Summary
Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.
Introduction
Antrale volgroeide eicellen (GV, kiemblaasje) geïsoleerd uit de antrale compartiment van het ovarium worden routinematig gebruikt voor verschillende doeleinden zoals bijvoorbeeld het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen achter in vitro rijping tot metafase II stadium.
Ondanks hun mooie uiterlijk meest antral eicellen, maar niet alle, zijn in staat om de meiose te voltooien en bereiken de blastocyststadium; in feite, vele zoogdiersoorten, waaronder mensen 1,2, ongeveer 30% van hen arrestatie hun ontwikkeling op de 2-cel stadium, wanneer bevruchting plaatsvindt 3-5. Tot op heden zijn enkele parameters die worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de eicellen in staat om de embryonale ontwikkeling van die daartoe niet in staat te houden.
Bijvoorbeeld, cresyl blauw kleuring (BCB) is een valide methode om de oöcyten basis van de activiteit van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase sorteren, hoewel het nut van deze sorteermethode verband met BCB + of BCB- kleuringnog laboratorium afhankelijk 6-8.
Een andere bekende methode woont in hun chromatine organisatie: als gekleurd met elke DNA intercalerende kleurstoffen (zoals Hoechst33342), 70% van de antrale eicellen laten een dye-positieve ring rond de nucleolus en heten Omringd Nucleolus (SN), terwijl de resterende 30% tonen een gevlekte positieve signalen en heten niet omringd Nucleolus (NSN) 3-5. Recent toonden we aan dat het ontbreken van cytoplasma roosters 9 (CPLS belangrijke opslagplaatsen voor maternale mRNA en ribosomen in zowel zoogdieren eicellen en embryo's) 10 en de down-regulatie van MATER (essentieel voor CPLS vorming 11), samen met de aanwezigheid van vetdruppels in hun cytoplasma 9,12, kunnen andere oorzaken verband met de NSN eicellen onvermogen verder komt dan het 2-cel stadium.
Helaas kan paar technieken worden toegepast op antrale SN en NSN eicellen en sorteren,Daarom zou de ontwikkeling van een minder invasieve werkwijze (zonder nucleaire kleuring, fixatie of manipulatie met de mond pipetten) zeer belangrijk geworden om de tarieven van menselijke en dierlijke embryo ontwikkeling.
In dit artikel hebben we detail de eenvoudige en snelle protocol dat wordt gebruikt om ad soort SN en NSN antrale eicellen van vrouwelijke muizen te isoleren en het is gericht tot alle wetenschappers geïnteresseerd in de studie van de vrouwelijke gametogenese, eicel maturatie en embryo-ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de grondbeginselen van de Europese (EU-63/2010) en Italiaanse (26/2014) wetten ter bescherming van dieren gebruikt voor wetenschappelijk onderzoek. Cervicale dislocatie euthanasie wordt gebruikt voor de eierstokken isolatie en het wordt uitgevoerd door deskundige en getraind in het goedgekeurde protocol met betrekking tot dit onderzoek vermelde personen.
1. Dieren
- Onderhouden volwassen 3- tot 6-weken oude vrouwelijke muizen in een kamer met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid (met fasen van 12L: 12D en gevoed ad libitum).
- Injecteren muizen intraperitoneaal met 2,5 IE Pregnant Mare Serum gonadotropine (PMSG) om folliculaire groei te stimuleren door het nabootsen van het effect van follikel stimulerend hormoon (FSH). Isoleer de eierstokken voor antral eicellen verzameling 48u later. Euthanaseren de vrouwelijke muis die eerder geïnjecteerd met PMSG, volgens uw institutionele richtlijnen.
- Snel verwijdert de eierstokken van de lichaamsholte en plaats ze in de petrischaal containing M2 medium voor latere eicellen isolatie (zie paragraaf 3).
- Een insnijding op de huid die de buikwand gevolgd door een snede in het peritoneum door steriele dissectie scharen. Open de incisie de buik bloot, zet de darmen enerzijds met steriele pincet en lokaliseren van de eileiders, die een V-vorm vanuit de blaas.
- Let op de eierstokken onder de nieren gelegen. Houd elke buis met een steriele pincet en een kleine insnijding op de bodem van de eierstokken om hen vrij. Meng beide eierstokken op de bodem van een petrischaal die vooraf geëquilibreerd medium.
2. Hormoon Voorbereiding
- Verdunnen PMSG (verkrijgbaar in verschillende concentraties voorraad) met een steriele isotone zoutoplossing om een werkende concentratie van 2,5 IE hormoon per 0,1 ml te verkrijgen voor een passende injectie volume.
OPMERKING: Hormoon oplossingen dienen hoeveelheden verdeeld in 0,5 ml buisjes en opgeslagen bij -20 ° C tot de dag van gebruik. Houd niet verdunde hoeveelheden van meer dan drie maanden bij -20 ° C. Eenmaal ontdooid, als seriële injecties worden uitgevoerd, slaan de fracties van hormoon-oplossingen bij 4 ° C en gebruik ze binnen 4 dagen.
3. Antral Eicellen Isolatie
Voor een goede eicellen isolatie:
- Equilibreren M2 medium 13 (M2) bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende ten minste 1 uur voordat oöcyten isolatieprocedure. Bereid twee petrischalen (35 mm x 10 mm), een met 1 ml M2 ovarium perforatiepatroon en de tweede met kleine druppels (20 pl) van M2 bedekt met minerale olie (~ 1,5 ml) van oöcyten maakt u na isolatie van de ovarium (zie 3,4-3,6). Houd zowel petrischalen in de incubator bij 5% CO2 en 37 ° C tot klaar om te worden gebruikt.
- Gebruik een stereomicroscoop bij oöcyten isolatieprocedures.
- Bereid dunne mond glazen pipetten om de eicellen stretchfolie verzamelenhing glazen Pasteur pipetten horizontaal gehouden (die de uiteinden van de pipet met beide handen), over een verticale vlam uit de bunsenbrander (figuur 1).
- Zodra het glas begint te smelten, nemen de pipet uit de vlam en het uitvoeren van een snelle trekken beweging om de gewenste pipet te verkrijgen. Stevig knip het overtollige glas aan de smalle punt van de pipet met nagels aan de lengte en de diameter van de inwendige capillair passen. Controleer of de dunne capillaire een inwendige diameter van ~ 100 urn, iets groter dan de diameter van de eicel (~ 80 urn).
- Om mond pipet, sluit het ene uiteinde van de aspirator buis naar de getrokken pipet met behulp van een geschikte tip en plaats het andere uiteinde in de mond, het veiligstellen van het met de tanden.
- Verzamel de eierstokken met steriele pincet en deponeren op de bodem van een celkweek petrischaal (35 mm x 10 mm). Bedek ze met 1 ml M2 vooraf geëquilibreerd bij 37 ° Cen 5% CO 2 (Figuur 2).
- Voorzichtig doorboren het antrale follikels van de eierstokken met een insulinespuit steriele naald antrale eicellen release in M2 (figuur 3).
- Voorzichtig mond pipet oöcyten door een nauwe Pasteur pipet follikelcellen en andere mogelijke weefselafval (figuur 4A) verwijderen en regelen ze op de bodem van kleine druppeltjes (20 pl) van M2 bedekt met minerale olie geschikt voor embryokweek (voorheen bereid Figuur 4B).
Opmerking: Het is belangrijk om alle cumuluscellen bevestigd aan de zona pellucida van de oöcyten door continue pipetteren verwijderen door verscheidene en verschillende druppels M2. Voer deze stap zo snel mogelijk veranderingen in de pH van het medium te voorkomen.
4. Antral Eicellen kleuring met Hoechst33342
OPMERKING: Antral eicellen kunnen worden onderscheiden in SN (Omgeven Nucleolus), NSN (Niet Omringd Nucleolus) ofin andere tussenvorm vanuit hun chromatineorganisatie na kleuren met supravital concentratie Hoechst33342 (of andere merkers voor specifieke basen AT) 14. In feite, de oöcyten SN tonen een Hoechst-positieve ring rond de nucleolus terwijl de NSN niet, vandaar de naam.
Voor een goede eicellen vlekken:
- Breng de oöcyten met een mond pipet in druppels Hoechst33342 (20 ui) verdund in M2 bij supravital concentratie van 50 ng / pl gedurende 10 min in het donker.
- Na de incubatie met Hoechst33342, overbrengen elke afzonderlijke eicel met een mond pipet op de bodem van kleine druppels (5 pl) van M2 bedekt met minerale olie, voor het sorteren op basis van chromatine organisatie (SN of NSN). Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met Hoechst33342 filter (emissiegolflengte 486 nm) om het chromatine configuratie van de oöcyten te visualiseren.
Opmerking: Afhankelijk van het type fluorescentiemicroscoop gebruikt, it kan het noodzakelijk om glazen bodem petrischaal te gebruiken voor het verwerven geworden. De confocale microscopie Olympus FluoView Fv10i wanneer uitgerust met een specimen houder voor 35 mm schaal vereist slechts glazen bodem-gerechten voor het verwerven, met een 0,17 mm standaard dikte en een bereik 0,13-0,21 aanvaardbaar mm. - Prikkelen de oöcyten gedurende maximaal 5-10 sec, waarschijnlijk voldoende om de aanwezigheid of afwezigheid van een ring rond de nucleolus (figuur 5) te visualiseren.
- Na het sorteren cultuur antrale SN en NSN eicellen in M2 bij 5% CO2 en 37 ° C in vitro rijping induceren of houd ze in geschikte buffers voor moleculaire of cellulaire analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volgende foto's tonen de methode die wordt gebruikt om antrale eicellen te isoleren van de muis eierstokken, vanaf pipetten voorbereiding tot het sorteren van de eicellen 'door middel van Hoechst33342. Deze methode is heel eenvoudig en kan in een laboratorium met een CO2 incubator, een stereomicroscoop en een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filter voor de waarneming van de Hoechst33342 uitgevoerd Figuur 1 toont de eerste stap pipet preparaat. De glazen begint te smelten en zacht worden, moeten beide uiteinden van de pipet uit elkaar worden getrokken en, tegelijkertijd, moet de pipet worden genomen van de vlam. Alternatief kunnen glazen capillaire worden getrokken op dezelfde wijze of met behulp van een micropipet trekker zo goed gekalibreerd. Dit is een cruciale stap omdat het zeer belangrijk om de juiste mondpipet de juiste capillair diameter: als het te dun is, kan oöcyten gefragmenteerd in kleine capIllary en sterven binnen enkele minuten, als deze te groot, een goede afzuiging van het medium dat de eicellen kunnen verloren gaan als het verplaatsen van de eicellen, bijvoorbeeld van een druppel naar de andere. Figuren 2 en 3 tonen de mechanische isolatie van antrale oöcyten uit antrale follikels met behulp van een steriele naald insuline. Het is vrij gemakkelijk om deze follikels herkennen omdat ze worden gekenmerkt door een holte of antrum met een fluïdum, dat het medium waarin de granulosacellen en eicel worden gevonden en waardoor verschillende moleculen kunnen worden uitgewisseld en naar de externe omgeving. Eenmaal geïsoleerd antrale oöcyten worden overgedragen van één druppel naar de andere van M2 medium somatische cellen rondom de oöcyten te verwijderen, zoals getoond in Figuren 4A en B. Once "ontdaan", antrale eicellen klaar voor indeling. Figuur 5 toont de laatste stap van dit protocol, dat is de kleuring van de geïsoleerde antral eicellen met Hoechst33342 fof een snelle sortering op basis van hun chromatine organisatie. Deze marker vlekken levende cellen veel sneller dan DAPI, bijvoorbeeld, en worden gebruikt supravital concentraties (50 ng / ul) om cellevensvatbaarheid te behouden. Cel kleuring voor chromatine organisatie is waarschijnlijk de meest cruciale stap van dit protocol: als de eicellen zijn verheugd te lang kunnen ze beschadigd raken en onbruikbaar worden voor toekomstige essays. Kortom, indien toegepast op de muis oöcyten, is dit een eenvoudige methode die geen bijzondere voorzorgsmaatregelen (met uitzondering van de in het gedeelte methode) vereisen. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
Figuur 1. Voorbereiding van een mond pipet met behulp van glas Pasteur pipetten en een bunsenbrander. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.
Figuur 2. Intact eierstokken in petrischaal gevuld met voorverwarmde en in evenwicht M2 medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De aanvankelijke isolatie van antrale eicellen uit antrale follikels door middel van een steriele naald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Overdracht van de vers geïsoleerde oöcytenmet een mond pipet uit de petrischaal (A) naar een andere petrischaaltje met kleine druppels van voorverwarmde en in evenwicht M2medium (B) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Eicellen gekleurd en naargelang met Hoechst33342. Enkele beelden van NSN en SN eicellen genomen bij de confocale microscoop Olympus FluoView Fv10i (vergroting 60X; bar: 10 micrometer; PhC: fase contrast). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de methode die wordt gebruikt om te isoleren en te classificeren muis antral GV eicellen. Er zijn geen specifieke kritische stappen te onderstrepen, met enkele uitzonderingen. Ten eerste: deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om: a) behoud van de vitaliteit van de eicellen en b) voorkomen pH veranderingen in het gebruikte medium. Ten tweede: eicellen moeten kort worden opgewekt (5-10 sec) om Hoechst33342 chromatine schade en daaropvolgende dood van de oöcyten te voorkomen, vooral wanneer IVM en IVF de volgende stappen. Tot op heden is dit de snelste manier om SN en NSN muis antral eicellen afstand.
Hochest33342 is bewezen dat een efficiënte manier om SN en NSN oöcyten bij vrouwelijke muizen (en andere zoogdieren laboratoriummodellen) karakteriseren, maar het kan niet worden helaas gebruikt antrale eicellen bij de mens voor de vruchtbaarheid doeleinden sorteren.
Aangezien in vitro rijping van onrijpe eicellen routinematig gebruikt bij mensen ook het would zeer belangrijk om een niet-invasieve manier de "goede" eicellen (dat wil zeggen, SN) te onderscheiden van de "slechte" enen vinden (bijv NSN) het succes van in vitro fertilisatie en verdere toekomstige embryo ontwikkeling. Bovendien kan de isolatie en de cultuur van SN eicellen uit eierstokken weefsel worden gebruikt voor de vruchtbaarheid bewaring in vrouwen die behandelingen van kanker of die lijden aan eierstokkanker pathologieën.
Door het benutten van dit natuurverschijnsel, kon belangrijke gegevens worden verstrekt voor het begrip van nature voorkomende embryo pre-implantatie verliezen die spreekt niet alleen voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de fundamentele biologie van de eicel ontwikkeling, maar ook voor de menselijke en dierlijke IVF-artsen.
De implicaties van deze techniek voor de menselijke gezondheid, biopolitiek van embryo's en voortplanting van dieren zijn aanzienlijk 15. In staat zijn om "life-onverenigbaar" eicellen te identificeren en te elimineren zousterk verhogen het daadwerkelijke niveau van de IVF-technieken, wat leidt tot cutting-edge oplossingen voor belangrijke onvervulde medische behoeften.
In feite zou de internationale wetenschappelijke gemeenschap van gameten biologen bijdragen aan de kritische verbeteringen nodig zijn om dit protocol van toepassing op het menselijk IVF-procedures te vragen. Hoewel het protocol niet kan worden toegepast op de mens (voor duidelijke veiligheidsredenen), het nog steeds houdt een enorme capaciteit om de kennis van het verband tussen chromatine organisatie (dwz genoom architectuur) en genexpressie te verbeteren tijdens de laatste fase van antral rijping één van de hot topics in de menselijke voortplanting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A.
