Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.
Introduction
ביציות Antral גדלו באופן מלא (GV, שלפוחית נבטי) מבודדות מתא Antral של השחלה משמשות באופן שיגרתי למטרות שונות כגון, למשל, המחקר של המנגנונים המולקולריים ותאיים מאחורי התבגרות במבחנה עד שלב Metaphase השני.
למרות ביציות המראה היפות שלהם Antral ביותר, אך לא כולם, הם מסוגלים להשלים מיוזה ולהגיע לשלב הבלסטוציסט; למעשה, במינים רבים של יונקים, כולל בני האדם 1,2, כ -30% מהם לעצור את התפתחותם בשלב 2-התא, אם מתרחשת הפריה 3-5. עד כה, כמה פרמטרים המשמשים להבחין בין ביציות יוכלו לקיים התפתחות העוברית מאלה שאינם מסוגלים לעשות זאת.
לדוגמא, מכתים Cresyl הכחול (BCB) הוא שיטה תקפה כדי למיין את הביציות המבוססים על הפעילות של גלוקוז-6-פוספט-דהידרוגנז למרות התועלת של שיטת מיון זו קשורה לBCB + או הכתמת BCB- היאעדיין מעבדה תלויה 6-8.
שיטה נוספת מבוססת היטב מתגוררת בארגון הכרומטין: אם מוכתם בכל צבעי intercalating DNA (כמו Hoechst33342), 70% מביציות Antral להראות צבע חיובי טבעת סביב הגרעין, והם נקראים מוקף הגרעין (SN), בעוד שנותר 30% להראות אותות חיוביים מנוקדים יותר ונקראים גרעין אינו מוקף (NSN) 3-5. לאחרונה הראו כי היעדר רשתות cytoplasmic 9 (הרב"טים, אתרי אחסון חשובים לmRNA נגזר אימהי והריבוזומים בשני ביציות ועוברי יונקים) 10 ומטה-הרגולציה של מאטר (חיונית להיווצרות רב"טים 11), יחד עם הנוכחות של טיפות שומנים בcytoplasms 9,12, יכולות להיות גורמים נוספים הקשורים לחוסר יכולת ביציות NSN כדי להמשיך מעבר לשלב 2-התא.
למרבה הצער, ניתן ליישם כמה טכניקות כדי למיין SN Antral וביציות NSN ו,מסיבה זו, הפיתוח של שיטה פחות פולשנית (ללא הכתמה גרעינית, נהלי קיבעון או מניפולציה עם טפטפות פה) יכול להיות מאוד חשוב כדי להגדיל את השיעורים של שני פיתוח עובר האדם ובעלי חיים.
במאמר זה, אנו פירוט הפרוטוקול הפשוט ומהיר המשמשים לSN סוג המודעה וביציות Antral NSN מנקבות עכברים לבודד והוא התייחס לכל המדענים מתעניינים במחקר של gametogenesis נקבה, הבשלת ביצית והתפתחות עובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה נערך בהתאם לעקרונות המנחים של אירופה (האיחוד האירופי 63/2010) ו- (26/2014) חוקי הגנה האיטלקים בעלי חיים המשמשים למחקר מדעי. המתת חסד נקע בצוואר הרחם משמשת לבידוד השחלות וזה מתבצע על ידי מומחה ומיומן אנשים רשומים בפרוטוקול שאושר על כיסוי מחקר זה.
1. בעלי חיים
- לשמור על מבוגרים 3 לנקבות עכברים 6 שבועות בן בחדר עם טמפרטורה מבוקרת ולחות (עם שלבים של 12L: 12D וכרצונך הפד).
- הזרק עכברי intraperitoneally עם 2.5 IU של גונדוטרופין סרום סוסה בהריון (PMSG) כדי להמריץ את צמיחת זקיקים על ידי המחקה את ההשפעה של הורמון מגרה זקיק (FSH). לבודד את השחלות ל48hrs אוסף ביציות Antral מאוחר יותר. להרדים את נקבת העכבר הזריק בעבר עם PMSG, על פי ההנחיות מוסדיות שלך.
- להסיר במהירות את השחלות מחלל הגוף ולהכניס אותם לתוך המשך צלחת פטריaining בינוני M2 לבידוד ביציות שלאחר מכן (ראה סעיף 3).
- עושה חתך בעור המכסה את דופן הבטן ואחריו חתך בהצפק באמצעות מספריים לנתיחה סטרילית. פתח את החתך על מנת לחשוף את הבטן, להזיז את האומץ בצד אחד באמצעות פינצטה סטרילי ולמקם את צינורות הרחם, ויוצר צורת V-החל משלפוחית השתן.
- שים לב לשחלות ממוקמות מתחת לכליות. החזק כל צינור עם פינצטה סטרילי ולעשות חתך קטן בחלק התחתון של השחלות לשחרר אותם. העבר את שני השחלות בתחתית צלחת פטרי המכילה בינוני מראש equilibrated.
2. הורמון הכנה
- לדלל PMSG (זמין בריכוזים שונים המניה) עם תמיסת מלח איזוטוני סטרילי כדי לקבל ריכוז עבודה של 2.5 הורמון IU ל0.1 מ"ל למתאימה עוצמת זריקה.
הערה: פתרונות הורמון חייבים להיות aliquoted ב 0.5 מיליליטר צינורות ומאוחסנים ב -20 ° C עד ליום שימוש. אין להשאיר aliquots המדולל יותר משלושה חודשים ב -20 ° C. ברגע שהפשיר, אם זריקות סידוריים מבוצעות, לאחסן aliquots של פתרונות הורמון ב+4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בם בתוך 4 ימים.
בידוד 3. Antral ביציות
לבידוד ביציות תקין:
- לאזן M2 בינוני 13 (M2) בשעת 5% CO 2 ו- C ° 37 במשך שעה לפחות 1 לפני שתתחיל בהליך בידוד ביציות. הכן שתי צלחות פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ), אחד עם 1 מיליליטר של M2 לניקוב השחלה והשני עם טיפות קטנות (20 μl) של M2 מכוסה בשמן מינרלים (~ 1.5 מיליליטר) להעברת ביציות לאחר בידוד מ השחלה (ראה 3.4-3.6). לשמור על שני צלחות פטרי בחממה ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- השתמש בסטראו בנהלי בידוד ביציות.
- הכן טפטפות זכוכית פה דקה כדי לאסוף את הביציות בסרטטפטפות פסטר זכוכית הינג המשיכה אופקית (מחזיקה את הקצוות של פיפטה בשתי הידיים), על אש אנכית המגיעה מהמבער בונזן (איור 1).
- ברגע שהכוס מתחילה להפשיר, לקחת את pipet מתוך הלהבה ולבצע תנועה מושכת מהירה כדי להשיג את פיפטה הרצויה. בתוקף לחתוך את הזכוכית העודפת קרובה לנקודה של פיפטה עם ציפורניים כדי להתאים את האורך והקוטר של הנימים הפנימיות הצרה. ודא שיש לו את הנימים דקות בקוטר פנימי של ~ 100 מיקרומטר, מעט גדול יותר מהקוטר של הביצית (~ 80 מיקרומטר).
- לפה פיפטה, חבר קצה אחד של צינור aspirator לפיפטה משכה באמצעות קצה מתאים ולמקם את הקצה השני בפה, המאבטח אותו עם השיניים.
- לאסוף את השחלות באמצעות פינצטה סטרילית ולהפקיד אותם בתחתית צלחת פטרי תרבית תאים (35 מ"מ x 10 מ"מ). לכסות אותם עם 1 מיליליטר של M2 equilibrated בעבר על 37 מעלות צלזיוסו 5% CO 2 (איור 2).
- בעדינות לנקב את זקיקי Antral של השחלות עם מחט מזרק אינסולין סטרילי לשחרר ביציות Antral בM2 (איור 3).
- בעדינות את הפה pipet הביציות באמצעות פיפטה פסטר צרה כדי להסיר תאי זקיק וכל פסולת אחרת אפשרית רקמה (איור 4 א) ולאחר מכן ליישב אותם בתחתית הטיפות קטנות (20 μl) של M2 מכוסים בשמן מינרלים מתאים לתרבות עובר (בעבר הכין; איור 4).
הערה: חשוב להסיר את כל תאי קומולוס המצורפים למעטפת השקופה של הביציות על ידי pipetting הרציף באמצעות מספר ושונה טיפות של M2. לבצע שלב זה מהר ככל האפשר, כדי למנוע שינויים ב- pH של המדיום.
4. Antral ביציות צביעה עם Hoechst33342
הערה: ביציות Antral ניתן להבחין בSN (גרעין מוקף), NSN (לא מוקף גרעין) אובכל צורת ביניים אחרת, המבוסס על ארגון הכרומטין לאחר צביעה עם ריכוז supravital של Hoechst33342 (או כל סמנים אחרים ספציפיים לבסיסים AT) 14. למעשה, ביציות SN להראות טבעת Hoechst חיובית סביב הגרעין תוך NSN לא, ומכאן שמה.
עבור מכתים ביציות תקין:
- מעבירים את הביציות באמצעות פיפטה פה לטיפין של Hoechst33342 (20 μl) בדילול מלא בM2 בריכוז supravital של 50 ng / μl עבור 10 דקות בחושך.
- לאחר הדגירה עם Hoechst33342, להעביר את כל ביצית אחת עם טפטפת פה בחלק התחתון של טיפות קטנות (5 μl) של M2 מכוסים בשמן מינרלים, למיון המבוסס על ארגון הכרומטין (SN או NSN). השתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן Hoechst33342 (אורך גל פליטה 486 ננומטר) כדי להמחיש את תצורת הכרומטין של הביציות.
הערה: בהתאם לסוג של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש, אנילא יכול להיות הכרחי כדי להשתמש בצלחת פטרי זכוכית תחתונה לרכישת תמונה. מיקרוסקופיה confocal אולימפוס Fluoview Fv10i כשהוא מצויד בבעל דגימה במשך 35 צלחת מ"מ דורשת תחתונה מנות רק זכוכית לרכישת תמונה, עם עובי סטנדרטי 0.17 מ"מ וטווח 0.13-0.21 מ"מ מקובל. - Excite הביציות לא יותר מ 5-10 שניות, סביר להניח מספיק זמן כדי להמחיש את הנוכחות או היעדר טבעת סביב הגרעין (איור 5).
- לאחר המיון, התרבות SN Antral וביציות NSN בM2 ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס כדי לגרום להבשלה חוץ גופייה או לשמור אותם במאגרים מתאימים לניתוחים מולקולריים או סלולריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמונות הבאות מציגות את השיטה המשמשת כדי לבודד ביציות Antral משחלות עכבר, החל מהכנת טפטפות למיון 'הביציות באמצעות Hoechst33342. שיטה זו היא די פשוטה וניתן לבצעו בכל מעבדה מצוידת בחממה CO 2, סטראו ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן המתאים להתבוננות בHoechst33342 איור 1 מציג את השלב הראשוני של הכנת פיפטה:. כזכוכית מתחיל להפשיר ולהיות רכים, בשני הקצוות של פיפטה יש נקרעו לגזרים ו, באותו הזמן, פיפטה יש לנקוט מהלהבה. לחלופין, נימי זכוכית יכולות להיות משך באותה הדרך או באמצעות חולץ micropipette, אם מכויל כראוי. זהו צעד חיוני, כי זה מאוד חשוב לי פיפטה תקין הפה עם קוטר הנימים הנכון: אם הוא דק מדי, ביציות ניתן מקוטעת בתוך הכובע הקטןillary ולמות בכמה דקות, אם הוא גדול מדי, שאיבה נכונה של המדיום המכיל את הביציות יכולה ללכת לאיבוד בעת מעבר הביציות, למשל, מירידה אחד למשנהו. איורים 2 ו -3 להראות הבידוד המכני של ביציות Antral מזקיקי Antral באמצעות מחט סטרילית אינסולין. זה די קל לזהות הזקיקים האלה כי הם מתאפיינים בחלל או antrum המכיל נוזל, שהוא המדיום שבו תאי granulosa והביצית נמצאים ושדרכו ניתן להחליף מולקולות שונות ומהסביבה החיצונית. ביציות לאחר מבודדות, Antral יש להעביר מאחד למשנהו ירידה של מדיום M2 כדי להסיר תאים סומטיים מקיפים את הביציות, כפי שמוצגות באיורי 4 א 'וב'. ברגע ש" ערומות ", ביציות Antral מוכנות לסיווג. איור 5 מראה את השלב האחרון של פרוטוקול זה, שהוא מכתים של ביציות Antral המבודדות עם Hoechst33342 Fאו מיון מהיר המבוסס על ארגון הכרומטין. כתמים זה סמן תאי חיים הרבה יותר מהר מאשר DAPI, למשל, ויש להשתמש בריכוז supravital (50 ng / μl) כדי לשמור על כדאיות תא. תא צביעה לארגון הכרומטין היא כנראה השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה: אם הביציות נרגשות יותר מדי זמן הם יכולים להיות פגומים והפכו לבלתי שמישים למסות עתיד. בסך הכל, אם להחיל ביציות עכבר, זה הוא שיטה פשוטה שאינו דורשת אמצעי זהירות ספציפית (פרט לאלה שצוינו בסעיף השיטה). ניתן לבצע את כל השלבים בRT.
הכנת איור 1. של פיפטה פה באמצעות טפטפות פסטר זכוכית ומבער בונזן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תידמות של.
איור 2. השחלות שלמות בצלחת פטרי מלאה בינוני M2 מראש התחמם equilibrated. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. בידוד ראשוני של ביציות Antral מזקיקי Antral באמצעות מחט סטרילית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
העברת איור 4. של הביציות מבודדות הטריעם טפטפת פה מצלחת פטרי () לצלחת פטרי שונה המכילה טיפות קטנות של טרום התחממתי equilibrated M2medium (ב ') אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ביציות 5. איור מוכתם ומסודרות עם Hoechst33342. תמונות יחידה של ביציות NSN וSN צולמו במיקרוסקופ confocal אולימפוס Fluoview Fv10i (הגדלה 60X; בר: 10 מיקרומטר; PHC: לעומת שלב). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השיטה המשמשת כדי לבודד ולסווג ביציות GV Antral העכבר. אין שלבים קריטיים במיוחד כדי להדגיש, עם כמה יוצאים מן הכלל. ראשון: הליך זה צריך להתבצע במהירות אפשרית ל: א) לשמור על החיוניות של הביציות וב) להימנע משינויי pH בטווח הבינוני בשימוש. שני: ביציות צריכה להיות נרגשות בקצרה (5-10 שניות) לHoechst33342 כדי למנוע נזק הכרומטין והמוות הבא של הביציות, במיוחד אם IVM והפריה חוץ גופית הם הצעדים הבאים. עד כה, זו הדרך המהירה ביותר כדי למיין ביציות Antral SN וNSN עכבר.
Hochest33342 הוכח להיות דרך יעילה לאפיין ביציות SN וNSN בנקבות עכברים (ומודלים במעבדה של יונקים אחרים), אבל זה לא יכול להיות, למרבה הצער, משמש כדי למיין ביציות Antral בבני אדם למטרות פוריות.
עם זאת, מאז התבגרות במבחנה של ביציות בשלות משמשת באופן שגרתי בבני אדם מדי, זה ווuld להיות חשוב מאוד למצוא את הדרך לא פולשנית להבחין ביציות "טובות" (כלומר, SN) מ" הרעים "אלה (כלומר, NSN) כדי להגדיל את ההצלחה של הפריה חוץ גופית ופיתוח עוברים פוטנציאליים שלאחר מכן. חוץ מזה, הבידוד והתרבות של ביציות SN מרקמת השחלה יכולים לשמש לשימור פוריות בנשים שעברו טיפולים בסרטן או סובלים מפתולוגיות השחלות.
על ידי ניצול תופעה טבעית זו, נתונים חשובים יכולים להיות מסופקים להבנת אופן טבעי הפסדי preimplantation עובר שמדבר לא רק למי שמעוניין בביולוגיה הבסיסית של פיתוח ביצית, אלא גם לרופאי הפריה חוץ גופית אדם ובעלי חיים.
ההשלכות של טכניקה זו לבריאות אדם, הביופוליטי של עוברים ורבייה של בעלי החיים הן משמעותיות 15. יכולת לזהות ולחסל ביציות "חיים עולים בקנה אחד" היהמאוד להעלות את הרמה האפקטיבית של טכניקות הפריה חוץ גופית, שמוביל לפתרונות חדשניים לצרכי קליניים מסופקים חשובים.
למעשה, של ביולוגים תא מין הקהילה המדעית הבינלאומית יכולה לתרום ללחפש השיפורים הקריטיים הדרושים כדי ליישם פרוטוקול זה להפריות חוץ-גופיות אנושיות. למרות שהפרוטוקול לא יכול להיות מיושם על בני אדם (מטעמי בטיחות ברורה), זה עדיין שומר קיבולת עצומה כדי לשפר את הידע של הקשר בין ארגון הכרומטין (כלומר, ארכיטקטורת הגנום) וביטוי גנים בשלבים הסופיים של התבגרות Antral , אחד הנושאים החמים ברבייה אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
