Summary
여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.
Introduction
난소 전 정부 구획실로부터 분리 전 정부 완전히 자란 난자 (GV, 새싹 소포)는 일상적 같은 다른 목적을 위해 사용되는 예를 들면, 중기 II 단계까지 시험 관내 성숙 뒤에 분자 세포 메카니즘의 연구.
그들의 아름다운 외관에도 불구하고 대부분의 전 정부 난자, 전부는 아니지만, 감수 분열을 완료하고 포배기에 도달 할 수있다; 시비 3-5 발생할 경우 실제로 인간 1,2- 포함한 많은 포유류 종에서, 이들 중 약 30 %, 2 단계에서 셀들이 개발 체포. 현재까지, 몇몇 파라미터는 그렇게 할 수없는 것과 배아 발달을 유지할 수 난자를 구별하기 위해 사용된다.
예를 들어, 크레 실 블루 염색 (BCB)은 BCB + 또는 BCB- 염색 관련이 정렬 방법의 유용성이 있지만 글루코오스 -6- 포스페이트 탈수소 효소의 활성에 기초하여 난자를 정렬하는 방법으로서 유효한여전히 6-8 의존 실험실.
또 다른 잘 확립 된 방법은 염색질 조직에있는 (Hoechst33342 같은) 어떤 DNA의 인터 염료로 염색하는 경우, 전 정부 난자의 70 %가 핵소체 주위에 염료 긍정적 인 반지를 보여 핵소체 (SN)를 둘러싸인라고 30 %를 유지하면서 더 발견 긍정적 인 신호를 보여주고 (NSN) 3-5하지 둘러싸인 핵소체라고합니다. 최근에 우리는 보여 주었다 세포질 그릴 (9) (CPLS, 포유류의 난자와 배아 모두 모계 유래의 mRNA와 리보솜에 중요한 저장 사이트)의 부재 (10)의 존재와 함께 (CPLS 형성 (11)에 대한 필수) 이잖아요의 하향 조절, 그들의 세포질 9,12- 지질 방울, 2 세포 단계 이상으로 진행 NSN 난자의 무능력과 관련된 다른 원인이 될 수 있습니다.
불행하게도, 몇몇 기술은 전 정부 SN과 NSN의 난자와 정렬을 적용 할 수 있습니다,이러한 이유로, (핵 염색, 정착 절차 또는 입 피펫으로 조작없이) 덜 침습적 방법의 개발이 모두 인간과 동물의 배아 발달의 속도를 높이기 위해 매우 중요해질 수있다.
본 논문에서는 세부 간단하고 빠른 프로토콜은 광고 정렬 SN과 여성의 생쥐에서 NSN 전 정부 난자를 격리하는 데 사용됩니다 그것은 여성 배우자, 난자의 성숙과 배아 개발의 연구에 관심이있는 모든 과학자들에게 해결됩니다.
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Protocol
이 프로토콜은 유럽의 원칙 (EU 2천10분의 63)과 과학 연구에 사용되는 동물을 보호하는 이탈리아어 (2천14분의 26) 법에 따라 수행된다. 경추 탈구 안락사는 난소 분리를 위해 사용되며, 이는 본 연구를 덮는 승인 프로토콜에 나열된 개인 전문가에 의해 수행되고 훈련된다.
1. 동물
- 제어 온도와 습도 방에 6 주령의 암컷 마우스에 성인 3을 유지한다 (12L의 단계와 : 12D와 공급 임의로).
- 난포 자극 호르몬 (FSH)의 효과를 모방하여 모낭의 성장을 자극하는 임신 한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬의 2.5 IU (PMSG) 마우스에 복강 주사. 이후 전 정부 난자 수집 48 시간의 난소를 분리합니다. 하여 기관 가이드 라인에 따라, 이전에 PMSG 주입 암컷 마우스를 안락사.
- 신속 체강에서 난소를 제거하고 배양 접시의 계속에 그들을 배치후속 난자 격리를위한 M2 매체 aining (섹션 3 참조).
- 해부 멸균 가위를 사용하여 복막에 절개 하였다 복벽을 덮는 피부에 절개를. 방광에서 시작하여 V 자 모양을 형성, 복부를 노출 절개를 열고 멸균 핀셋을 사용하여 한쪽에 용기를 이동하고 자궁 튜브를 지역화.
- 신장 아래에있는 난소를 관찰한다. 멸균 트위터와 각 튜브를 잡고 그들을 해제 난소의 하단에 작은 절개를합니다. 미리 평형화 매체를 함유하는 페트리 접시의 하단 양쪽 난소를 전송.
2. 호르몬 준비
- 적절한 주입 부피 0.1 mL의 2.5 IU 호르몬의 작용 농도를 얻기 위해 멸균 등장 성 식염수로 (다른 스톡 농도에서 사용 가능) PMSG 희석.
참고 : 호르몬 솔루션은 0.5 ml의 튜브에 분주하고 저장해야합니다 -2사용 일까지 0 ° C. -20 ° C 3 개월 이상 희석 분취 량을 보관하지 마십시오. 해동 후에 직렬 주사를 수행하는 경우, +4 ℃에서 호르몬 용액의 분취 량을 저장 4 일 이내에이를 사용.
3. 전 정부 난 모세포 분리
적절한 난 모세포 분리의 경우 :
- 난자 분리 절차를 시작하기 전에 최소한 1 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 13 M2 매체 (M2)를 평형. 두 개의 배양 접시 (35mm X 10mm), 난소 천공과에서 분리 한 후 난자 전송을 위해 미네랄 오일 (~ 1.5 ml)로 덮여 M2의 작은 방울과 두 번째 (20 μL)에 대한 (M2) 1 ml의 하나를 준비합니다 난소 (3.4-3.6 참조). 준비가 사용되는 때까지 5 % CO 2, 37 ° C에서 인큐베이터에서 모두 배양 접시를 유지합니다.
- 난 모세포의 분리 과정에서 실체 현미경을 사용합니다.
- 스트레치에 의한 난자를 수집하는 얇은 입 유리 피펫을 준비힝 유리 파스퇴르 피펫은 분젠 버너에서 오는 수직 화염 (그림 1)을 통해, (두 손으로 피펫의 끝을 잡고) 수평으로 유지했다.
- 유리가 녹기 시작하면, 불꽃에서 피펫을 원하는 피펫을 얻기 위해 빠른 당기는 운동을 수행합니다. 단단히 길이와 내부 모세관의 직경을 조정 손톱으로 피펫의 좁은 점에 가까운 초과 유리를 잘라. 얇은 모세관은 난자의 직경보다 약간 큰 ~ 100 ㎛의 내부 직경을 가지고 있는지 확인합니다 (~ 80 μm의).
- 입 피펫, 적절한 팁을 이용하여 뽑아 피펫에 흡인기 관의 한쪽 끝을 연결하고 이빨을 확보 입 타단 장소.
- 무균 핀셋을 사용하여, 난소를 수집하고 세포 배양 용 배양 접시 (35mm X 10mm)의 바닥에이를 증착. M2 1ml의 이전에 37 ℃에서 평형화 그들을 덮5 % CO 2 (그림 2).
- 부드럽게 M2 (그림 3)에서 전 정부 난자를 해제 멸균 인슐린 주사기 바늘로 난소의 난포에 구멍.
- 부드럽게 입 여포 세포 및 다른 가능한 조직 파편 (도 4a)를 제거하고 이전 (배아 배양에 적합한 광유 덮여 M2의 작은 방울 (20 μL)의 하단에이를 정착 좁은 파스퇴르 피펫을 통해 난자를 피펫 준비도 4B).
주 : (M2)의 여러 다른 방울을 통해 지속적으로 피펫 팅에 의한 난자의 투명대에 연결된 모든 난구 세포를 제거하는 것이 중요하다. 매질의 pH의 변화를 피하기 위해 가능한 한 빨리이 단계를 수행한다.
Hoechst33342 4. 전 정부 난 모세포 염색
참고 : 전 정부 난자는 SN (둘러싸인 핵소체), NSN (핵소체를 둘러싸인되지 않음) 또는 구별 할 수있다다른 중간 형태로, Hoechst33342의 supravital 농도 (또는 염기에 대한 구체적인 다른 마커 AT) (14) 염색 후 자신의 염색질 조직을 기반으로. NSN은 따라서,하지의 이름을하면서 사실, SN 난자는 핵소체 주위 헥스 양성 반지를 보여줍니다.
적절한 난자 염색의 경우 :
- 어둠 속에서 10 분 동안 50 NG / μL의 supravital 농도 Hoechst33342 (20 μL) (M2)에 희석 방울로 입 피펫을 사용하여 난자를 전송합니다.
- Hoechst33342 함께 배양 후, 조직 염색질 (SN 또는 NSN)에 기초한 정렬, 광유 덮여 M2의 작은 방울 (5 μL)의 바닥에 입을 피펫으로 각 단일 난자 옮긴다. 난자의 염색질 구성을 시각화 Hoechst33342 필터 (발광 파장 486 ㎚)을 갖추고있는 형광 현미경을 사용합니다.
주 : 사용 된 형광 현미경의 종류에 따라, 난T는 이미지 수집을 위해 유리 바닥 배양 접시를 사용하는 것이 필수적 될 수 있습니다. 35mm 요리에 대한 시편 홀더를 장착 공 초점 현미경 올림푸스 Fluoview Fv10i는 0.17 mm의 표준 두께 허용 0.13 0.21 mm 정도의 범위와 이미지 수집에만 유리 바닥 요리가 필요합니다. - 아마도, 더 이상보다 5-10 초 동안 존재 핵소체 주위의 링 부재 (도 5)를 가시화하기에 충분한 시간을 난 모세포를 자극.
- 체외 성숙을 유도 또는 분자 나 세포 분석을위한 적절한 버퍼에 보관 5 % CO 2, 37 ℃에서 (M2)에서, 문화 전 정부의 SN과 NSN 난자를 정렬 한 후.
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Representative Results
다음 이미지 Hoechst33342 의해 난자 '정렬에 피펫 준비부터 마우스 난소 전 정부로부터 난자를 분리하기 위해 사용 된 방법을 보여준다. 이 방법은 매우 간단하고, CO2 인큐베이터, 실체 현미경과 Hoechst33342의 관측을위한 올바른 필터를 갖춘 형광 현미경에 장착 된 임의의 실험실에서 수행 될 수있다 (1) 수치는 피펫 제조의 초기 단계를 보여준다. 유리 등을 용융 및 연질되기 시작 피펫의 양단 동시에, 피펫은 화염 인출되어야 떨어져 뽑아되어야한다. 적절하게 보정하는 경우 또는, 유리 모세관은 동일하게 또는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 당겨질 수있다. 너무 얇은 경우, 난자 작은 캡 내부 단편화 될 수있다 : 그것은 오른쪽 모세관 직경 오른쪽 입 피펫이 매우 중요하기 때문이다 중요한 단계illary하고, 예를 들면, 난 모세포를 이동할 때 난 모세포를 함유하는 배지의 적당한 흡인이 손실 될 수 있고, 너무 큰 경우에는 2도. 다른 하나의 드롭, 잠시 다이 및도 3은 전 정부 난자의 기계적 분리를 보여 멸균 인슐린 바늘을 사용하여 난포에서. 그것은 그들이 유체를 함유하는 공동 또는 전 정부 특징 때문에 이러한 모낭을 인식하는 것은 매우 용이하고, 그 과립 세포와 난자가 발견하고이를 통해 다른 분자와 외부 환경으로부터 교환 될 수있는 매체이다. 일단 격리, 전 정부 난자는도 4a와 B에서와 같이 한 번., 난자를 둘러싼 체세포를 제거하는 M2 매체의 다른 한 방울로부터 전송 된 "무 결함"전 정부 난자가 분류에 대한 준비가되어 있습니다. 그림 5의 마지막 단계를 표시해야합니다 이 프로토콜의, 그 Hoechst33342 F와 격리 된 전 정부 난자의 염색은또는 빠른 정렬은 염색질 조직을 기반으로. 이 마커, 예를 들어, 더 빠르게 DAPI보다 살아있는 세포 얼룩과는 세포 생존을 유지하기 위해 supravital 농도 (50 NG / μL)에 사용되어야한다. 염색질 조직 세포 얼룩은 아마이 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다 : 난자가 너무 그들이 손상 및 미래의 에세이에 대해 사용할 수 없게 될 수 있습니다 기쁘게 생각합니다. 마우스 난자인가하면 전반적으로, 이것은 (방법 섹션에서 표시된 것 제외) 특정주의를 필요로하지 않는 간단한 방법이다. 모든 단계는 실온에서 수행 될 수있다.
유리 파스퇴르 피펫과 분젠 버너를 사용하여 입 피펫 그림 1. 준비. 생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오의 그림입니다.
그림 사전 예열 및 평형 M2 매체 가득 배양 접시 2. 본래 난소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
멸균 된 바늘에 의한 난포에서 전 정부 난자 3. 초기 격리 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
갓 격리 된 난자의 그림 4. 전송M2medium (B) 예열의 작은 방울을 포함하는 다른 페트리 접시에 페트리 접시 (A)에서 입 피펫과 평형 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 난 모세포 염색 Hoechst33342로 분류. 공 초점 현미경 올림푸스 Fluoview Fv10i에서 촬영 NSN과 SN 난자의 단일 이미지 (배율 60X, 바 : 10 μm의, PHC : 위상차). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 분리 및 마우스 전 정부 GV 난자를 분류하기 위해 사용 된 방법을 설명한다. 몇 가지 예외를 제외하고, 밑줄 특별히 중요한 단계가 없습니다. ) 난자의 활력을 유지하고 b)에 사용되는 배지에서 pH 변화를 방지 : 첫째 :이 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 둘째 : 난자는 IVM과 체외 수정은 다음 단계는 특히, 염색질 손상 및 난자의 후속 죽음을 피하기 위해 Hoechst33342에 (5 ~ 10 초) 간략하게 흥분한다. 현재까지이 SN과 NSN 마우스 전 정부 난자를 정렬하는 가장 빠른 방법입니다.
불임 목적을 위해 인간의 전 정부 난자를 정렬하는 데 사용, 불행하게도, Hochest33342 여성 마우스 (및 기타 포유 동물 실험 모델)의 SN과 NSN 난 모세포의 특성을하는 효율적인 방법이 될 입증되었습니다하지만 할 수 없습니다.
미성숙 난자의 체외 성숙 일상적 너무 인간에서 사용하기 때문에, 그것은 하시다"나쁜"것과는 "좋은"난 모세포 (예, SN)을 구별하는 비 침습적 방법을 찾는 것이 매우 중요하다 ULD (즉, NSN)은 체외 수정 이후의 장래 배아 발달의 성공을 증가. 게다가, 난소 조직에서 분리 및 SN 난자의 문화는 여성 암 치료를 받고 난소 병리와 고통의 불임 보존에 사용될 수 있습니다.
이 자연 현상을 이용하여, 중요한 데이터는 자연적으로 난자 개발의 기본 생물학에 관심뿐만 아니라 인간과 동물의 체외 수정 시술의 임상에 사람들에게뿐만 아니라 말하는 배아 착상 전 손실 발생의 이해를 위해 제공 될 수있다.
인간의 건강을위한이 기술의 의미는, 배아와 동물 복제의 정치학 15 중요하다. "생명 호환되지 않는"난 모세포를 식별하고 제거 할 수 있다는 것입니다매우 중요한 충족 임상 요구에 최첨단 솔루션을 선도, 체외 수정 기술의 효과적인 수준을 높이.
사실, 생식 생물학의 국제 과학계는 인간의 체외 수정 과정에이 프로토콜을 적용하는 데 필요한 중요한 개선을 추구에 기여할 수있다. 프로토콜 (지우기 안전상의 이유로) 인간에게 적용 할 수없는 경우에도, 여전히 전 정부 성숙의 최종 단계에서 염색질 조직 사이의 링크 (즉, 게놈 구조) 및 유전자 발현 기술을 개선하기 위해 엄청난 용량을 유지 인간 복제의 뜨거운 주제 중 하나.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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