Summary
هنا نقدم بروتوكول لتوصيف البويضات غاري الماوس على أساس تنظيم نويي.
Introduction
وتستخدم غاري البويضات نمت بشكل كامل (GV، الحويصلة الجرثومية) معزولة عن مقصورة الغارية من المبيض بشكل روتيني لأغراض مختلفة مثل، على سبيل المثال، ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية وراء في المختبر النضج حتى مرحلة الطورية II.
وعلى الرغم من ظهور البويضات الأكثر الغارية جميلة، ولكن ليس كل شيء، هي قادرة على استكمال الانقسام الاختزالي والوصول إلى مرحلة الكيسة الأريمية. في الواقع، في كثير من أنواع الثدييات، بما في ذلك البشر 1،2، ما يقرب من 30٪ منهم تعتقل تنميتها في المرحلة 2-الخلية، في حالة حدوث الإخصاب 3-5. حتى الآن، تستخدم بعض المعلمات للتمييز بين البويضات قادرة على الحفاظ على التطور الجنيني من أولئك الذين لا يستطيعون القيام بذلك.
على سبيل المثال، الكريزيل تلطيخ الأزرق (BCB) هو وسيلة صالحة لفرز البويضات على أساس النشاط الجلوكوز 6 فوسفات نازعة-على الرغم من أن فائدة هذه الطريقة فرز المتعلقة BCB + أو تلطيخ BCB- هيلا يزال المختبرات تعتمد 6-8.
يوجد طريقة أخرى راسخة في المؤسسة لونين بها: إذا ملطخة أي الأصباغ الإقحام الحمض النووي (مثل Hoechst33342)، و 70٪ من البويضات الغارية تظهر حلقة صبغ إيجابي حول نوية وتسمى تحيط نوية (SN) في حين أن 30٪ المتبقية تظهر إشارات إيجابية أكثر رصدت وتسمى ليس تحيط نوية (NSN) 3-5. أظهرنا مؤخرا أن غياب السياج حشوية 9 (CPLs، مواقع تخزين هامة لمرنا وريبوسوم المستمدة أمهات في كل من البويضات في الثدييات والأجنة) (10) وأسفل تنظيم MATER (ضروري لتشكيل CPLs 11)، جنبا إلى جنب مع وجود قطرات الدهون في cytoplasms من 9،12، يمكن أن يكون لأسباب أخرى تتعلق البويضات عدم NSN المضي قدما إلى ما بعد مرحلة 2-الخلية.
للأسف، عدد من التقنيات يمكن تطبيقها على فرز SN الغار والبويضات NSN و،لهذا السبب، يمكن تطوير أسلوب أقل الغازية (دون تلطيخ النووي، إجراءات تثبيت أو التلاعب مع ماصات الفم) أصبحت مهمة جدا لزيادة معدلات كلا تطور الجنين الإنسان والحيوان.
في هذه الورقة، ونحن بالتفصيل بروتوكول بسيطة وسريعة تستخدم لعزل الإعلان نوع SN وNSN البويضات الغارية من إناث الفئران وموجهة الى جميع العلماء المهتمين في دراسة عملية تكوين الأمشاج الإناث، نضوج البويضة وتطور الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويجري هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية لالأوروبي (EU 63/2010) والإيطالية (26/2014) قوانين حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي. يستخدم عنق الرحم التفكك القتل الرحيم لالمبايض العزلة، ويتم تنفيذها من قبل الخبراء والأفراد المدرجة في بروتوكول المعتمد تغطي هذه الدراسة تدريب.
1. الحيوانات
- الحفاظ على الكبار 3- لإناث الفئران عمره 6 أسابيع في غرفة مع درجة الحرارة للرقابة والرطوبة (مع مراحل 12L: 12D وبالمال وبالشهرة أيضا إعلان البنك المركزي الامريكي).
- حقن الفئران داخل الصفاق مع 2.5 وحدة دولية من الحوامل موجهة الغدد التناسلية مصل الفرس (PMSG) لتحفيز النمو الجريبي عن طريق محاكاة آثار هرمون تحفيز الجريبات (FSH). عزل المبيضين البويضات لالغارية 48hrs جمع في وقت لاحق. الموت ببطء الماوس الإناث حقن سابقا مع PMSG، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة بك.
- بسرعة إزالة المبيضين من تجويف الجسم ووضعها في طبق بتري تابعaining M2 المتوسطة لاحقة عزل البويضات (انظر القسم 3).
- إجراء شق في الجلد الذي يغطي جدار البطن تليها شق في الغشاء البريتوني باستخدام مقص تشريح العقيمة. فتح شق لكشف البطن، نقل الشجاعة على جانب واحد باستخدام الملقط معقمة وتوطين أنابيب الرحم، وتشكيل شكل V بدءا من المثانة.
- مراقبة المبايض تقع تحت الكلى. عقد كل أنبوب مع منتاش معقم وإجراء شق صغير في الجزء السفلي من المبيض للافراج عنهم. نقل كلا المبيضين في الجزء السفلي من طبق بتري تحتوي على المتوسط قبل معايرتها.
2. إعداد هرمون
- تمييع PMSG (متوفر في تركيزات مختلفة الأسهم) مع محلول معقم المالحة متساوي التوتر للحصول على تركيز العمل من 2.5 وحدة دولية الهرمون في 0.1 مل لحجم الحقن المناسب.
يجب aliquoted حلول هرمون في 0.5 مل الأنابيب وتخزينها في -2: ملاحظة0 درجة مئوية حتى اليوم من الاستخدام. لا تبقي قسامات المخفف أطول من ثلاثة أشهر في -20 ° C. إذابة مرة واحدة، إذا تم إجراء حقن المسلسل، وتخزين aliquots من الحلول الهرمون في +4 درجة مئوية واستخدامها في غضون 4 أيام.
3. الغارية البويضات عزل
لعزل البويضات السليمة:
- تتوازن M2 المتوسطة 13 (M2) في CO 2 و 37 ° C 5٪ لا يقل عن 1 ساعة قبل البدء في إجراء البويضات العزلة. إعداد طبقين بتري (35 مم × 10 مم)، واحدة مع 1 مل من M2 لتعطيب المبيض والثانية مع قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية (~ 1.5 مل) لنقل البويضات بعد بمعزل عن المبيض (انظر 3،4-3،6). تبقي على حد سواء أطباق بتري في حاضنة في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
- استخدام stereomicroscope خلال إجراءات عزل البويضات.
- إعداد رقيقة الماصات الزجاجية الفم لجمع البويضات تمتد لفيلمأبقى هينج الزجاج الماصات باستور أفقيا (عقد ينتهي من ماصة بكلتا يديه)، فوق لهب العمودي القادمة من موقد بنسن (الشكل 1).
- بمجرد أن يبدأ الزجاج في الذوبان، واتخاذ الماصة للخروج من اللهب وإجراء حركة سحب سريعة للحصول على ماصة المطلوب. قطع بحزم الزجاج الزائد على مقربة من نقطة ضيقة من ماصة مع الأظافر لضبط طول وقطر الشعرية الداخلي. ضمان الشعرية رقيقة لديه القطر الداخلي لل~ 100 ميكرون، أكبر قليلا من قطر البويضة ل(~ 80 ميكرون).
- إلى الفم ماصة، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب الشافطة لماصة سحبت باستخدام طرف المناسب ووضع الطرف الآخر في الفم، وتأمين ذلك مع الأسنان.
- جمع المبايض باستخدام الملقط معقمة وإيداعها في الجزء السفلي من طبق خلية ثقافة بتري (35 ملم × 10 ملم). غطاء لهم مع 1 مل من M2 سبق معايرتها عند 37 ° Cو 5٪ CO 2 (الشكل 2).
- ثقب بلطف الجريبات الغارية المبيضين مع العقيمة إبرة حقنة الانسولين لاطلاق سراح البويضات الغارية في M2 (الشكل 3).
- بلطف الفم الماصة البويضات من خلال ماصة باستور الضيقة لإزالة خلايا بصيلات وأي حطام الأنسجة المحتمل الآخر (الشكل 4A) ومن ثم تسويتها في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية مناسبة للثقافة الجنين (سابقا إعداد؛ الشكل 4B).
ملاحظة: من المهم لإزالة جميع الخلايا الركامية التي تعلق على المنطقة الشفافة من البويضات قبل pipetting المستمر من خلال عدة ومختلفة قطرات من M2. تنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لتجنب التغيرات في الرقم الهيدروجيني للمتوسط.
4. الغارية البويضات تلطيخ مع Hoechst33342
ملاحظة: البويضات الغارية ويمكن التمييز في SN (تحيط نوية)، NSN (لا تحيط نوية) أوفي أي شكل وسيط آخر، استنادا إلى منظمة ونين بهم بعد تلطيخ مع تركيز فوق حيوي من Hoechst33342 (أو أي علامات أخرى محددة لقواعد AT) 14. في الواقع، تظهر البويضات SN حلقة هويشت إيجابية حول نوية في حين أن NSN لا، ومن هنا اسمها.
لتلطيخ البويضات السليم:
- نقل البويضات باستخدام ماصة الفم إلى قطرات من Hoechst33342 (20 ميكرولتر) المخفف في M2 في تركيز فوق حيوي من 50 نانوغرام / ميكرولتر لمدة 10 دقيقة في الظلام.
- بعد الحضانة مع Hoechst33342، ونقل كل بويضة واحدة مع ماصة الفم في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (5 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية، والفرز على أساس تنظيم لونين (SN أو NSN). استخدام أي المجهر مضان مجهزة مرشح Hoechst33342 (الطول الموجي انبعاث 486 نانومتر) لتصور التكوين لونين من البويضات.
ملاحظة: اعتمادا على نوع المجهر مضان المستخدمة، طر قد يصبح من الضروري استخدام الزجاج طبق بتري أسفل لالتقاط صور. المجهري متحد البؤر أوليمبوس Fluoview Fv10i عندما مجهزة حامل العينة لمدة 35 ملم طبق يتطلب الزجاج الوحيدة أسفل أطباق لالتقاط صور مع 0.17 مم القياسية ومجموعة 0،13-0،21 مم مقبولة. - تثير البويضات لمدة لا تزيد 5-10 ثانية، من المحتمل ما يكفي من الوقت لتصور وجود أو عدم وجود حلقة حول نوية (الشكل 5).
- بعد الفرز، وثقافة SN غاري والبويضات NSN في M2 في 5٪ CO 2 و 37 ° C للحث في المختبر النضج أو الاحتفاظ بها في مخازن مناسبة للالتحليلات الجزيئية أو الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر الصور التالية الطريقة المستخدمة لعزل البويضات الغارية من المبيض الماوس، بدءا من إعداد الماصات لفرز البويضات عن طريق وسائل Hoechst33342. هذا الأسلوب هو بسيط جدا ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مجهز حاضنة CO 2، stereomicroscope والمجهر مضان مجهزة مرشح الصحيح للمراقبة من Hoechst33342 الشكل 1 يوضح الخطوة الأولى لإعداد ماصة: كما الزجاج تبدأ في الذوبان وتصبح لينة، لا بد من سحب طرفي ماصة، وبصرف النظر، في الوقت نفسه، يجب أن تؤخذ ماصة للخروج من اللهب. بدلا من ذلك، يمكن سحب الزجاج الشعرية في نفس الطريق أو باستخدام مجتذب micropipette، إذا معايرتها. هذا هو خطوة حاسمة لأنه من المهم جدا أن يكون الحق ماصة الفم مع قطر الشعرية الصحيح: إذا كانت رقيقة جدا، قد تكون مجزأة البويضات داخل قبعة صغيرةillary ويموت في دقائق قليلة، إذا كانت كبيرة جدا، شفط السليم للالمتوسط تحتوي على البويضات يمكن أن تضيع عندما تتحرك البويضات، على سبيل المثال، من قطرة واحدة إلى أخرى. أرقام 2 و 3 تظهر العزلة الميكانيكية البويضات الغارية من الجريبات الغارية باستخدام إبرة الأنسولين العقيمة. فمن السهل جدا التعرف على هذه المسام لأن فهي تتميز تجويف أو غار تحتوي على السائل، وهذا هو الوسط الذي توجد الخلايا المحببة والبويضة والتي من خلالها جزيئات مختلفة يمكن تبادل من وإلى البيئة الخارجية. يجب أن يتم نقل مرة واحدة معزولة، البويضات الغارية من قطرة واحدة إلى أخرى من M2 المتوسطة لإزالة الخلايا الجسدية المحيطة البويضات، كما هو مبين في أرقام 4A و B. مرة واحدة "المعري"، البويضات الغارية جاهزة للتصنيف الشكل 5 يظهر الخطوة الأخيرة من هذا البروتوكول، وهذا هو تلطيخ من البويضات الغارية معزولة مع Hoechst33342 وأو فرز سريع يعتمد على التنظيم لونين بهم. هذه البقع علامة الخلايا الحية بشكل أسرع بكثير من دابي، على سبيل المثال، ويجب أن تستخدم في تركيز فوق حيوي (50 نانوغرام / ميكرولتر) للحفاظ على بقاء الخلية. تلطيخ خلية لتنظيم لونين وربما الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول: إذا البويضات متحمسون فترة طويلة جدا أنها يمكن أن تتلف وتصبح غير صالحة للاستعمال لمقالات في المستقبل. عموما، إذا ما طبق على البويضات الماوس، وهذا هو طريقة بسيطة لا تتطلب احتياطات معينة (ما عدا تلك المشار إليها في القسم الأسلوب). جميع الخطوات التي يمكن القيام بها في RT.
الشكل 1. إعداد ماصة الفم باستخدام الماصات الزجاج باستور وموقد بنسن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ثيالصورة الرقم.
الشكل 2. المبايض سليمة في طبق بتري مليئة قبل تحسنت ومعايرتها المتوسطة M2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. العزلة الأولية من البويضات الغارية من الجريبات الغارية عن طريق إبرة معقمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. نقل البويضات المعزولة حديثامع ماصة الفم من طبق بتري (A) إلى طبق بتري مختلفة تحتوي على قطرات صغيرة من قبل حرارة ومعايرتها M2medium (B) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. البويضات الملون وفرزها مع Hoechst33342. صور واحدة من NSN وSN البويضات التي اتخذت في المجهر متحد البؤر أوليمبوس Fluoview Fv10i (التكبير 60X، شريط: 10 ميكرومتر؛ الرعاية الصحية الأولية: الطوري). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول الطريقة المستخدمة لعزل وتصنيف الماوس غاري البويضات GV. لا توجد خطوات حاسمة خاصة أن نؤكد، مع استثناءات قليلة. أولا: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن بما يلي: أ) الحفاظ على حيوية البويضات وب) تجنب التغييرات درجة الحموضة في الوسيلة المستخدمة. ثانيا: يجب أن تكون البويضات متحمس لفترة وجيزة (5-10 ثانية) لHoechst33342 لتجنب الضرر لونين والموت لاحق من البويضات، وخاصة إذا IVM وIVF هي الخطوات التالية. حتى الآن، وهذا هو أسرع طريقة لفرز SN وNSN الماوس البويضات الغارية.
وقد ثبت Hochest33342 أن يكون وسيلة فعالة لتوصيف SN وNSN البويضات في إناث الفئران (وغيرها من النماذج المختبرية الثدييات) ولكن لا يمكن أن يكون، للأسف، وتستخدم لفرز البويضات الغارية في البشر لأغراض الخصوبة.
ومع ذلك، لأنه في المختبر نضوج البويضات غير الناضجة يستخدم بشكل روتيني في البشر أيضا، والتعليم الجامعييونيتبول تكون مهمة للغاية لايجاد وسيلة غير الغازية لتمييز البويضات "جيدة" (أي SN) من "السيئة" (أي، NSN) لزيادة نجاح التخصيب في المختبر واللاحقة تطور الأجنة المحتملين. الى جانب ذلك، يمكن استخدام العزلة وثقافة البويضات SN من أنسجة المبيض للحفاظ الخصوبة لدى النساء يخضع لعلاج السرطان أو الذين يعانون من أمراض المبيض.
من خلال استغلال هذه الظاهرة الطبيعية، ويمكن توفير البيانات الهامة لفهم طبيعيا خسائر سابق للانغراس الجنين الذي لا يتحدث المهتمين في علم الأحياء الأساسي للتنمية بويضة ولكن أيضا للأطباء IVF الإنسان والحيوان.
الآثار المترتبة على هذه التقنية لصحة الإنسان، biopolitics الأجنة والتكاثر الحيواني هامة 15. أن تكون قادرة على تحديد وإزالة البويضات "تتعارض الحياة" أنرفع كثيرا من مستوى فعال من أساليب التلقيح الاصطناعي، مما يؤدي إلى الحلول المتطورة لتلبية الاحتياجات الهامة السريرية التي لم تتم تلبيتها.
في الواقع، يمكن للمجتمع العلمي الدولي لعلماء الأحياء الأمشاج تسهم في السعي للحصول على التحسينات الأساسية اللازمة لتطبيق هذا البروتوكول إلى الإجراءات IVF الإنسان. على الرغم من أن البروتوكول لا يمكن تطبيقها على البشر (لأسباب تتعلق بالسلامة واضحة)، فإنه لا يزال يحتفظ قدرة هائلة لتحسين معرفة العلاقة بين المنظمة لونين (أي بنية الجينوم) والتعبير الجيني في المراحل النهائية من النضج الغار ، واحدة من القضايا الساخنة في التناسل البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
