62.
    3. Torka kristallerna med filtrerat compressed luft och placera dem i en ozonrengöringskammaren för 20 min 63,64.
    4. Upprepa rengöringsproceduren två gånger för att avlägsna alla organiska innehåll.
    5. För att ta bort bundna metaller från sensorytan skölj sensorerna med 1 M HNO3. Efteråt, utföra alla sköljningssteg med ultrarent vatten.
  2. Sensor Ytmodifiering av Polyelektrolyter:
    Obs: Ytmodifiering kan göras antingen inuti (strömma genom förfarandet) eller utanför flödesmodulen (LBL-teknik). Inom dessa experiment på följande sätt för att modifiera de ytor användes.
    1. Ändra sensorerna med 3 g / L alternerande PE skikt av polyetylenimin (PEI, MW 25000) och polystyrensulfonat (PSS, MW 70000) via doppbeläggning med hjälp av LBL-teknik 40,41 beskrivits tidigare för den speciella använda systemet i artikeln av Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Placera sensorerna innanför lämplig PE-lösning i djup wELL plattor och inkubera dessa för 10 min vid RT.
    3. Ta sensorerna av PE-lösning och skölj sensorerna mellan varje doppbeläggning steg intensivt med ultrarent vatten.
      Obs: Den nya ytmodifiering består av åtminstone tre PE-skikt som avslutas med positivt laddade PEI.
    4. Efter denna externa modifiering placera sensorer inuti flödesmodulen och jämvikt sensorerna genom att skölja med ultrarent vatten innan experimenten.
  3. Slp1 Monolayer Omkristallisation:
    1. Lös Slp1 i 4 M urea för att konvertera polymerer till monomerer.
    2. Centrifugera monomerized proteiner vid 15 tusen xg, 4 ° C under 1 h för att avlägsna större protein agglomerat.
    3. Blanda den solubiliserade och centrifugerades Slp1 supernatanten med omkristallisation buffert till en slutlig proteinkoncentration av 0,2 g / I.
      Obs: Kalcium beroende omkristallisation av Slp1 (själv montering) börjar med tillsats av recrystallization buffert. Därför pumpa den blandade lösningen med en flödeshastighet av 125 ul / min till sensorerna (placerad inuti flödes moduler) omedelbart. Omkristallisationen sker efter stabila värden på frekvens och försvinnande skift upptäcktes i QCM-D experiment.
    4. Efter lyckad protein omkristallisation ovanpå de PE-modifierade sensorer inuti flödesmodulerna skölja de belagda sensorer med omkristallisation buffert eller ultrarent waterintensively med en flödeshastighet av 125 | j, l / min tills stabila värden på frekvens och försvinnande skift detekterades.
      Obs: SiOa 2 ytmodifiering med PE för senare sorptions- experiment Onto Slp1 enskikts- och AFM studier åskådliggörs i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Schematisk design av PE Ytmodifiering och Slp1 MonoBeläggning; Denna siffra har ändrats från Suhr, M. et al. (2015) 19 med tillstånd från Springer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Metall och Metal NP Interaction:
    Obs: sorptionen med Au metallsaltlösningen (HAuCl 4 ∙ 3 H2O) utfördes i koncentrationer av 1 mM eller 5 mM vid pH = 6,0 i 0,9% NaCl-lösningar. Au-NP adsorption utfördes med outspädd au-NP i 1,6 mM tri-natrium-citratbuffert vid pH ≈ 5,0.
    1. Efter framgångsrik Slp1 beläggning i flödesmodulerna, skölj erhållna Slp1 skiktet intensivt med 0,9% NaCl-lösning till dess att stabila värden på frekvens och försvinnande skift upptäcktes.
    2. Pumpa den framställda metallösningen (1 mM) och NP-lösning till de flödesmodulerna med en flödeshastighet av 125 ul / min och spåra massan adsorption till Slp1 skiktet. Mass adsorption kan upptäckas direkt genom att spåra frekvensskift som hänvisar till Sauerbrey ekvationen (ekvation 1).
    3. Efter avslutad metall och metall NP interaktion, skölj lagret med metall / NP buffert att ta bort svaga bundna eller svaga bifogade metaller eller nanopartiklar.
      Anmärkning: En illustration av experimentuppställningen visas i fig 2.

Figur 2
Figur 2. Schematisk Utformning av QCM-D inställning med Flow Module QFM 401 * 66. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

  1. Dataregistrering och utvärdering:
    1. Spela in förändringar i frekvens i Hz (Af n) och försvinnande (AD n) Inom QCM-D experiment genom att använda QCM-D särskild programvara.
    2. Används för utvärdering av den adsorberade massan känslighet (AM) i Sauerbrey ekvation / modell (ekvation 1) 65 66 som gäller för tunna och styva filmer kopplade utan friktion sensorytan appliceras på n: te överton. Termen C (Sauerbrey konstant) för den använda 5 MHz AT cut kvarts sensor är 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. För stela, jämnt fördelade, och tillräckligt tunna adsorberade skikt använder ekvation 1 som en god approximation.
      Ekvation 1
    3. Utför ytterligare modellering enligt Kelvin-Voigt modell gäller för viskoelastiska molekyler 68-71 med specifika programvarutillverkaren och jämföra resultaten med den i Sauerbrey modellen.
    4. För beräkningen av skikttjocklek och massanvändning adsorptionlika viktigt modellering parameter ett skikt densitet av adsorberat skikt av 1,35 g ∙ cm -3 motsvarande värdena som beskrivits tidigare för S-skiktproteiner 72-75. Använd samma värde för beräkning av interaktions metall med det proteinhaltiga skiktet.

7. AFM Mätningar

  1. Utför studier med fullt kapabel AFM på ett inverterat optiskt mikroskop.
    1. Spela AFM-bilder i flytande med hjälp av omkristallisation buffert eller ultrarent vatten direkt på de belagda QCM-D sensorer.
    2. Skölj sensorerna med ultrarent vatten efter QCM-D experiment och placera dem i AFM vätske cellen. Därför använder en sluten fluid cell med en total volym av ca 1,5 ml. Håll temperaturen hos fluidcellkonstanten vid 30 ° C.
    3. Använd en fribärande med en resonansfrekvens för ≈ 25 kHz i vatten och en styvhet på <0,1 N / m. Justera skanningshastighet mellan 2,5 och 10 ^ m / sek.
      4. 76.
      Obs: Höjd bilder visas med z-skala medan z-värdena representerar den exakta topografi ytan. Amplitud (Pseudo 3D) bilder visas utan z-skala eftersom amplitud z-värden beror på skanningsparametrar och bära begränsad information. Analys av bilder utfördes med hjälp av tre olika utvärderings programvaran 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Odling av mikroorganismer och Slp1 Characterization

De registrerade uppgifterna för bakterietillväxt indikerar slutet av den exponentiella tillväxtfasen på cirka 5 timmar. Tidigare undersökningar har visat att Slp1 kan isoleras ur denna synpunkt skörd (4,36 g / L våt biomassa (≈ 1,45 g / L (BDW)) med en maximal avkastning 19. Ändå optimering av odling med hjälp av definierade materialkomponenter eller federationen satsodlingsstrategier skulle leda till högre avkastning biomassa. Detta är omistlig för användningen av höga halter av biomassa för industriella applikationer. Värdena från nätet och offline registrerade odlings parametrar sammanfattas i figur 3A. Mikroskopisk kontroll (figur 3B) vid tiden skörde visar icke-sporulerade celler av L. sphaericus JG-B53.


Figur 3: (A) online och offline mätt odlingsparametrar L. sphaericus JG-B53 och (B) mikroskopisk bild av vitala bakterieceller av L. sphaericus JG-B53 vid tidpunkten för skörd i 400 gångers förstoring; Denna siffra har ändrats från Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillstånd från Springer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Också en ytterligare gjort SDS-PAGE proteinprofilen (Figur 4A) anger den maximala mängden Slp1 vid tidpunkten för 5 timmar av odling. Proteinbandet motsvarar Slp1 (≈ 150 kDa) är tjockare, men härifrån på en förlust i intensitet observerades accompanerat genom en ökning av proteiner med lägre molekylvikt orsakad av möjliga protein fragmentering eller segregering av andra proteiner. Banden av isolerade och renade proteiner erhållna genom förfarandet som nämns ovan (Figur 4B) motsvarar en molekylvikt av ca 150 kDa, som är tyngre än den beräknade räknat på sekvenseringsdata för Slp1 (116 kDa) 30. Detta beror förmodligen på posttranslationella modifieringar. Andra orsaker till den bristande överensstämmelsen mellan teoretisk molekylvikt och den observerade molekylvikt i SDS-geler är möjligen ut beroende artefakter i SDS-gelen 30.

Figur 4
Figur 4. Proteinprofiler Gjord av SDS-PAGE av (A) upplöstes bakterieceller erhållna från odlingsprover och (B) renat Slp1 efter framgångsrik isolering; Denna figur har modifierats Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillstånd från Springer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Batch-sorption Experiment och bestämning av Au med ICP-MS

De maximala metallbindningskapaciteter (Q max) Au (III) genom suspenderades Slp1 visas i figur 5. Resultaten visar att Au (III) stabilt bunden av Slp1 under 24 timmars inkubering inom det undersökta pH-området. Resultaten tyder på q max i området ca 80-100 mg Au (III) / g Slp1. De sammanfattade värdena (Tabell 1) jämfördes med sorption kapacitet på ca 75 mg Au (III) / g Slp1 rapporterade tidigare av Suhr, M. et al. (2014) som erhållits från försök med självjusterandepH-värden genom tillsats av metallsaltlösningen (pH ≈ 4,3) 19. Sammanfattningsvis har Slp1 visat förmågan att binda stora mängder ursprungligen lagt Au (III) bevisar sin höga bindande kapacitet för detta element.

Figur 5
Figur 5. Diagram över Högsta Metal Bindande Kapacitet (q max) Au (III) till Slp1 polymerer inom pH-justerade experiment jämfört med sorptions resultat med självjusterade pH-värden (≈ 4.3) rapporterats av Suhr, M. et al. (2014) 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De beräknade avverkning effektivitetsvinster (RE) inom det undersökta pH-området var mellan 50-60% vilket bekräftar återtat som gjorts av Suhr, M. et al. (2014), där värden på omkring 40% uppnåddes. I tidigare gjorda experiment, starka interaktioner av Au (III) med de funktionella grupperna, t.ex., carboxylic-, hydroxyl- och aminogrupper, har har observerats för S-skiktproteiner som Slp1 och för jämförelseproteinet SlfB L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) upptäcktes spektroskopiskt en stark växelverkan mellan Au (III) huvudsakligen med karboxylgrupper i SlfB som också kan härledas till Slp1 L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Även inneboende protein egenskaper som skulle minska Au (III) Au (0) i frånvaro av reduktionsmedel kan vara en orsak till den starka växelverkan 79. Vidare visar resultaten av denna studie visar tendensen hos en föredragen bindning av Slp1 vid lägre pH-värden. Å andra sidan, en bindning vid lägre pH-värden kan också leda till en denaturering av Slp1. Studier till Slp1 visat sig vara en proteinstabilitet ned till pH =3,0 (opublicerade resultat). Från desorptionstest under sura betingelser, med hjälp av t ex salpetersyra eller använda komplexbildare som EDTA eller citrat (data ej visade), verifierar att guld stabilt var bundet och kunde inte befrias från Slp1 polymerer.

Au (III) på Slp1 L. sphaericus JG-B53
c initial (mg / L) 196,97
pH 5 4,5 ≈ 4,3 23 4 3,5 3 2,5 2
värde
Q max 88,3 85,3 74,7 102,5 94,1 81 101,9 96,9
(mg Au (III) / g Slp1)
RE 47,1 47,8 37,9 57,1 54,1 44,8 58,7 56,5
(%)

Tabell 1: Maximal metallbindande kapacitet (q max) och Metal Removal Efficiencies (RE) av Batch-sorptionsegenskaper Experiment med Au (III) och Slp1 Polymers i analyserade lösningen ICP-MS. Data jämfördes med tidigare publicerade resultat från Suhr, M. et al. (2014) 19.

Slp1 Monolayer Omkristallisation Band av QCM-D

Den omedelbara minskningen i frekvens (Af 5, Af 7, Af 9, Af 11) indikerar en snabb adsorption och en hög affinitet av proteiner till PE modifierade ytan (figur 6A). Lika med den snabba förändringen i frekvens, avledning (AD 5, AD 7, AD 9, AD 11) ökar också omedelbart. Detta faktum indikerar en adsorption av viskoelastiska molekyler till ytan på grund av snabb dämpning resulterar i ökande försvinnandevärden. Den maximala frekvensskiftet uppnås efter 5 min med ett värde på ≈ 95 Hz och AD 4,2. I ett senare skede förekommer endast omdisponeringar av omkristalliserad Slp1. Slp1 adsorption sålunda genomfördes mer än 60 minuter för att säkerställa than bildandet av en nästan helt täckt yta och regelbundet beställt protein gitter. Experimentet visar att den positivt laddade PE-skiktet är omistlig för att uppnå stabila beläggningar, leder negativ sluttid ändring på en svag adsorption och längre beläggnings kinetik (data ej visade) 38. Svagt bifogade proteiner och agglomerat avlägsnades genom sköljning med Slp1 fria omkristallisation buffert. De små förändringar i Af n bekräftar den låga protein desorption och stabil adsorption av Slp1. Trots detta slöseri sjunker ner till ≈ 2.8 indikerar att större elastiska molekyler tas bort.

Figur 6
Figur 6. Omkristallisation av Slp1 på modifierade SiO 2 sensorer analyseras av QCM-D; (A) i Af / AD tomt och (B) yttjocklek profile; Denna siffra har ändrats från Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillstånd från Springer och Suhr, M. (2015) 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ytprofilen beräknas med de tidigare nämnda modellerna visar en Slp1 monolager tjocklek av ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt modell för elastiska filmer) och 10,0 nm (Sauerbrey modell för styvt skikt) (Figur 6B). Dessa värden är lägre än de rapporterats av Suhr, M. et al. (2014). Skillnaderna kan förklaras med en annan begagnade värdet av proteinskikt densitet inom modellering. Strömvärdena bör vara närmare verkligheten av skiktets tjocklek av S-skiktproteiner på cellytan hos levande celler av L. sphaericus JG-B53 31,42. Denna modell visar att Sauerbrey relation is olämpligt för akustisk tunt proteinhaltigt skikt, på grund av en spridning av skär akustiska vågen i viskoelastiska flytande filmer 81,82 som resulterar i en underskattning av adsorberat Slp1 massa och tjocklek. Detta kan förklaras av de elastiska egenskaperna hos S-skiktproteiner och dess koppling av vattenmolekyler under adsorptionsprocessen. Samspelet mellan vatten med proteiner kan enkelt beskrivas genom bildande av vätske skal, viskösa motstånd eller infångning i håligheter i adsorberat skikt 83. Detta åstadkommer en högre skikttjocklek mäts av Kelvin-Voigt-modellen och kan också klargöra skillnaderna i skikttjockleken som erhålls genom de två olika modeller. I tidigare AFM studier var skikttjocklekar av Slp1 gitter av omkring 8-12 nm. Genom att beräkna mass adsorption av Slp1, i stället för skikttjocklek, totalt AM av 1506,6 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt modell) beräknades. Uppgifterna i mass adsorption på surfess summeras i Tabell 2 och visar en hög mass adsorption genom att använda värdena av Kelvin-Voigt-modellen.

mmax Öm max tjocklek tjocklek
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
Slp1 efter beläggning och sköljning 1,505.6 1,351.6 11,2 10

Tabell 2: Adsorberad massa Slp1 på modifierade Polyelectrolyte SiO 2 Kristaller analyseras av QCM-D efter sköljning med Omkristallisation buffert (pH = 8,0) och Beräknad skikttjocklek.

QCM-D som verktyg för detektion av metall och metall NP Interaktion med proteinhaltigt Slp1 Mono

Interaktionen omkristalliserad Slp1 monolager med 1 mM och 5 mM upplöst Au (III) undersöktes. Resultaten av den totala adsorberade massan som erhållits från beräkningar och modellering av de registrerade uppgifterna om förändringar i frekvens och försvinnande sammanfattas i tabell 3. QCM-D studier av Au (III) interaktion med mono ge en djupare förståelse för metall biomolekylen interaktion. För första gången, bindningskapaciteten, sorptions- kinetik och hur metal påverkar proteinets stabilitet studerades i en nano-range. Efter tillsatsen av metallsaltlösningen till Slp1 monoskiktet frekvensen minskade inom de första 5 min indikerar en snabb massa adsorption. Ändå var adsorptionen av Au inte avslutats efter 60 minuter såsom beskrivits för andra metaller som Pd (II) i tidigare studier 19. Massan ökningen sker upp till 18 timmar. Efter denna tid var sköljningssteg utfördes med metallfri buffert visar att den adsorberade metallen nästan stabilt bunden till den omkristalliserade Slp1 skiktet. Slutligen har en total metall absorption av 955.0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt modell) som erhållits i fallet med den 1 mM Au (III) lösning och 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt modell) Vid 5 mM Au (III). De högre värden som erhålls genom 5 mM Au (III) lösningar kan förklaras av inneboende reduktionsegenskaperna hos Slp1 där minsta metalliskt Au (0) -NP bildades från denna lösning. Dessa reducerande korrektband Slp1 har redan rapporterats i tidigare studier för Pd (II) och Au (III) 32,33,79,84. Data visade också att interaktionen med guldlösningen inte leder till en destabilisering av proteinskikten. Detta indikerar den specifika och stabil bindning av Au (III) till Slp1, vilket också har bekräftats av ICP-MS mätningar med proteinpolymerer.

Bildningen av Au (0) -NP under syntesen kunde visualiseras genom färgförändring från utgångs gula lösningen till en rödaktig en. Denna färgförändring orsakas av excitation av ytplasmon svängningar av metalliska nanopartiklar och bevisar bildningen av Au (0) -NPs 1,78. Dessutom mindre NP kan syntetiseras genom variation av koncentrationen av reduktionsmedlet (högre garvsyra koncentration) 85 synlig i en annan färgning av lösningen och verifieras av resultaten från PCS-mätningar (data ej visade). PåDäremot ökar garvsyra koncentrationen leder till en förlust av NP stabilitet och nationella parlamenten tenderar att agglomerera 20. Som bevis på principen, i förväg syntetiserad Au (0) -NPs (storleksfördelningen av 10 - arton nm vid mätning genom PCS ses i Figur 7A) inkuberades med absorberad Slp1 för 48 h och analyserades genom SDS-PAGE. Proteinprofilen visas i figur 7B verifierar slutsats från QCM-D uppgifter att Au (0) -NPs inte stör Slp1 strukturen. De observerade proteinband vid 150 kDa bevisa förekomsten av intakt Slp1.

Figur 7
Figur 7. (A) talviktade storleksfördelning av i förväg syntetiserad Au (0) -NPs mätning genom PCS och (B) SDS-PAGE-proteinprofilen Slp1; bana 1: 2 ng Slp1 innan Au (0) -NPs interaktion och spår 2: 1 mikrogram Slp1 polymerer i suspension efter 48 timmar incuba tion med pre-syntetiserade Au (0) -NPs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter NP-syntes och karakterisering, var QCM-D experiment genomförts. Adsorption av pre-syntetiserade metalliska Au (0) -NPs är som exempel visas för QCM-D experiment i Af / AD tomter (Figur 8 A) och som tjocklek och massa profiler (figur 8B).

Figur 8
Figur 8. Adsorption av Pre-syntetiserade Au (0) -NPs på omkristalliserad Slp1 Lattice Analyzed by QCM-D, (A) i Af / AD tomt och (B) ytskikt och massprofil.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Det kunde bekräftas att QCM-D kan användas för att detektera adsorptionen av 10 - 18 Nm sfärisk Au (0) -NPs. Efter tillsats av det outspädda Au-NP-lösning (A 520 nm = 1) som erhållits genom den beskrivna syntesen, frekvensen minskar, vilket är en direkt indikator på mass adsorption beskrivs av förutsägelse av Sauerbrey-ekvationen (Ekvation 1). Adsorptionen av Au (0) -NPs var nästan avslutad inom mindre än 60 minuter. Efter denna tid inga fler NP avsattes på toppen av Slp1 gitter, så det kan antas att alla reaktiva ställen eller porer ockuperades av Au (0) -NPs. Minskningen visas i försvinnande kan vara anslutna till det hårdnande Slp1 gitter orsak av NP interaktion. Värdena för total massa adsorption summeras i tabell 3. Även intensiv sköljning med NP-fria citratbuffert leder neifins en desorption av nationella parlamenten eller till en avdelning av Slp1 monolager. Därför kan en stabil och stark samverkan förutsägas för Au (0) -NP interaktion i samma respekt som med Au (III).

Metall c metall Öm max Öm max tjocklek tjocklek
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10,2 10,2
NP

Tabell 3: adsorberade massan på omkristalliserad Slp1 Lattice efter Au (III) Interaktion (pH = 6,0) och Au-NP Adsorption (pH = 4,7) Analyseras av QCM-D och beräkning av skiktets tjocklek efter Au (0) -NP Coating. Data jämfördes med tidigare publicerade resultat från Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM för visualisering av nanometer Scaled Structures

figur 9, proteingitter Slp1 kristalliserades på PE modifierade sensorer visas med dess typiska kvadrat galler (p4) som amplitud bilder. Gitterkonstanten kan bestämmas som 13-14 nm, vilket är jämförbart med resultaten från tidigare experiment 30. Skikttjockleken av 10 nm ± 2,0 nm vid mätning genom AFM verifierade den förutsagda skikttjockleken av QCM-D mätningar av ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt modellering). Den lilla skillnaden i ytan höjden kan förklaras av det faktum att calculated QCM-D fit anser hela sensorområdet medan den höga upplösningen AFM studie visar bara en del av området. Med tanke på detta, var protein agglomerat som fästes till sensorytan ingår i beräkningen av den adsorberade massan respektive skikttjockleken och ledde till en högre skikttjocklek än bestäms av AFM.

Figur 9
Figur 9. AFM Amplitude Foto av omkristalliserad Slp1 Lattice L. sphaericus JG-B53 på QCM-D kristaller Direkt efter beläggning och sköljning med buffert och förstoring av Marked Region; Denna siffra har ändrats från Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillstånd från Springer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10 visar den intakta Slp1 gitter efter inkubation med Au (III) -lösning. Det kan visas att efter inkubationen proteingitter förblev helt intakt. Detta bekräftar resultaten från QCM-D experiment som predikterade stabiliteten hos beläggningen. I figur 11A och B adsorberat pre-syntetiserade Au (0) -NPs (storlek varierar från 10 till 18 nm bestäms av PCS) på Slp1 gitter visas. På grund av partikelstorlek, Au (0) -NPs adsorberas i Slp1 porerna och följer inte p4 -symmetry av Slp1. Au (0) -NPs är statistiskt fördelade på protein gitter. Genom att mäta partikelstorlekar i AFM höjdbilder (data ej visade) storleken på NPS inom intervallet 16 - 23 nm och ännu mindre, nämligen i intervallet av ungefär 10 nm 19,20. Detta verifies den fastställda NP storlek mätt tidigare av PCS (visas i figur 8).

Figur 10
Figur 10. AFM Amplitude Bild omkristalliserad och Intact Slp1 Lattice på QCM-D Sensor kristaller efter inkubation av 5 mM Au (III) lösning och Förstoring av Marked Region; Denna siffra har ändrats från Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillstånd från Springer och Suhr, M. (2015) 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11
Figur 11. (A) AFM amplitud bild av adsorberat Au (0) -NPs på omkristalliserad Slp1 gitter på QCM-D sensor kristaller (vänster) Och (B) 3D rekonstruerade ytprofilen (höger); Denna siffra har ändrats från Suhr, M. (2015) 20 med tillstånd från Springer och Raff, J. et al. (2016) Raff, J. et al. S-lager baserade nanokompositer för industriapplikationer i Protein baserade Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (lämnas)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete studerades bindningen av Au till S-skiktproteiner undersöktes med användning av en kombination av olika analysmetoder. I synnerhet bindningen av Au är mycket attraktiv inte bara för återvinning av Au från gruvvatten eller processlösningar, men också för byggandet av material, t.ex. sensoriska ytor. För studier av Au interaktion (Au (III) och Au (0) -NPs) med absorberad och omkristalliserades monolager av Slp1 hade proteinet som skall isoleras. Därför har denna studie visat den framgångsrika odlingen av den grampositiva bakteriestam L. sphaericus JG-B53 och isoleringen av ytskiktet proteinet Slp1. Ändå odling och proteinisolering förblir utmanande och bör optimeras. En storskalig produktion av biomassa och S-skiktproteiner är en förutsättning för en industriell tillämpning av båda, t.ex. för produktion av metallselektiva filtermaterial. Deras ansökan potential är undoubtedly hög för avlägsnande av giftiga metaller eller utvinning av värdefulla metaller upplösta i processvattnet, avloppsvatten eller dräneringsvatten. Dessutom är tillämpningen potentialen för S-skikt ännu större med tanke på deras ytterligare potential i andra bioinspirerade material, såsom biosensorer och katalysatorer.

De batch-sorptionsegenskaper experiment suspenderade Slp1 polymerer indikerade en hög och stabil bindning av Au (III) i det undersökta pH-intervallet 2,0-5,0. Därigenom kunde avverkning effektivitet på upp till 60% uppnås. Denna anmärkningsvärda bindnings beteende kan förklaras av en stark samverkan av Au (III) med Slp1 förmodligen inducerad genom interaktion av karboxylgrupper och kvävebärande grupper närvarande på ytan av proteinet. Detta argument skulle kunna stärkas med FTIR och EXAFS undersökning av liknande stam L. sphaericus JG-A12 32,79. Dessutom kan inneboende reducerande egenskaper Slp1 förklara den höga RE från Au (III) genom reducing det att nanopartikulära Au (0). Man kan anta att S-skikt, som första gränssnittet för bakterier till miljön bör vara huvudsakligen arbetar med metallbindning. Inom det undersökta pH-området, den högsta metallbindande kapacitet med 102,5 mg Au (III) / g Slp1 uppnåddes vid pH 4,0. Detta bindningskapacitet är högre än vad som rapporterats för andra biokomponenter, till exempel, för isolerade cellväggen hos Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 eller biomassa Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS användes för bestämning av den bundna metall genom Slp1 polymerer är mycket känslig metod och möjliggör detektering av mycket små mängder av guld i denna studie. ICP-MS erbjuder många fördelar för att utföra spårmetallbestäm, t.ex. enkel hantering systemet och låga detektionsgränser; i händelse av guld ned till 0,1-1 ppt. Detta gör denna metod ett mångsidigt verktyg för att undersöka biosorptive processer i lågt koncentrationsintervalls. Emellertid var resultaten i denna undersökning som gjorts med suspenderade S-lager polymerer och kan inte enkelt överföras till S-skikt gitter rekristalliserade på ytor, och därför visar begränsningen av ICP-MS. Till exempel kan ingen direkt relation av isolerade proteinpolymerer göras till de S-skiktsstrukturer på vitala bakterieceller. Dessutom behöver de ICP-MS mätningar inte möjligt att bestämma den kinetiska metall sorption. Därför är det nödvändigt att finna metoder mer lämpade för undersökning av metallbindande av tunna immobiliserade proteinfilmer.

I föreliggande studie var QCM-D analyser används för att påvisa bildningen in situ av S-skiktgitter på ytor samt avsättning av Au på proteinerna. Därför är QCM-D en robust och reproducerbar metod för erkännande av molekyl adsorption och interaktionsprocesser. Dessutom QCM-D är en relativt enkel, kostnadseffektiv, och ofarliga metod att övervaka sUCH processer på nätet. Metoden har fördelen att upptäcka massförändring med en totalvikt känslighet i vätskor med ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Detta gör det möjligt för möjligheten att upptäcka även svag växelverkan, t.ex. protein med lösta metaller eller för att mäta adsorptioner i låga koncentrations. Nackdelen med QCM-D är att detta inte är en struktur avbildningsmetod som tillåter visualisering av t.ex. proteingitter. Därför behövs andra tekniker.

QCM-D-analyser i denna studie följdes av AFM avbildning. Kombinationen av dessa metoder är tillåtna studiet av sorption kinetik och konsekvenserna av Au sorption för beläggningen, vilket bevisar att de är mångsidiga verktyg för att undersöka metall samverkan mellan tunna protein filmer. Vidare visades det att en tillförlitlig omkristallisation av S-skiktproteiner om tekniska bärare är väsentlig för efterföljande proteininteraktionsstudier. Detförgrunden, modifieringar av ytor med vidhäftnings promotorer är av intresse. Den beskrivna implementeringen av polyelektrolyter (slutar med positivt laddade PE) såsom mellanliggande skikt mellan SiO 2 ytor och proteinskiktet leder till ett förbättrat förfarande för en snabb proteinbeläggning. Den positiva effekten av en positivt ladda polyelektrolytlager har beskrivits tidigare för exempel, immobilisering av vitala bakterieceller av L. sphaericus JG-B53 31. Genomförandet av de presenterade PE-skikt är den viktigaste och mest kritiska steget för senare framgångsrik och reproducerbar omkristallisation av S-skiktproteiner.

Det kunde visas att för undersökning av tunna skikt av Slp1 är QCM-D en bra metod för att visa mass adsorption respektive till proteinkristallisering som enskiktsfilmer i realtid. Detta kan också observerats tidigare för monteringen av S-lagret protein SBPA L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Genom att använda efterföljande högupplösande AFM analyserar förändringar i gitterstrukturen av proteinsjälvaggregat kan visualiseras. AFM mätningar avslöjade p4 symmetri Slp1 och bekräfta modellerade skikttjocklek Slp1 av ca 10 nm. Dessutom kan den direkta interaktionen av upplösta metalljoner med proteinet skiktet övervakas genom QCM-D bevisar god bindning av Au (III) genom det underliggande proteinet skiktet. Den troliga bildandet av den minsta Au (0) -NPs från Au (III) lösningen inuti protein porer orsakas av inneboende reducerande egenskaperna hos Slp1 gitter inom QCM-D mätningar kunde inte upptäckts av efterföljande mätningar AFM. Detta kan ställas i relation till resolution gränsen för AFM och experimentella inrättats i denna studie. Detta visar begränsningen av denna teknik och nödvändigheten av högupplösande avbildning för biomolekyler i undernanometerskala. Emellertid kan en hög stabilitet hos det omkristalliserade Slp1 skiktet härledas från the erhållits QCM-resultat och bekräftades av AFM undersökning.

Sammanfattningsvis kan man visa att Slp1 polymerer har höga metallbindningskapaciteter för guld inom det undersökta pH-intervall. Dessutom visar undersökningen att Slp1 gallret är en bra matris metalljon bindande och för immobilisering av metalliska nanopartiklar. Det kunde visas att varje metod som används i denna artikel har möjlighet att upptäcka även små metall interaktioner, eller i händelse av AFM kan visualisera strukturer i nanoskala intervallet. Även om det är endast genom en kombination av dessa metoder visade som har gjort det möjligt att förbättra kunskapen om och förståelsen av de undersökta proteinerna på en molekylär nivå.

Huvudsakligen, QCM-D och AFM är de föredragna metoderna för val för framtida undersökning av protein monolager adsorption och deras interaktion med metaller och funktionella molekyler. Genom att kombinera dessa två metoder, detektion av S-lagret protein annonssorptionsprocesser och ytan avbildning ger en inblick i molekylära processer som kanske kan överföras för att öka kunskapen om levande bakterier och samspelet med sin omgivning. Denna studie visade ett utdrag av möjliga metoder hjälp för att förstå protein och interaktion metall. Andra hjälp tekniker som kan öka kunskapen om dessa processer i detalj sträcker sig från olika spektrometriska och kromatografiska metoder för att spektroskopiska utredning av biomolekyler och bör ingå i framtida studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Föreliggande arbete har delvis finansierats av finansieras av BMWi och BMBF-projektet "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A) IGF-projektet "S-Sieve" (490 ZBG / 1). Särskilt tack till Tobias J. Günther för hans värdefulla hjälp under AFM studier och till Erik V. Johnstone för att läsa manuskriptet som en engelska som modersmål. Vidare skulle författaren till denna uppsats tacka Aline Ritter och Sabrina Gurlit (från Institutet för Resurs ekologi för att få hjälp i ICP-MS mätningar), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava och gruppen bioteknik av Helmholtz-institutet Freiberg för Resurs Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

Kemi biosorption metaller S-skikt bakterier nanopartiklar QCM-D AFM ICP-MS guld
Au-Interaktion av Slp1 polymerer och monolager från<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS och AFM som verktyg för Biomolecule metall Studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter