基于核仁染色质组织分离鼠标窦卵母细胞与表征

Summary

在这里，我们提出了一个协议的基础上核仁组织小鼠卵母细胞胃窦表征。

Introduction

胃窦从卵巢的窦室分离的完全的卵母细胞生长（GV，生发泡）通常用于不同的目的，诸如，例如，在体外成熟直至中期II阶段背后的分子和细胞机制的研究。

尽管他们漂亮的外观最有腔卵母细胞，但不是所有的，都能够完成减数分裂并达到囊胚阶段;事实上，在许多哺乳动物物种，包括人类^1,2，其中的大约30％阻止其发展在2-细胞阶段，如果发生受精^3-5。迄今为止，只有少数参数用于卵母细胞能够维持从那些无法做到的胚胎发育之间进行区分。

例如，甲酚蓝染色（BCB）是一个有效的方法，以基于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的卵母细胞进行排序尽管这种分选方法的效用与BCB +或BCB-染色仍然依赖于实验室^6-8。

另一成熟方法驻留在他们的染色质组织：如果沾上任何DNA嵌入染料（如Hoechst33342染色），胃窦的卵母细胞的70％表现出围绕核仁染料正环和被称为环绕核仁（SN）而剩余的30％的显示出更多的斑点积极的信号，被称为不环绕核仁^{（NSN）3-5。}最近我们发现，如果没有细胞质晶格^9（的CPL，重要的存储位点在两个哺乳动物卵母细胞和胚胎母体衍生mRNA和核糖体）的^10和下调脑膜（必不可少的CPL形成^11），加上存在在其胞质^9,12脂滴，可以是有关的卵母细胞诺西无法继续进行的2细胞期其他原因。

不幸的是，很少有技术可应用于排序胃窦的SN和NSN和卵母细胞，因为这个原因，较少创伤的方法的开发（没有核染色，固定程序或操纵与嘴移液器）可能成为非常重要的是增加人和动物胚胎发育的速率。

在本文中，我们详细介绍了简单快捷的协议，用于隔离的广告排序SN和雌性小鼠NSN窦卵母细胞，它是给所有有兴趣的女性配子，卵母细胞成熟和胚胎发育的研究中，科学家。

Protocol

该协议是按照欧洲的指导原则（EU二千〇十分之六十三）和保护用于科学研究的动物意大利（2014分之26）的法律进行。颈椎脱位安乐死用于卵巢隔离，它是由专家进行和训练有素的已批准的方案涉及本次研究中列出的个人。

1.动物

1. 保持成年3至6周大的雌性小鼠中的房间温度和湿度受控（具有12L的阶段：12D，并自由采食）。
2. 腹腔注入小鼠2.5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），通过模仿的卵泡刺激素（FSH）的影响，刺激卵泡生长。隔离卵巢的窦收集的卵母细胞48小时后。安乐死的雌性小鼠以前用PMSG注射，根据你的机构的指导方针。
3. 从体腔迅速取出卵巢和它们放入培养皿中续癌宁M2培养后续的卵母细胞隔离（见第3节）。
   1. 使在皮肤上的覆盖腹壁接着在腹膜切口通过使用无菌解剖剪刀切开。打开切口以暴露腹腔，用无菌镊子将胆一方和本地化子宫管，形成一个V形从膀胱开始。
   2. 观察位于下方的肾脏卵巢。保持每个管，用无菌镊子和作一小切口在卵巢释放他们的底部。在含预平衡介质的培养皿的底部转移双侧卵巢。

2.激素制剂

1. 稀PMSG（在不同的库存浓度可提供）用无菌等渗盐水溶液以获得每0.1 ml的2.5 IU激素一个工作浓度为适当的注射体积。
   注：激素溶液必须等分的0.5ml管中，并储存在-20℃下直至使用当天。不要将稀释分装比在-20°C三个月的时间。一旦解冻，如果连续注射执行，存储激素的解决方案的分装置于+4℃，4天之内使用。

3.胃窦卵母细胞隔离

对于正确的卵母细胞的分离：

1. 在开始的卵母细胞的分离步骤之前平衡M2培养基^{13（M2），}在_5％的CO 2和37℃下至少1小时。准备两个培养皿（35毫米×10毫米），一个用1ml M2的用于卵巢穿刺和M2的从隔离后覆盖有矿物油（〜1.5毫升）中的卵母细胞转移，第二个具有小滴（20微升）子房（见3.4-3.6）。保持在孵化两培养皿在_5％的CO 2和37℃下，直到准备使用。
2. 在卵母细胞分离方法使用立体显微镜。
3. 准备薄薄的嘴唇玻璃吸管收集的卵母细胞伸缩兴玻璃巴斯德吸液管保持水平（持用双手吸管的两端），在一个垂直的火焰本生灯到来（ 图1）。
   1. 一旦玻璃开始熔化，取吸管出来的火焰和执行快速牵引运动，以获得所需吸管。牢牢剪断多余的玻璃靠近窄点用指甲以调节长度和内部毛细管的直径的吸移管的。确保薄毛细管具有〜100微米的内径，比卵母细胞的直径稍大（〜80微米）。
   2. 口移液管，通过使用适当的尖端连接吸气管至所述拉吸管的一端，并将另一端的嘴，用牙固定它。
4. 使用无菌镊子收集卵巢和将它们存放在细胞培养的培养皿（35毫米×10毫米）的底部。覆盖它们用1ml M2的先前在37℃下平衡过和5％的CO _2（ 图2）。
5. 轻轻穿刺卵巢的窦性卵泡，用无菌胰岛素注射器针头释放胃窦的卵母细胞中的M2（图3）。
6. 轻轻口通过一个狭窄的巴斯德吸管除去毛囊细胞和任何其他可能的组织碎片（图4A），然后解决它们在小滴的M2（20微升）覆盖有适于胚胎培养矿物油的底部（先前吸管的卵母细胞制备; 图4B）。
   注：通过几个不同滴M2来消除附着在卵母细胞连续移液的透明带的卵丘细胞是非常重要的。执行此步骤尽可能快，以避免在介质的pH的改变。

4.胃窦卵母细胞染色与Hoechst33342染色

注：窦卵母细胞可以在SN（环绕核仁），诺西（不环绕核仁），或者加以区分在任何其他中间形式的基础上，他们的染色质组织，Hoechst33342染色的体外活浓度（或特定的任何其他标记物为基础的^AT）14染色后。事实上，SN卵母细胞表现出周围的核仁一个赫斯特阳性的环，而诺西不这样做，因此它的名字。

对于正确的卵母细胞染色：

1. 传送用嘴吸管卵母细胞成Hoechst33342染色（20微升）稀释在M2的液滴在50毫微克/微升体外活浓度在黑暗10分钟。
2. 用Hoechst33342染色的培养后，在小滴的M2（5微升）覆盖有矿物油，基于染色质组织（SN或NSN）分选的底部转移的每个单个卵母细胞用吸管嘴。使用配备Hoechst33342染色过滤器（发射波长486纳米）的任何荧光显微镜可视化的卵母细胞的染色质结构。
   注意：根据所用荧光显微镜的型，it可以成为当务之急使用玻璃底培养皿进行图像采集。在激光共聚焦显微镜奥林巴斯Fluoview Fv10i在配备35毫米盘试样固定器只需要玻璃底菜进行图像采集，用0.17毫米标准厚度和范围内可以接受0.13 0.21毫米。
3. 激励的卵母细胞的时间不超过5-10秒，可能有足够的时间来可视化的存在或不存在围绕核仁一个环的（图5）。
4. 后整理，培养胃窦SN和诺基亚西门子的卵母细胞中的M2在_5％的CO 2和37℃以诱导体外成熟或保持它们在适当的缓冲器，用于分子或细胞的分析。

Representative Results

下面的图片展示用于隔离窦卵母细胞来自小鼠卵巢，用Hoechst33342染色的方式从移液器准备到卵母细胞“排序启动方法。这种方法相当简单，并且可以在装有_CO 2培养箱，立体显微镜，配有正确的过滤器，用于观察Hoechst33342染色的荧光显微镜任何实验室中进行图1示出了移液管制备的初始步骤：作为玻璃开始熔化并变软，吸移管的两端必须被拉开，并在同一时间，在吸移管必须取出的火焰。或者，玻璃毛细管可拉以同样的方式或使用微量拉马，如果适当地校准。这是关键的一步，因为它是非常重要的是要有正确的吸管口用正确的毛细血管直径：如果太薄，卵母细胞可以在小盘里支离破碎illary并死在几分钟内，如果过大，将含有卵母细胞的介质的一个合适的吸力可移动的卵母细胞时，例如将丢失，从一滴到另一个。 图2和3显示胃窦的卵母细胞的机械隔离使用无菌胰岛素针窦状卵泡。这是很容易认识到这些毛囊，因为它们的特征在于包含流体的腔或窦，即是其中颗粒细胞和​​卵母细胞中发现，通过这些不同的分子可被交换到和来自外部环境的介质。一旦分离，胃窦的卵母细胞，必须从一滴到另一个M2培养基转移到除去包围的卵母细胞的体细胞， 如图4A和B，一旦“裸露”，胃窦的卵母细胞已经准备好进行分类。 图5示出的最后步骤此协议，即分离的卵母细胞胃窦用Hoechst33342染色f的染色或快速分拣根据其染色质的组织。这种标记物的污渍要比DAPI更迅速的活细胞，例如，与必须使用在体外活浓度（50毫微克/微升）以保持细胞生存力。细胞染色染色质组织可能是该协议的最关键的一步：如果卵母细胞很高兴太久，他们可能会被损坏并变得无法使用为将来的文章。总体而言，如果施加到小鼠卵母细胞，这是不需要特定的预防措施（除了那些在方法部分所示）的简单方法。所有的步骤可以在室温下进行。

图1. 制备用玻璃巴氏吸管和本生灯一张嘴吸液管。 请点击此处查看THI的放大版本。的身影。

图中的培养皿中充满了预热和平衡的M2培养2.完整的卵巢。 请点击此处查看该图的放大版本。

图从卵泡窦卵母细胞经消毒针头的手段3.初始隔离。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4.将新鲜分离的卵母细胞的从培养皿（ 一）含有小滴预热不同的培养皿口吸管和平衡M2medium（B） 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.卵母细胞染色，整理与Hoechst33342染色 。在的共聚焦显微镜奥林巴斯Fluoview Fv10i采取NSN和SN单卵母细胞的图像（放大倍数60X;酒吧：10微米;光子晶体：相衬）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

本协议描述用来分离和分类鼠标胃窦GV卵母细胞的方法。有强调，除少数例外，没有特别的关键步骤。第一：此过程应当尽可能快地进行，以：1）保持卵母细胞的活力和b）避免在使用的培养基的pH变化。第二：卵母细胞应该是简要地兴奋（5-10秒），以Hoechst33342染色，以避免染色质损害和卵母细胞的随后死亡，特别是如果IVM和体外受精是以下步骤。迄今为止，这是SN和NSN小鼠卵母细胞胃窦排序的最快方法。

Hochest33342已被证明是表征的SN和诺基亚西门子的卵母细胞在雌性小鼠（和其它哺乳动物实验室模型）的有效方式，但它不能是，不幸的是，用于在人类生育目的胃窦的卵母细胞进行排序。

然而 ，由于在体外成熟未成熟卵母细胞的常规地用于人类也一样，它をULD是极为重要的是找到一种非侵入性的方式，从“坏”的人区分“好”的卵母细胞（ 即 SN）（ 即 ，NSN）增加体外受精及随后的前瞻性胚胎的成功开发。此外，隔离和SN的卵母细胞的培养从卵巢组织可用于保存生育妇女接受癌症治疗或卵巢病状的患者。

通过利用这种自然现象，重要的数据可以被提供用于天然存在其中谈到不仅那些感兴趣的卵母细胞发育的基本生物学也对人类和动物的IVF临床医生胚胎植入前的损失的理解。

这项技术对人类健康的影响，胚胎和动物繁殖的生命政治有显著^15。如果能够识别和消除“生活不兼容”的卵母细胞会大大提高试管婴儿技术的有效电平，从而导致尖端解决方案的重要的未满足的临床需求。

事实上，配子生物学家的国际科学界将有助于寻求需要该协议适用于人类体外受精过程的关键改进。即使协议不能被应用到人类（为清楚安全的原因），它仍保持在胃窦熟化的最后阶段一巨大能力，以改善染色质组织之间（即，基因组结构）和基因表达的链路的知识，的热点话题人类生殖之一。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177