Summary
यहाँ हम nucleolar संगठन के आधार पर माउस कोटरीय oocytes के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Introduction
अंडाशय के कोटरीय डिब्बे से अलग कोटरीय पूर्ण विकसित oocytes (जीवी, कीटाणु पुटिका) नियमित रूप से इस तरह के रूप में विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, मेटाफ़ेज़ द्वितीय चरण तक इन विट्रो परिपक्वता के पीछे आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन।
उनके सुंदर दिखने के सबसे कोटरीय oocytes के बावजूद, लेकिन सभी नहीं, अर्धसूत्रीविभाजन को पूरा करने और ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंचने के लिए सक्षम हैं; निषेचन 3-5 होती है, तो वास्तव में, मनुष्य 1,2 सहित कई स्तनधारी प्रजातियों में, उनमें से लगभग 30%, 2 सेल मंच पर उनके विकास को गिरफ्तार। तिथि करने के लिए, कुछ मापदंडों ऐसा करने में असमर्थ उन से भ्रूण के विकास को बनाए रखने के लिए सक्षम oocytes के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
उदाहरण के लिए, cresyl नीले धुंधला (बीसीबी) बीसीबी + या BCB- धुंधला से संबंधित इस छँटाई विधि की उपयोगिता है, हालांकि ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि के आधार पर oocytes सुलझाने के लिए एक वैध तरीका हैअभी भी 6-8 निर्भर प्रयोगशाला।
एक और अच्छी तरह से स्थापित विधि उनकी क्रोमेटिन संगठन में रहता है: (Hoechst33342) की तरह किसी भी डीएनए intercalating रंगों के साथ दाग, तो कोटरीय oocytes की 70% न्यूक्लियस के चारों ओर एक डाई सकारात्मक अंगूठी दिखाने के लिए और न्यूक्लियस (एस एन) घिरा कहा जाता है 30%, जबकि शेष एक अधिक देखा सकारात्मक संकेतों दिखाने के लिए और (NSN) 3-5 नहीं घिरा न्यूक्लियस कहा जाता है। हाल ही में हमने दिखाया कि साइटोप्लास्मिक lattices 9 (CPLS, स्तनधारी oocytes और भ्रूण दोनों में माता के रूप में ली गई mRNA और राइबोसोम के लिए महत्वपूर्ण भंडारण साइटों) के अभाव में 10 और की उपस्थिति के साथ एक साथ (CPLS गठन 11 के लिए आवश्यक) विद्यालय के नीचे विनियमन, उनकी cytoplasms 9,12 में लिपिड बूंदों, 2-सेल चरण से आगे बढ़ने के लिए NSN oocytes अक्षमता से संबंधित अन्य कारणों से हो सकता है।
दुर्भाग्य से, कुछ तकनीकों कोटरीय एस.एन. और NSN oocytes और सुलझाने के लिए लागू किया जा सकता है,इस कारण के लिए, (परमाणु धुंधला, निर्धारण प्रक्रियाओं या मुंह pipettes साथ हेरफेर के बिना) एक कम इनवेसिव विधि का विकास दोनों मानव और पशुओं के भ्रूण के विकास की दरों में वृद्धि करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है।
इस पत्र में, हम विस्तार से सरल और त्वरित प्रोटोकॉल विज्ञापन प्रकार एस.एन. और मादा चूहों से NSN कोटरीय oocytes को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया और यह महिला gametogenesis, डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता और भ्रूण के विकास के अध्ययन में रुचि रखने वाले सभी वैज्ञानिकों को संबोधित किया है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल यूरोपीय के मार्गदर्शक सिद्धांत (ईयू 63/2010) और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए इस्तेमाल जानवरों की रक्षा इतालवी (26/2014) कानूनों के अनुसार आयोजित किया जाता है। सरवाइकल अव्यवस्था इच्छामृत्यु अंडाशय अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है और यह इस अध्ययन को कवर करने की मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध व्यक्तियों विशेषज्ञ द्वारा किया जाता है और प्रशिक्षित किया जाता है।
1. पशु
- नियंत्रित तापमान और नमी के साथ एक कमरे में छह सप्ताह पुराने मादा चूहों को वयस्क 3 बनाए रखें (12L के चरणों के साथ: 12D और फेड यथेच्छ)।
- कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) के प्रभाव की नकल उतार द्वारा कूपिक विकास को प्रोत्साहित करने के लिए गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन के 2.5 आइयू (PMSG) के साथ intraperitoneally चूहों इंजेक्षन। बाद में कोटरीय oocytes संग्रह 48hrs के लिए अंडाशय अलग। अपने संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार, पहले से PMSG इंजेक्शन के साथ महिला माउस euthanize।
- जल्दी से शरीर गुहा से अंडाशय हटाने और पेट्री डिश शेष भाग में उन्हें जगहबाद में oocytes अलगाव के लिए एम 2 मध्यम aining (धारा 3 देखें)।
- बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करके पेरिटोनियम में एक चीरा द्वारा पीछा पेट की दीवार को कवर त्वचा पर एक चीरा। मूत्राशय से शुरू होने वाले एक वी के आकार के गठन, पेट का पर्दाफाश करने के लिए चीरा खोलें बाँझ चिमटी का उपयोग कर एक तरफ हिम्मत बढ़ने के लिए और गर्भाशय ट्यूब स्थानीय बनाना।
- गुर्दे के नीचे स्थित अंडाशय का निरीक्षण करें। बाँझ चिमटी के साथ प्रत्येक ट्यूब पकड़ो और उन्हें रिहा करने के अंडाशय के नीचे एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। पूर्व equilibrated मध्यम युक्त एक पेट्री डिश के तल पर दोनों अंडाशय स्थानांतरण।
2. हार्मोन तैयारी
- एक उचित इंजेक्शन की मात्रा के लिए 0.1 मिलीग्राम प्रति 2.5 आइयू हार्मोन का एक काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ isotonic खारा समाधान के साथ (अलग स्टॉक सांद्रता में उपलब्ध) PMSG पतला।
नोट: हार्मोन समाधान में 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों में aliquoted और संग्रहीत किया जाना चाहिए -2उपयोग के दिन तक 0 डिग्री सेल्सियस। -20 डिग्री सेल्सियस पर तीन महीने से अधिक समय पतला aliquots मत रखना। Thawed एक बार सीरियल इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं, तो चार डिग्री सेल्सियस पर हार्मोन के समाधान की aliquots की दुकान और 4 दिन के भीतर उन्हें इस्तेमाल करते हैं।
3. कोटरीय Oocytes अलगाव
उचित oocytes अलगाव के लिए:
- Oocytes अलगाव की प्रक्रिया शुरू करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर M2 मध्यम 13 (एम 2) संतुलित करना। दो पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी), अंडाशय puncturing और से अलगाव के बाद oocytes स्थानांतरण के लिए खनिज तेल (~ 1.5 एमएल) के साथ कवर M2 के छोटे बूंदों के साथ एक दूसरे (20 μl) के लिए M2 के 1 मिलीलीटर के साथ एक तैयार अंडाशय (3.4-3.6 देखें)। तैयार इस्तेमाल किया जा रहा है जब तक 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में दोनों पेट्री डिश रखें।
- Oocytes अलगाव की प्रक्रिया के दौरान एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
- Stretc द्वारा oocytes इकट्ठा करने के लिए पतली मुंह कांच pipettes तैयारhing कांच पाश्चर pipettes लेम्प बर्नर से आ रही एक खड़ी लौ (चित्रा 1) से अधिक है, (दोनों हाथों से पिपेट की छोर पकड़) क्षैतिज रखा।
- कांच पिघला करने के लिए शुरू होता है, लौ से बाहर pipet ले और वांछित पिपेट प्राप्त करने के लिए एक त्वरित खींच आंदोलन प्रदर्शन करते हैं। मजबूती लंबाई और आंतरिक केशिका के व्यास को समायोजित करने के नाखूनों के साथ पिपेट की संकीर्ण बिंदु के करीब अतिरिक्त गिलास में कटौती। पतली केशिका डिम्बाणुजनकोशिका के व्यास की तुलना में थोड़ा अधिक से अधिक ~ 100 माइक्रोन की एक आंतरिक व्यास, है कि यह सुनिश्चित (~ 80 माइक्रोन)।
- मुँह पिपेट करने के लिए, एक उपयुक्त टिप का उपयोग करके निकाला पिपेट को खींचने की मशीन ट्यूब के एक छोर से कनेक्ट और दांत के साथ इसे हासिल करने, मुंह में दूसरे छोर जगह है।
- बाँझ चिमटी का उपयोग अंडाशय लीजिए और एक सेल संस्कृति पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) के तल पर उन्हें जमा। M2 के 1 मिलीलीटर पहले से 37 डिग्री सेल्सियस पर equilibrated के साथ उन्हें कवरऔर 5% सीओ 2 (चित्रा 2)।
- धीरे M2 (चित्रा 3) में कोटरीय oocytes जारी करने के लिए एक बाँझ इंसुलिन सिरिंज सुई के साथ अंडाशय के कोटरीय के रोम पंचर।
- धीरे मुंह कूप कोशिकाओं और किसी भी अन्य संभावित ऊतक मलबे (चित्रा 4 ए) को हटाने और फिर पहले (भ्रूण संस्कृति के लिए उपयुक्त खनिज तेल के साथ कवर M2 की छोटी बूंदों (20 μl) के तल पर उन्हें व्यवस्थित करने के लिए एक संकीर्ण पाश्चर विंदुक के माध्यम से oocytes pipet तैयार, चित्रा 4 बी)।
नोट: यह M2 के कई और विभिन्न बूंदों के माध्यम से निरंतर pipetting द्वारा oocytes की zona pellucida से जुड़ी सभी मेघपुंज कोशिकाओं को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। मध्यम के पीएच में परिवर्तन से बचने के लिए संभव के रूप में जल्दी इस कदम को पूरा करें।
Hoechst33342 के साथ 4. कोटरीय Oocytes धुंधला
नोट: कोटरीय oocytes एसएन (घिरा न्यूक्लियस), NSN (न्यूक्लियस घिरा नहीं) या में प्रतिष्ठित किया जा सकताकिसी भी अन्य मध्यवर्ती के रूप में, Hoechst33342 की supravital एकाग्रता (या अड्डों के लिए विशिष्ट किसी अन्य मार्करों पर) के साथ 14 धुंधला के बाद उनकी क्रोमेटिन संगठन पर आधारित है। NSN, इसलिए नहीं कि इसके नाम से करते हैं, जबकि वास्तव में, एसएन oocytes न्यूक्लियस के चारों ओर एक Hoechst पॉजिटिव अंगूठी दिखाने के लिए।
उचित oocytes धुंधला के लिए:
- अंधेरे में 10 मिनट के लिए 50 एनजी / μl की supravital एकाग्रता में Hoechst33342 (20 μl) M2 में पतला की बूंदों में एक मुँह पिपेट का उपयोग oocytes स्थानांतरण।
- Hoechst33342 साथ ऊष्मायन के बाद, क्रोमेटिन संगठन (एस एन या NSN) पर आधारित छंटाई के लिए, खनिज तेल के साथ कवर M2 की छोटी बूंदों (5 μl) के तल पर एक मुंह विंदुक के साथ प्रत्येक एकल डिम्बाणुजनकोशिका हस्तांतरण। Oocytes की क्रोमेटिन विन्यास कल्पना करने के लिए Hoechst33342 फिल्टर (उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 486 एनएम) से लैस किसी भी प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें।
नोट: इस्तेमाल किया प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के प्रकार पर निर्भर करता है, मैंटी छवि अधिग्रहण के लिए गिलास नीचे पेट्री डिश का उपयोग करने के लिए जरूरी हो सकता है। 35 मिमी पकवान के लिए एक नमूना धारक के साथ सुसज्जित जब confocal माइक्रोस्कोपी ओलिंप FluoView Fv10i एक 0.17 मिमी मानक मोटाई और स्वीकार्य 0.13 0.21 मिमी से एक सीमा के साथ छवि अधिग्रहण के लिए केवल गिलास नीचे-व्यंजन, की आवश्यकता है। - अधिक संभावना है, अब और नहीं की तुलना में 5-10 सेकंड के लिए उपस्थिति या न्यूक्लियस के चारों ओर एक अंगूठी की अनुपस्थिति (चित्रा 5) कल्पना करने के लिए पर्याप्त समय oocytes उत्तेजित।
- इन विट्रो परिपक्वता प्रेरित या आणविक या सेलुलर विश्लेषण के लिए उपयुक्त buffers में उन्हें रखने के लिए 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर M2 में, संस्कृति कोटरीय एस.एन. और NSN oocytes छँटाई करने के बाद।
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Representative Results
निम्नलिखित चित्र Hoechst33342 के माध्यम से oocytes 'छँटाई करने के लिए pipettes तैयारी से शुरू, माउस अंडाशय से कोटरीय oocytes को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया विधि दिखा। यह पद्धति काफी सरल है और सीओ 2 इनक्यूबेटर, एक stereomicroscope और Hoechst33342 के अवलोकन के लिए सही फिल्टर से लैस एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी से लैस किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है 1 चित्रा पिपेट तैयारी के प्रारंभिक कदम से पता चलता है:। कांच के रूप में पिघल और नरम बनने के लिए शुरू होता है, पिपेट के दोनों सिरों में एक ही समय में, पिपेट लौ से बाहर रखा जाना चाहिए, अलग निकाला और किया जाना चाहिए। ठीक से calibrated यदि वैकल्पिक रूप से, कांच केशिका, एक ही रास्ता है या एक micropipette खींचने का उपयोग करने में खींचा जा सकता है। यह भी पतली है, तो oocytes स्मॉल कैप अंदर खंडित किया जा सकता है: यह सही केशिका व्यास के साथ सही मुँह पिपेट होना बहुत जरूरी है, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण कदम हैillary और यह उदाहरण के लिए, oocytes जब चलती oocytes युक्त मध्यम का एक उचित सक्शन खो दिया जा सकता है, बहुत बड़ा है, तो 2 रु। दूसरे के लिए एक बूंद से, कुछ ही मिनटों में मर जाते हैं और 3 कोटरीय oocytes की यांत्रिक अलगाव दिखाने एक बाँझ इंसुलिन सुई का उपयोग कोटरीय रोम से। यह वे एक तरल पदार्थ युक्त एक गुहा या कोटर की विशेषता है, क्योंकि इन के रोम पहचान करने के लिए काफी आसान है, कि ग्रान्युलोसा कोशिकाओं और डिम्बाणुजनकोशिका पाए जाते हैं और जिसके माध्यम से विभिन्न अणुओं को और बाहरी वातावरण से विमर्श किया जा सकता है, जिसमें मुख्य माध्यम है। एक बार अलग, कोटरीय oocytes आंकड़े -4 ए और बी में दिखाया गया है एक बार।, Oocytes आसपास के दैहिक कोशिकाओं को हटाने के M2 के माध्यम के लिए एक और एक बूंद से स्थानांतरित "denuded", कोटरीय oocytes वर्गीकरण के लिए तैयार हैं। 5 आंकड़ा पिछले कदम से पता चलता किया जाना चाहिए इस प्रोटोकॉल की, कि Hoechst33342 च के साथ पृथक कोटरीय oocytes की धुंधला हैया एक त्वरित छँटाई उनकी क्रोमेटिन संगठन पर आधारित है। यह मार्कर उदाहरण के लिए, और अधिक तेजी से DAPI से जीवित कोशिकाओं दाग, और सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए supravital एकाग्रता (50 एनजी / μl) में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। क्रोमेटिन संगठन के लिए सेल धुंधला शायद इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है: oocytes भी लंबे समय से वे क्षतिग्रस्त हो और भविष्य निबंध के लिए बेकार हो जा सकती है उत्साहित हैं। माउस oocytes के लिए आवेदन किया है, तो कुल मिलाकर, इस (विधि अनुभाग में संकेत उन लोगों के लिए छोड़कर) विशेष सावधानियों की आवश्यकता नहीं है कि एक सरल तरीका है। सभी कदम आरटी पर किया जा सकता है।
कांच पाश्चर pipettes और एक लेम्प बर्नर का उपयोग कर एक मुँह पिपेट की चित्रा 1. तैयारी। Thi का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।
चित्रा पूर्व गर्म और equilibrated M2 के मध्यम से भरा पेट्री डिश में 2. बरकरार अंडाशय। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एक बाँझ सुई के माध्यम से कोटरीय रोम से कोटरीय oocytes की 3. आरंभिक अलगाव चित्रा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
हौसले से पृथक oocytes की चित्रा 4. स्थानांतरणM2medium (बी) के पूर्व गर्म की छोटी बूंदों से युक्त एक अलग पेट्री डिश के लिए पेट्री डिश (ए) से मुंह विंदुक के साथ और equilibrated यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. Oocytes दाग और Hoechst33342 के साथ हल। Confocal खुर्दबीन ओलिंप FluoView Fv10i पर लिया NSN और एस.एन. oocytes की एकल छवियों (बढ़ाई 60X; पट्टी: 10 माइक्रोन, पीएचसी: चरण विपरीत)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल को अलग और माउस कोटरीय जीवी oocytes वर्गीकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि का वर्णन है। कुछ अपवादों के साथ, रेखांकित करने के लिए कोई विशेष महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। क) oocytes की जीवन शक्ति को बनाए रखने और बी) का इस्तेमाल किया माध्यम में पीएच परिवर्तन से बचने: प्रथम: के लिए इस प्रक्रिया के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए। दूसरा: oocytes IVM और आईवीएफ निम्नलिखित कदम उठाए हैं, खासकर अगर क्रोमेटिन क्षति और oocytes के बाद मौत से बचने के लिए Hoechst33342 करने के लिए (5-10 सेकंड) संक्षेप में उत्साहित किया जाना चाहिए। आज की तारीख में इस एस.एन. और NSN माउस कोटरीय oocytes सुलझाने के लिए तेज तरीका है।
प्रजनन क्षमता प्रयोजनों के लिए मानव में कोटरीय oocytes से हल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, दुर्भाग्य से, Hochest33342 मादा चूहों (और अन्य स्तनधारी प्रयोगशाला मॉडल) में एसएन और NSN oocytes को चिह्नित करने के लिए एक कारगर तरीका साबित हो गया है, लेकिन यह नहीं हो सकता।
अपरिपक्व oocytes की इन विट्रो परिपक्वता नियमित तौर पर भी मानव में प्रयोग किया जाता है लेकिन, जब से यह wo"बुरा" लोगों से "अच्छा" oocytes (यानी, एस.एन.) भेद करने के लिए एक गैर इनवेसिव रास्ता खोजने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हो uld (यानी, NSN) में इन विट्रो निषेचन और बाद भावी भ्रूण के विकास की सफलता को बढ़ाने के लिए। इसके अलावा, डिम्बग्रंथि ऊतक से अलगाव और एस.एन. oocytes की संस्कृति महिलाओं को कैंसर के उपचार के दौर से गुजर या डिम्बग्रंथि विकृतियों से पीड़ित में प्रजनन संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्राकृतिक घटना का शोषण करके, महत्वपूर्ण डेटा स्वाभाविक रूप से डिम्बाणुजनकोशिका विकास की बुनियादी जीव विज्ञान में रुचि रखते हैं, लेकिन यह भी मानव और पशुओं के आईवीएफ चिकित्सकों के लिए उन लोगों के लिए न केवल बोलता है, जो भ्रूण preimplantation घाटा होने वाली को समझने के लिए प्रदान किया जा सकता है।
मानव स्वास्थ्य के लिए इस तकनीक का निहितार्थ, भ्रूण और पशु प्रजनन की बायोपॉलिटिक्स 15 महत्वपूर्ण हैं। "जीवन-असंगत" oocytes की पहचान करने और खत्म करने में सक्षम होता जा रहा हैबहुत महत्वपूर्ण unmet नैदानिक जरूरतों के लिए अत्याधुनिक समाधान के लिए अग्रणी, आईवीएफ तकनीक के प्रभावी स्तर बढ़ा।
वास्तव में, युग्मक जीव के अंतरराष्ट्रीय वैज्ञानिक समुदाय मानव आईवीएफ प्रक्रिया के लिए इस प्रोटोकॉल लागू करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण सुधार की तलाश करने के लिए योगदान कर सकता है। प्रोटोकॉल (स्पष्ट सुरक्षा कारणों के लिए) मनुष्य के लिए लागू नहीं किया जा सकता, भले ही यह अभी भी कोटरीय परिपक्वता के अंतिम चरण के दौरान क्रोमेटिन संगठन के बीच की कड़ी है (यानी, जीनोम आर्किटेक्चर) और जीन अभिव्यक्ति के ज्ञान में सुधार करने के लिए एक जबरदस्त क्षमता रखता है , मानव प्रजनन में गर्म विषयों में से एक।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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